Индуцированная циклофосфаном иммуносупрессия и ее коррекция иммуномодулятором микробного происхождения

В настоящее время цитостатические препараты широко используются в клинической практике: онкологии и трансплантологии, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Активное применение цитостатических препаратов приводит к развитию выраженных иммунодефицитов, поэтому изучение иммунологических нарушений и возможностей их коррекции является чрезвычайно актуальной проблемой. Одним из наиболее эффективных и широко применяемых цитостатиков является циклофосфан (ЦФ), который входит в различные схемы противоопухолевой химиотерапии, активно применяется в трансплантологии и клинике аутоиммунных заболеваний [Д.А. Вгос^ку е! а1, 2008; А.Е. гп et а1, 2011].

Модель индуцированного ЦФ иммунодефицита является наиболее адекватной для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков. Детальное понимание воздействия препарата на различные субпопуляции клеток и сроки их восстановления при различных режимах введения цитостатиков представляет как практический, так и теоретический интерес. Особое значение данная модель иммунодефицита приобретает при изучении действия иммуномодуляторов в иммуносупрессированном организме, что наблюдается в клинической практике при терапии цитостатиками.

В единичных исследованиях показана способность иммуномодуляторов различной природы восстанавливать количественный и субпопуляционный состав клеток в лимфоидных органах после действия цитостатиков [Е.А.Лебединская с соавт., 2009]. В литературе обсуждаются возможности применения препарата полиоксидоний для коррекции индуцированных иммунодефицитов, а также приводятся данные о применении вакцины БЦЖ для коррекции иммунологических нарушений [М. ВаЬ]ик е1 а1., 2011]. Однако многообразие иммуномодулирующих агентов лишь затрудняет задачу выбора оптимальных методов иммунокоррекции. Следует отметить, что нарушения иммунного статуса, вызванные применением цитостатиков, существенно повышают риск развития инфекционных осложнений, вызываемых условно-патогенными антибиотикоустойчивыми микроорганизмами [ХУ.8ог^ е1 а1., 2009]. Поэтому для оптимальной иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов, вызванных цитостатиками, предпочтительны иммуномодуляторы, обладающие способностью стимулировать противоинфекционную резистентность организма [А. Сиз1: оую е1 а1., 2009]. К таким препаратам относится бактериальная поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4® (ВП-4), содержащая в своем составе агонисты толл-подобных рецепторов, являющаяся активатором систем врожденного и адаптивного иммунитета против основных возбудителей внутрибольничных инфекций. Экспериментальные исследования показали, что ВП-4 обладает также противоопухолевой и антиметастатической активностью [Н.К. Ахматова и соавт., 2005]. В связи с выше сказанным целесообразна разработка модели стойкой иммуносупрессии для изучения особенностей механизма иммунологических нарушений при действии цитостатиков и дальнейшей оценки иммунокорригирующего действия иммуномодуляторов.

Цель. Выявление основных параметров иммуносупрессии, индуцированной циклофосфаном, и оценка эффективности иммунокорригирующего действия ВГТ-4 на фоне действия цитостатика.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности фармакокинетики циклофосфана при различных схемах введения для обоснования выбора оптимального режима стойкой индуцированной иммуносупрессии.

2. Исследовать морфологические изменения в органах гемоиммунопоэза при введении циклофосфана и возможность их коррекции с помощью ВП-4.

3. Оценить влияние ВП-4 на миелосупрессию, вызванную циклофосфаном.

4. Исследовать влияние индуцированной иммуносупрессии на продукцию цитокинов, иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей после введения циклофосфана и влияние на эти показатели ВП-4.

5. Изучить влияние ВП-4 на противоопухолевую активность циклофосфана.

Научная новизна.

Получены новые данные, характеризующие параметры индуцированной ЦФ иммуносупрессии при трехкратном (с интервалом в 72 часа) введении цитостатика в дозе 100 мг/кг веса тела животных:

— морфологические изменения органов иммуногенеза: в красном костном мозге, а также в корковом и мозговом веществе тимуса и селезенки увеличивается количество эритроцитов, уменьшается количество дифференцирующихся клеток эритроидного ряда, резко снижается содержание молодых и зрелых форм лейкоцитов, нарушается строма органа и её сосудистая сеть;

— в периферической крови мышей отмечается выраженная лейкопения продолжительностью более 10 суток, с наименьшим.

3 3 количеством лейкоцитов на 8−9 сутки ((3,7−1,7)х10 в мм), повышение сегментоядерных лейкоцитов, некоторое снижение лимфоцитовопределено существенное снижение продукции ИЛ-1Р, увеличение уровня супрессорного цитокина ТФР-Р, кратковременное уменьшение ИЛ-12 и транзиторное повышение ИЛ-6 и ИНФ-у;

— снижено число клеток, экспрессирующих дифференцировочныеСВЗ+, СТ)4+, СБ19+, БХ5+ (ЫК), СБ4+/С025+ маркеры при уменьшении цитотоксической активности 1ЧК-клеток.

Впервые исследовано влияние ВП-4 на фармакокинетику ЦФ. Показано, что введение иммуномодулятора через 72 после воздействия цитостатика не влияет на процессы биораспределения и токсические свойства активных метаболитов ЦФ.

Впервые выявлено, что агонист толл-подобных рецепторов ВП-4 при введении мышам с индуцированной ЦФ иммуносупрессией обладает способностью корригировать нарушения в органах иммуногенеза и иммунологические показатели:

— нормализует структуру красного костного мозга, тимуса и селезенки мышей, нормализует процессы иммуногенеза с появлением молодых клеток эритроидного, миелоидного и лимфоидного рядов, нормализует соотношение форменных элементов периферической крови;

— активирует процесс миелопоэза, что проявляется в появлении моноцитов и бластных форм клеток в периферической крови мышей;

— вызывает кратковременное снижение в сыворотке ИЛ-1Р, повышает содержание цитокинов ТЫ (ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-у), ТЬ2 (ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-10) и снижает продукцию супрессорного цитокина ТФР-р спленноцитами мышей, восстанавливает экспрессию маркеров лимфоцитов СБЗ+, СБ4+, С019+, СБ4+/СБ25+, повышает активность Ж-клеток на фоне снижения числа клеток, экспрессирующих молекулы БХ5+ (Ж) и СБЗ+ЛЖ5+ (№СТ);

— усиливает противоопухолевую активность ЦФ в отношении плазмоцитомы МОРС-21 в эксперименте на мышах.

Впервые дано экспериментальное обоснование возможности использования ВП-4 для иммунокоррекции нарушений, обусловленных индуцированной цитостатиками иммуносупрессией.

Практическая значимость.

Установлено, что для достижения иммунокорригирующего эффекта ВП-4 следует вводить не ранее, чем через 72 часа после последнего введения ЦФ.

Полученные данные обосновывают целесообразность дальнейшего изучения иммунокорригирующего действия ВП-4 для коррекции индуцированной иммуносупрессии, вызванной цитостатиками.

Материалы диссертационной работы включены в научно-экспериментальную работу лаборатории терапевтических вакцин НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН. Результаты исследований используются в циклах лекций курса «Вакцинопрофилактика» и курса «Иммуноонкология» 1-ого МГМУ им. И. М. Сеченова.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана модель индуцированной ЦФ стойкой иммуносупрессии при трехкратном введении ЦФ в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 ч, при которой выявлены морфологические нарушения структуры и функции органов иммуногенеза и выраженные иммунологические нарушения в организме мышей.

2. Применение ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии приводит к нормализации структуры и функции органов иммуногенеза и восстанавливает иммунологические показатели.

3.

Введение

ВП-4 после введения ЦФ усиливает противоопухолевое действие в отношении плазмоцитомы МОРС-21 у мышей.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены: на X Всероссийском научном Форуме, 29 мая-1 июня, 2006, г. Санкт-Петербургна VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27−29 июня 2007, г. Москвана XI Всероссийском научном Форуме, 28−31 мая 2007, г. Санкт-Петербургна Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 26 ноября — 4 декабря 2008, г. Пекинна VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», 27−29 октября 2010, г. Москвана Первом конгрессе Евро-Азиатского общества по инфекционным болезням 1−3 декабря 2010, г. Санкт-Петербургна Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» 21−22 декабря 2010, г. Санкт-Петербургна IX Международной германо-российской научно-практической конференции Форума им. Р. Коха и И. И. Мечникова «Инновации и сотрудничество в медицине и здравоохранении» 8−9 декабря 2010, г. Новосибирскна конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН 15−16 марта 2011 г (2-е призовое место), г. Москвана XVII Россиийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 11−15 апреля 2011, г. МоскваАпробация диссертации состоялась на конференции отдела иммунологии НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН, 18 апреля 2011, г. Москва.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 9 в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Материалы работы изложены на 141 странице компьютерного текста и состоят из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы», «результаты исследований», обсуждения, выводов, списка литературы — 238 источников (23 отечественных и 215 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 6 таблицами, 31 рисунком.

1. Обзор литературы.

Иммунодефицитные состояния в онкологии.

Иммунодефицитные состояния являются актуальной проблемой современной медицины [27, 40, 49, 58, 74, 87, 88, 106, 108, 115, 122, 124, 130, 167, 182, 221, 230]. Распространенность иммунодефицитов ежегодно растет. В мире, по данным ВОЗ, число ВИЧ инфицированных пациентов составляет более 40 миллионов человек, из которых ежегодно погибает более 2 миллионов больных. Отмечена взаимосвязь между наличием иммунодефицитов и развитием опухолей [54]. Распространенность онкологических заболеваний в России в 2009 году составила 3587,5 на 100 000 населенияв России в 2009 году было более 5 миллионов больных онкологическими заболеваниями. По данным минздравсоцразвития, патология иммунной системы имеет место почти у 2 миллионов человек.

С учетом высокой распространенности патологии иммунной системы, в литературе широко обсуждаются вопросы диагностики иммунодефицитов и рассматриваются возможные маркеры иммунодефицитных состояний, которые позволили бы определять степень выраженности иммунодефицита и прогноз пациента [20, 69, 126, 128, 174, 189, 229, 235]. Иммунодефицит как неадекватный ответ иммунной системы на действие факторов внешней и внутренней среды приводит к развитию комплекса заболеваний, в том числе инфекционных процессов, онкологических заболеваний. Ключом для создания эффективных методов лечения и профилактики иммунодефицитных состояний в таком случае является ответ на вопрос, какие факторы оказывают влияние на развитие патологического процесса, каковы механизмы развития иммунных нарушений. Многообразие патологических состояний иммунной системы указывает на разнообразие факторов, участвующих в процессе регуляции ее нормальной деятельности.

Описание распространенных патологий и редких заболеваний проливает свет на нормальную и патологическую работу иммунной системы. Наличие врожденных и приобретенных иммунодефицитов позволяет лучше понять тонкие механизмы регуляции иммунного ответа на клеточном и генетическом уровне. Становится очевидным, что неадекватные иммунные реакции можно рассматривать как нарушение тонкого взаимодействия клеточных субпопуляций и их медиаторов между собой.

Старение человека и животных также сопровождается развитием иммунодефицита клеточного звена иммунитета [86], [205]. Увеличение частоты опухолевых заболеваний всех локализаций у пожилых людей может являться доказательством существованием связи между иммунодефицитом и онкологическими заболеваниями [206] [90, 138] [48] [209] [217].

Следует отметить, что среди исследователей нет единого мнения о наличии связи между нарушением иммунного статуса организма и наличием опухоли. Наличие такой закономерности между изъяном в иммунном статусе и ростом опухоли без сомнения могло стать ценной находкой, которую можно было бы использовать для диагностики опухолевого процесса. Так, при раке молочной железы, меланоме вообще не отмечается никаких изменений в иммунитете больных. В то же время при плоскоклеточном раке легкого и других отделов дыхательной системы, опухолях головы и шеи, раке шейки матки исследователи говорят о супрессии иммунной системы, которая предшествовала онкологическому заболеванию.

Согласно современным представлениям, иммунная система участвует в регуляции клеточного гомеостаза организма. Рост опухоли в этом случае может наблюдаться на фоне развития иммунодефицитных состояний. Иммунная система по каким-то причинам не препятствует клеточной пролиферации, что приводит к возникновению в организме опухолевого массива клеток [168]. Причины отсутствия иммунного ответа на опухоль ассоциированные антигены до конца не изучены. Обсуждается роль большого количества факторов, например: факторы, которые выделяет опухоль, чтобы подавить иммунный ответопухоль-ассоциированные лимфоциты, содержащие супрессорную СВ4+СБ25+РохрЗ+субпопуляциюфакторы сыворотки крови, в присутствии которых наблюдается блокирование цитотоксических иммунных реакций лимфоцитов против опухолевых клеток.

Сывороточные факторы получили название — блокирующие антитела [162] [200, 224] [218] [103] [226], [109], [60], [201], [90, 138], [117], [93], [36] [100]. Это название не совсем точное, так как не удалось доказать, что данные сывороточные факторы являются антителами. Полученные данные позволяют утверждать, что это молекулы белковой природы, так как разрушаются трипсином с молекулярным весом выше 6 кДа. Тем не менее, их роль в развитии иммуносупрессии была неоднократно подтверждена в экспериментах на животных [109].

В настоящее время в сыворотке крови онкологических больных определяются циркулирующие опухоль-ассоциированные антигены [[41], [139], [156]]. Некоторые из этих антигенов используются для диагностики и мониторинга онкологических заболеваний в процессе лечения пациентов. Функциональное значение этих антигенов в процессе роста опухоли или в иммуносупрессии остается неизвестным.

Развитию опухоли может способствовать не только отсутствие активной цитотоксической реакции иммунных клеток, но и способность иммунных клеток ускорять рост опухоли в организме. Подобное предположение основано на том факте, что все опухоли инфильтрированы опухоль-ассоциированными лимфоцитами [226] [32] [178] [225]. Для таких лимфоцитов характерны: слабый пролиферативный ответ на митогены и незначительная исходная цитотоксичность против аутологичных опухолевых клеток. Эти признаки также могут являться показателями нарушения функциональной активности иммунокомпетентных клеток.

В 60−80 годы прошлого столетия было показано иммуносупрессивное воздействие иммунных комплексов сыворотки крови онкологических больных на Т-клеточное звено иммунитета и сформулировано антагонистическое представление о влиянии Тклеточного и В-клеточного звеньев иммунитета на рост опухоли [103]. Считается, что активация В-клеток приводит к ускорению роста опухоли и торможению Т-клеточной противоопухолевой активности.

Комплекс антиген-антитело связывается с поверхностным ¥-с рецептором моноцитов и других Бс презентирующих клеток. Такое связывание комплекса с рецептором вызывает активацию клеток, которые в ответ синтезируют простагландины и простоциклины [99], [207]. Эти биологические активные вещества подавляют функциональную активность Т-клеточного звена иммунитета. Поэтому комплекс антиген-антитело можно рассматривать как важное звено в патогенезе индуцируемой иммунитетом иммуносупрессии и уклонения опухоли от иммунного надзора [162]. В литературе описана роль активированных моноцитов или макрофагов в продукции простагландинов и в развитии иммуносупрессии [99], [207]. Ингибирование синтеза простагландинов нестероидным противовоспалительным препаратом индометацином приводит к увеличению средней продолжительности жизни мышей опухоленосителей.

Взаимодействие опухоли и организма сопровождается синтезом и взаимодействием многих факторов с участием Т-клеток и реактивных моноцитов. Синтез некоторых неспецифических иммуносупрессивных факторов можно подавить, что приводит к увеличению продолжительности жизни животных-опухоленосителей, что указывает на перспективность иммунокоррекции для лечения онкологических заболеваний.

Ключевым звеном в индуцировании опухолей у мышей является супрессия Т-лимфоцитов [[80], [125]]. В частности, иммуносупрессия, вызванная ультрафиолетовым облучением, приводит к возникновению меланом у мышей [[184], [219]]. В этой мышиной модели прогрессия опухоли наблюдается на фоне возрастания супрессорной активности Т-клеток. Подавление супрессорной активности Т-клеток любым из следующих используемых методов: облучение с последующей трансплантацией клеток костного мозга, введение ЦФ или облучение до перевивки опухоли или инфузия Т-клеток, приводит к регрессии опухоли.

Было бы неверно утверждать, что только Т-клеточное звено иммунитета участвует в иммунных реакциях при росте опухоли в организме. Имеются доказательства участия в этом процессе В-клеточного звена. Были описаны антитела против опухоль-ассоцированых антигенов и комплексы антиген-антитело в сыворотке крови и в почечных клубочках онкологических больных [24], [162], [170], [179], 192]http://wvw.sciencedirect.com/science? ob=ArticleURL& udi=B6W7N-48 4078H-1 &user=6 451 018&co verDate=08%2F31%2F2003&alid=l 193 549 701 &rdoc=l &fmt =high&orig=search&cdi=6631 &sort=r&docanchor=&view=c&ct=6& acct=C00006 9879&vers io n= 1 &ur 1 Vcrsio n=%20, [224]. Описаны единичные эксперименты, когда индуцирование антительного ответа против опухоль-ассоциированного антигена приводило к торможению роста карциномы яичника мышей. Клинические исследования клеточного и гуморального ответов на опухоль также позволили идентифицировать как серологические, так и Т-клеточные антигены опухолей человека. К этим антигенам были получены моноклональные антитела, некоторые из которых используются для диагностики онкологических заболеваний [129], [180], [157]. Активное использование этих технологий в настоящее время связано с серией неудач, так как опухолевые антигены представлены на нормальных клетках организма, и терапия имеет непродолжительный клинический эффект [48], [209].

Другим механизмом уклонения опухоли от иммунологического надзора является переключение типов иммунного ответа с ТН1 на ТН2 клеточный ответ. Подобный дисбаланс сопровождается развитием анергии и уменьшением цитолитической активности Т-клеток и может опосредоваться через продукцию супрессорного цитокина ИЛ-10[148].

Среди метаболических нарушений некоторые исследователи выделяют нарушения, которые связаны с недостатком цинка. Цинк крайне важен для нормального функционирования клеточного звена иммунной системы [104] [98]. В тимусе цинк образует комплекс с тимулином, который дальше функционирует как гормон тимуса в формировании клеточного звена иммунитета и в усилении реакции клеток на ИЛ. Отсутствие или недостаток цинка приводит к атрофии тимуса, Т-клеточной лимфоцитопении и СПИД-подобному заболеванию. Цинк дефицитные состояния часто встречаются при плоскоклеточных раках и онкологических заболеваниях дыхательной и пищеварительной систем [53]. У пациентов с плоскоклеточным раком чаще всего отмечаются нарушения в клеточном звене иммунитета с клеточной анергией и дисфункцией лимфоцитов. Нельзя сказать, какие изменения носят первичный характер: изменение метаболизма или недостаток цинка, так как никаких специальных исследований в этом направлении не проводилось [53], [104]. При опухолях других локализаций подобные изменения в иммунной системе не отмечаются или отмечаются лишь после химиотерапии или при опухолях значительного размера, на фоне развития кахексии у пациентов [53], [75], [98]].

Опухоль выделяет факторы, способные влиять на функционирование иммунной системы. Трансформирующий фактор роста опухоли Р (ТФР-р) был идентифицирован в среде инкубации клеточных линий глиобластомы, рабдомиосаркомы, линий клеток рака эндометрия, молочной железы, колоректального рака и аденокарциномы [203]. ТФР-р обладает супрессивным действием на лимфоциты и моноциты человека и экспериментальных животных [147], [197].

Простагландины (ПГ), в частности, ПГЕ2, по мнению исследователей, можно отнести к иммуносупрессивным агентам, которые секретирует опухоль [[116], [99], [207]]. ПГЕ2 является мощным супрессором Т-лимфоцитов, ингибируя их пролиферацию, секреторную и цитотоксическую активность.

Колоний-стимулирующие факторы также обладают иммуносупрессорным действием на иммунокомпетентные клетки. Они были выделены не только из среды инкубации многих опухолевых линий, но также определены в сыворотке крови онкологических больных [107], [173], [214] [232]. Разнообразные ИЛ (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-а) также определяются в среде инкубации клеточных опухолевых линий [103] [175].

Развитие опухолей часто происходит на фоне нарушений нормальной работы иммунной системы под действием вирусов [215, 237]. Для некоторых заболеваний определен вирус, провоцирующий развитие опухолевого процесса, например, вирус герпеса у, вирус герпеса человека-8 (ВГЧ-8). По некоторым данным, вирусами вызвано до 20% всех онкологических заболеваний, развивающихся в мире [188]. Известно, что вирусы, вызывающие развитие опухолей, активизируются на фоне недостаточной активности иммунной системы, в частности, вирус Эпштейн-Барр, вирус папилломы человека, цитомегаловирус [149, 215]. Наличие вируса папилломы человека существенно повышает риск развития рака шейки матки [97].

У онкологических больных множество факторов оказывает супрессивное действие на иммунную систему: опухолевый процесс (особенно, Ви Тклеточные гемобластозы), химиотерапевтические агенты и кортикостероиды. Вероятно, совокупность факторов позволяет опухоли уклоняться от иммунного надзора. При этом неконтролируемая пролиферация может наблюдаться даже для иммунокомпетентных клеток — Ти В-лимфоцитов, что характерно для лейкозов и лимфом.

Опухолевые клетки обладают способностью вырабатывать разнообразные иммуномодуляторы. Можно только предполагать, что иммуносупрессорные факторы подавляют иммунный ответ организма хозяина против опухоли, тогда как иммуностимулирующие факторы способствуют опухолевой прогрессии и формируют анергию Т-клеток. Эти данные о факторах, которые синтезируются опухолью, важно учитывать при разработке подходов к лечению иммунодефицитных состояний в организме-опухоленосителе.

Иммуносупрессия на фоне проводимого лечения.

При лечении злокачественных новообразований супрессивное действие на иммунную систему больных оказывают множество факторов, включая сам опухолевый процесс, химиотерапевтические препараты и кортикостероиды, что приводит к развитию иммунологических нарушений [133]. Хирургическое удаление опухоли проходит на фоне анестезии, которая, наряду с операционной травмой, вызывает супрессию клеточного звена иммунитета продолжительностью до 3 недель [72]. Радиотерапия также вызывает супрессию клеточного звена иммунитета, которая выражается в прогрессивном снижении С04>СБ8 Т-клеток, которое не восстанавливается даже в течение месяца наблюдения [220]. В связи с вышесказанным данной категории больных может быть показана иммунокорригирующая терапия [102, 121, 123, 142].

Многие химиотерапевтические агенты обладают миелосупрессивным действием, ингибируя продукцию форменных элементов крови в костном мозге. Иммунодепрессия проявляется ослаблением иммунного ответа из-за уменьшения количества Ви Т — лимфоцитов, а также снижением содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов даже при нормальном абсолютном количестве лимфоидных клеток. На фоне индуцированной химиопрепаратами иммуносупрессии происходит истощение Т-лимфоцитов [83, 84]. Химиотерапия, несмотря на использование стандартных схем, является все же индивидуальным методом лечения. Каждое последующее введение цитостатика осуществляется с учетом реакции пациента на предыдущее введение. Реакция иммунной системы больных на химиотерапию является во многом индивидуальной. В экспериментах на животных было показано, что увеличение продолжительности жизни после химитерапии наблюдается только в том случае, если химиотерапия отменяет опухоль-ассоциированную иммуносупрессию [145].

Химиотерапия — «обоюдоострый меч», вызывающий наряду с цитостатической эффективностью выраженные иммунодепрессивные эффекты [191]. Исследования показали, что химиотерапевтические препараты подавляют пролиферативную активность лимфоцитов, и этот эффект имеет дозозависимый характер. Многие химиотерапевтические агенты обладают миелосупрессивным действием, ингибируя продукцию клеток крови костного мозга и тромбоцитов и приводя к абсолютному снижению числа форменных элементов крови. Эффект миелосупрессии, вызванный химиотерапией, проявляется нейтропенией, которая у онкологических больных является одной из причин развития бактериальной инфекции [133] [47].

После химиотерапии наблюдается выраженное истощение В-лимфоцитов и, как следствие, снижение уровней иммуноглобулинов [133, 134]. Одна из главных особенностей индуцированной химиотерапией иммунодепрессии — длительное угнетение Т-клеточного звена. Было показано, что снижение CD4+ Т клеток отмечалось в течение 5 лет после химиотерапии [37].

При действии цитостатиков CD8+ Т-лифоциты восстанавливаются с помощью тимус-независимого механизма значительно быстрее, чем CD4+ Т клетки, хотя количество СБ8+Т-клеток после химиотерапии существенно снижается [135]. Относительно быстрое увеличение в периферической крови СБ8+Т-клеток после химиотерапии, возможно, не восстанавливает нормальную функцию этого типа клеток [133, 134]. Большая часть восстановленных CDS+T-клеток имеет тенденцию к снижению экспрессии ко-стимулирующих молекул CD28. Экспрессия CD28 на CD8+Т-клетках не восстанавливается в течение года после прекращения химиотерапии. Для объяснения иммунодепрессивного эффекта химиотерапевтических агентов были предложены два механизма. Первый — классический миелотоксический эффект цитостатических препаратов на гемопоэтические клетки-предшественники костного мозга. Также было показано, что тимоциты и активированные лимфоциты подвергаются апоптозу при воздействии цитостатиков [183]. Следовательно, второй механизм иммунодепрессии, вызванной цитостатиками, обусловлен гибелью не только клеток-предшественников, но и разрушением зрелых форм лимфоцитов.

Вследствие химиотерапии отмечается тенденция к снижению количества НК и их цитостатической активности, хотя восстановление.

НК происходит быстрее, чем других подтипов лимфоцитов — их цитостатическая активность восстанавливается относительно быстро [43, 153, 159], [132], [211] [28, 159] [39]. НК оказывают противоопухолевое действие, и восстановление их киллерных свойств может оказывать влияние на течение опухолевого процесса [79, 228], [225], [50].

Таким образом, за развитие иммунодефицитных состояний могут быть ответственны не только различные субопуляции Т-клеток и В-клеток, но и биологически активные вещества, оказывающие влияние на клетки иммунной системыдаже клетки соединительной ткани, хемокины и рецепторы к ним также могут обуславливать развитие патологического иммунного ответа.

Коррекция XT-индуцированной иммуносупрессии.

Поскольку интенсивные химиотерапевтические режимы могут вызвать глубокую иммунодепрессию, необходимы терапевтические стратегии, направленные на восстановления функции иммунной системы. В настоящее время иммунотерапия опухолей применяется в клинике в сочетании с другими способами лечения, а также широко проводятся экспериментальные исследования в этом направлении. Однако стандартные режимы, направленные на коррекцию опухоль-ассоциированной иммуносупрессии, до настоящего времени не разработаны.

Подходов к иммунотерапии опухоль-ассоциированной иммуносупрессии существует много. Основными являются следующие: применение ИЛ-2, ИЛ-7, JIAK-терапии, трансфекция генов ГКГС, цитокинов, применение гормонов тимуса и других иммуномодуляторов, применение гуманизированных моноклональных антител, плазмофорез, использование активированных дендритных клеток, генно-инженерных методов, методов переключения ответа с ТН2 на ТН1 тип. Одним из наиболее перспективных и наиболее современных способов иммунотерапии опухолей является воздействие на систему врожденного иммунитета с помощью агонистов и антагонистов ТПР.

В существующих подходах применяются различные цитокины, чаще всего — колоние-стимулирующие факторы GM-CSF и G-CSF, сокращающие длительность нейтропении, но при этом не влияющие на продолжительность жизни больных [26, 161]. Клинические рекомендации Американского общества клинических онкологов по применению колоние-стимулирующих факторов, основанные на клинических исследованиях, показывают, что эти цитокины стимулируют нейтропоэз [119].

Исследования продемонстрировали положительное действие цитокинов, используемое для коррекции нарушений иммунной системы: сочетание ИЛ-2 с G-CSF не только нормализовывает число нейтрофилов, но и повышает количество и активность эффекторов противоопухолевого иммунитета — НК и Т-лимфоцитов [195].

Продолжаются попытки по применению ИЛ-2 у онкологических больных для коррекции клеточного иммунитета. В настоящее время с этой целью используются рекомбинантный ИЛ-2. В частности, высокодозная терапия этим цитокином дает 20% ремиссий у больных раком почки и меланомой [59]. Терапия ИЛ-2 помогает преодолевать in vivo анергию Т-клеток для их воздействия на опухоль-ассоцированные лимфоциты. Возможно, перспективными окажутся работы с использованием ИЛ-7.

Введение

этого цитокина активирует Т-лимфопоэз у экспериментальных животных и человека [127] [113] [96], [95], [136] .

Онкологическая иммунология указывает на перспективность использования Т-клеточно-опосредованной цитотоксичности и реакции кожной гиперчувствительности замедленного типа для оценки устойчивости организма хозяина против опухоли [46], [48, 103, 104, 226]. В настоящее время изучают механизмы переключения ТН1-ТН2 типов иммунного ответа, как ключевого звена противоопухолевого иммунитета [56, 154]. Иммунный ответ по ТН1 типу является необходимым для развития гиперчувствительности против опухоли. При этом типе иммунного ответа в качестве промоторов выступают ИЛ-12, ИЛ-2 и ИФН-у, а антагонистами являются ИЛ-4 и ИЛ-10, продуцируемые ТН2 клетками. Активация Т-клеток является необходимой для появления опухоль-чувствительных Т-клеток (С08+ цитолитических Т-клеток), с участием молекул МНС I типа на поверхности антиген презентирующих клеток и других ко-стимулирующих молекул. В этом случае ТН1 клетки являются триггерами для запуска эффекторных реакций.

Усилить цитотоксичность опухоль-ассоциированных лимфоцитов можно с помощью ИЛ-2. ИЛ-2 усиливает пролиферацию опухоль-ассоциированных лимфоцитов, которые получили название ЛАК-клетки (лимфокин активированные клетки). ЛАК клетки обладают гораздо более высокой эффективностью против как ауто-, так и гетерологичных опухолевых клеток. Появление такой противоопухолевой активности после стимуляции опухоль-ассоциированных лимфоцитов ИЛ-2 является одним из ярких примеров использования иммунокоррекции для лечения онкологических заболеваний. Этот пример является важным, так как исходно в эксперименте показано, что лимфоциты, которые получены от животных с опухолью и введены интактным мышам, ускоряют рост опухоли. Поэтому в случае ЛАК можно утверждать, что иммуномодуляторы могут помогать Т-клеткам преодолевать анергию, индуцированную опухолью. По мнению некоторых авторов, именно способность опухоли вызывать у Т-клеток анергию является основной причиной как самого опухоль-индуцированного иммунодефицита, так и причиной роста опухоли [227], [103].

Одним из подходов к повышению эффективности противоопухолевой терапии может служить расширение показаний для ЛАК терапии. В настоящее время ЛАК терапия используется только на фоне распространенного опухолевого процесса. Эффект от цитолитической активности в данных условиях весьма скромный, так как невозможно добиться в этих условиях оптимального соотношения клетка-эффектор: опухолевая клетка как 5:1. Если проводить ЛАК терапию после массивного циторедуктивного лечения, когда зачастую остаточное опухолевое образование вообще не определяется, то такое эффективное соотношение между клетками эффекторами и опухолевыми клетками достижимо. Определенный интерес представляет иммунотерапия, при которой ЛАК клетки применяются в комбинации с.

ДК.

Дендритные клетки (ДК) представляют собой профессиональные антиген представляющие клетки (АПК), обладающие уникальной способностью индуцировать первичный иммунный ответ [163]. ДК играют важную роль в инициации и регулировке иммунных реакций, направленных против вирусов, бактерий и других патогенов. ДК могут созревать в присутствие бактериальных факторов, в частности ЛПС, и способны активировать НК — ведущие эффекторы врожденного противоопухолевого и противовирусного иммунитета [89] [181]. [164]. Таким образом, разработка и внедрение в клиническую практику противоопухолевых вакцин на основе дендритных клеток можно считать перспективным.

Для изготовления противоопухолевой вакцины инкубируют незрелые ДК с опухолевыми антигенами в присутствии факторов, ведущих к созреванию ДК [76]. Исследование на мышах показало, что лишь иммунизация полностью зрелыми ДК, нагруженными опухолевым антигеном, эффективно защищает при заражении низкоиммуногенной опухолью.

Было показано, что введение мышам незрелых ДК, нагруженных антигеном, не только не вызывает эффективного иммунного ответа, а наоборот способствует подавлению или препятствует развитию иммунного ответа [66]. Предполагается, что данный подход может оказаться перспективным направлением лечения аутоиммунных заболеваний и предотвращения отторжения трансплантированных органов.

Использование ДК для лечения онкологических заболеваний стало особо привлекательным после обнаружения ряда опухоль ассоциированных антигенов (ОАА) [166]. К ОАА следует отнести, во-первых, антигены онкогенных вирусов (карцинома печени — вирусы гепатита В и С, рак шейки матки — вирус папилломы, лимфома Беркитта — вирус Эпштейна-Барр), во-вторых, измененные белки, возникшие в результате соматических мутаций, в-третьих, не экспрессируемые в соматических тканях взрослого организма антигены (а-фетопротеин, теломераза), в-четвертых, нормальные антигены, гиперэкспессируемые опухолью (антигены меланомы и рака простаты). В настоящее время считается, что многие опухоли экспрессируют антигены, в той или иной степени распознаваемые иммунной системой [92]. ДК, обработанные опухолевым антигеном в присутствии факторов, повышающих его иммуногенность, например, ФНО-аИЛ-1[3- CD40LЛПС, способны эффективно презентировать антиген и вызывать развитие Т-клеточного иммунного ответа на него, что было показано in vitro, в экспериментах на животных и в опытах на здоровых добровольцах [158].

Предполагалось, что опухоли в своей основной массе теряют детерминанты I и II класса главного комплекса гистосовместимости МНС [177], [42], [144], [59], [210]. Потеря детерминант I класса автоматически делала невозможным генерирование МНС-зависимых цитолитических Т-клеток и их активацию [209]. Несмотря на потерю или низкий уровень детерминант I класса гистосовместимости, Т-клеточный цитотоксический ответ для аутологичных опухолей был показан для плоскоклеточного рака головы и шеи и аденокарциномы молочной железы. В лимфатических узлах онкологических больных обычно наблюдается интрасинусоидальное накопление крупных гистиоцитов. Такое явление получило название «синусная гиперплазия» или «синусный гистиоцитоз». Было показано, что синусные гистиоциты нагружены опухолевым антигеном. Эффективная иммунотерапия приводит к исчезновению данного явления. Эти клетки при этом не могут функционировать как антиген презентирующие клетки [220]. Были предприняты попытки, используя ДК, пульсированные пептидами мембранного антигена рака простаты, провести иммунотерапию пациентов. Подобная иммунотерапия оказалась эффективной у 15% больных [[208]]. Использование для усиления презентации антигена белков теплового шока принципиально не увеличило эффективность дендритных вакцин [[198]].

К данному моменту времени был проведен ряд клинических испытаний противоопухолевых вакцин на основе ДК. В ряде случаев наблюдался положительный клинический эффект. Это обнадеживает, так как испытания проводились исключительно на больных с распространенной формой заболевания после неудачного использования традиционных методов терапии. Очевидно, гораздо более эффективным данный способ лечения может оказаться для продления безрецидивного периода жизни онкологических больных после максимальной циторедукции хирургическим путем и/или при помощи химиотерапии [111] [213].

Другим подходом к терапии опухолей на основе активации системы врожденного иммунитета служит использование агонистов и антагонистов ТПР. Интересным фактом являются накопленные в последние годы данные, согласно которым активация различных ТПР по разному воздействует на опухолевый рост. Этим объясняется предположение о перспективе применения в онкологии как агонистов, так и антагонистов ТПР.

Лиганды ТПРЗ, а также моноклональные антитела или их фрагменты к ТПР-3 индуцируют продукцию интерферонов I типа [67] [63]. Лиганды этого рецептора эффективны преимущественно при опухолях с повышенной экспрессией ТПРЗ. Активация ТПР5 приводит к генерации антиген-представляющих клеток (дендритных и моноцитов), т.к. на этих клеточных популяциях в основном экспрессируется ТПР5. Причем установлено, что активация ТПР5 его лигандом флагелином индуцирует синтез ИЛ-12 при поддержании продукции ИЛ-10 (супрессорного цитокина) на низком уровне. Важное наблюдение сделано в последние годы, а именно — лиганд ТПР5 не меняет радиорезистентность опухолей у мышей и защищает нормальные клетки против облучения [222].

Главной характерной особенностью активаторов ТПР7 и ТПР8 является их преимущественная локализация на популяции эффекторов врожденного иммунитета — Ту8 клетках, а также усиление эффективности иммунизации микобактериальным антигеном, который применяется для терапии НРУ-ассоциированных болезней, включая онкологические [193].

ТПР9 расположены преимущественно на ДК. Было высказано предположение, что применение Срв олигодеоксинуклеатида (лиганда ТПР9) и антагониста ИЛ-10 окажется перспективным методом терапии рака [61]. На некоторых опухолевых моделях установлено влияние полиморфизма генов ТПР2 и ТПР4 на развитие и прогрессирование опухолей, следовательно, воздействие на ТПР2 и ТПР4 у онкологических больных может иметь неоднозначный эффект [233] [30]. Мутации нуклеиновых кислот и аномальная экспрессия ТПР4 может привести к невосприимчивости лечения такими агонистами ТПР2 и ТПР4 как БЦЖ [212] [176].

При воспалительных процессах, связанных с метаплазией эпителия кишечника, отмечается гиперэкспрессия ТПР 4. Активация ТПР-4 может вызвать увеличение продукции факторов, повышающих риск развития злокачественных новообразований: простагландина Е, активацию эпидермального фактора роста и циклооксигеназы-2 [155].

Было показано, что ЛПС способствует ускорению метастазирования колоректального рака, вызывая повышение адгезионных свойств и способности к инвазии опухолевых клеток за счет изменения экстрацеллюлярного матрикса [120]. Была продемонстрирована возможность гибели злокачественно трансформированных клеток в присутствии интерферона, способного индуцировать апоптоз при действии эндогенных факторов, например,.

ТПР 3 на клетках рака простаты человека и ТПР 4 на клетках рака молочной железы [112, 141, 165]. Определение экспрессии генов ТПР для определения того, какой использовать модификатор ЕДК — агонист или антагонист — является перспективным [234].

Одним из перспективных кандидатов для применения в качестве иммунокоррегирующего средства при индуцированных цитостатиками иммунодефицитах может рассматриваться отечественная терапевтическая вакцина ВП-4. ВП-4 оказывает стимулирующее действие на клеточное звено иммунитета и обладает противоинфекционной, противоопухолевой и антиметастатической активностью у мышей [3], [2], [14]. ВП-4 содержит комплекс лигандов толл-подобных рецепторов, посредством которых вакцина оказывает нормализующее влияние на показатели состояния врожденного иммунитета. Такое сочетание свойств представляется оптимальным для иммунотерапии и иммунокоррекции онкологических больных после длительных курсов химиотерапии и комбинированных видов противоопухолевого лечения.

Параллельно с клиническими работами по иммунотерапии опухолей были проведены экспериментальные исследования по увеличению эффективности иммунотерапии опухолей. Такие исследования являются особо ценными, так как они позволяют реально оценить правомерность многих теоретических предположений. Трансфекция генов главного комплекса гистосовместимости, цитокинов и различных костимулирующих молекул с последующим лечением развивающихся опухолей дает интересные результаты [[196], [143], [91]]. Цитокин трансфектированные опухоли в экспериментальных животных подвергаются регрессии, тогда как исходные штаммы — нет. Эти результаты инициировали работы по трансфекции ex vivo опухолей человека, чтобы затем их использовать для иммунотерапии [35, 71]. Отдаленные клинические результаты показали низкую эффективность всех этих подходов.

В клинике были проведены исследования по использованию гормонов тимуса для восстановления клеточного иммунитета. В частности, изучены тимостимулин (Тр-1) и тимозин фракции V или al [101] [44]. Предклинические исследования показали влияние этих препаратов на некоторые функции Т-клеток in vitro и на клеточный иммунный ответ in vivo в экспериментах на животных. Показана также модификация функций лимфоцитов in vitro, полученных от пациентов с плоскоклеточным раком органов дыхания.

Тимомиметики" левамизол и изопринозин могут также использоваться для усиления функциональной активности лимфоцитов и макрофагов in vitro и in vivo [[ЮЗ]]. Так, левомизол отменяет анергию лимфоцитов, выделенных от онкологических больных, к динитрохлорбензолу. Комбинация левомизола с 5-фторурацилом достоверно увеличивает выживаемость у пациентов раком толстого кишки Duke’s «С» стадии [[118]]. Изопринозин имеет ограниченное применение в онкологии, которое используется для стабилизации ремиссии [[25]]. Метилинозинмонофосфат, также являющийся «тимомиметиком», in vitro в низких дозах отменяет супрессивное действие Т-лимфоцитов, вызванное простагландинами и пептидами ретровируса Р15Е. В системе in vivo этот препарат увеличивает продолжительность жизни мышей с экспериментальными опухолями [103]. Исследователи считают, что данный препарат будет эффективным в адъювантной терапии.

Отменить супрессивное действие факторов, секретируемых опухолью: CTLA-4, ТФР-Р или Р15Е — можно также с помощью гуманизированных моноклональных антител [[25], [62]]. Плазмофорез отменяет иммуносупрессивное действие комплексов антиген-антитело, удаляя их из сыворотки крови онкологических больных. Повысить эффективность удаления этого комплекса можно также при использовании сорбционных колонок с протеином, А стафилококка. У больных после проведения экстракорпоральных методов детоксикации с использованием таких колонок отмечается субъективное и объективное улучшение.

Ранее уже упоминалось об иммуносупрессивном действии простагландинов на иммунную систему онкологических больных. Поэтому использование нестероидных противовоспалительных препаратов (индометацина) должно отменять такое супрессивное действие.

Низкие дозы ЦФ, которые не обладают иммуносупрессивным, миелосупрессивным и тумороцидным действием, также могут быть использованы для усиления клеточного иммунитета [45]. Таким же действием на клеточный иммунитет обладают препараты цинка [104] [98], [185].

Из данных литературы видно, что множество препаратов с различными механизмами действия способны улучшать клеточное звено иммунитета. Поэтому вполне логичным можно считать направление, в котором используют комбинации нескольких препаратов для отмены опухоль-индуцированной иммуносупрессии.

Экспериментальные модели оценки иммуномодулирующих средств.

С целью создания эффективных средств коррекции иммунодефицитов, ассоциированных с новообразованиями или с противоопухолевым лечением, а также для терапии иммунологической недостаточности любого другого происхождения разрабатываются экспериментальные модели иммунодепрессивных состояний.

Для изучения свойств иммуномодулирующих средств разрабатываются и применяются иммунодепрессанты и генетически иммунодефицитные животные. Возросшие в последнее время технологические и методологические возможности позволяют конкретизировать поражение не только отдельных звеньев иммунитета, но определять поражение субпопуляций клеток. Так, например, были открыты Т-регуляторные клетки, которые могут создавать состояние специфической иммунологической толерантности не только для «своих», но даже для чужеродных антигенов. Это позволяет разрабатывать средства для этиотропного воздействия и повышения эффективности проводимой терапии. В ряде исследований показано, что иммуномодуляторы различной природы способны восстанавливать количественный и супопуляционный состав лимфоидных клеток после действия цитостатиков [68].

Существуют различные подходы к созданию иммуносупрессорных состояний у мышей. Наиболее распространенные иммунодепрессанты — это кортикостероиды и алкилирующие агенты, в некоторых случаях применяют ионизирующие излучения. Известно, что большие дозы глюкокортикоидов могут вызывать в организме экспериментальных животных развитие иммунологической депрессии, проявляющейся рядом эффектов: угнетением моноцитарно-макрофагальной системы, снижением массы и клеточности тимуса, селезенки, лимфатических узлов и костного мозга [17, 18, 81, 82]. Применение лекарственных препаратов, вызывающих иммуносупрессию, связано с воздействием на целый ряд тканей, которые не являются мишенью для действия иммуносупрессантов. Такое воздействие нарушает хрупкое равновесие организма с возбудителями заболеваний и оказывает влияние на механизмы их взаимодействия. Таким образом, необходимо представлять изменения, происходящие в организме в ответ на введение этих препаратов для адекватной оценки их воздействия на иммунную систему и ее возможности к адаптации [114].

Цитостатики могут оказывать разнонаправленное влияние на иммунную систему и продукцию иммунокомпетентными клетками цитокинов [51], [131], [190], [199]. Некоторые химиотерапевтические агенты, в частности, ЦФ в малых дозах, способны вызывать иммуностимулирующее действие [51], [140], [151], [160]. Этот эффект объясняется способностью цитостатиков избирательно ингибировать супрессорную популяцию Т-регуляторных клеток, что, в свою очередь, приводит к активации Thl лимфоцитов и усилению продукции противовоспалительных цитокинов, например, ИФН-у [51], [151]. Другие исследователи обращают внимание на угнетение синтеза и секреции цитокинов под действием цитостатиков в терапевтических режимах [199].

ЦФ — химиотерапевтический алкилирующий агент, применяемый при лечении онкологических и аутоиммунных заболеваний [34, 52]. ЦФ наиболее часто используется для получения иммуносупрессии у мышей [16]. В работах на животных были показаны изменения, происходящие в клеточном звене иммунного ответа в ответ на введение ЦФ. ЦФ угнетает иммунологическую реактивность за счет влияния на клетки-предшественники [7]. У животных отмечается дозозависимое снижение клеточной пролиферации лимфоцитов in vitro и снижение ответа на туберкулин по сравнению с животными, не получавшими лечение ЦФ.

Выраженность повреждающего действия ЦФ на лимфоидную и миелоидную ткани зависит от режима и дозы введения препарата. Изменения происходят как в лимфатических узлах и селезенке, так и в циркулирующей популяции лимфоцитов. Среди эффектов ЦФ — резкое снижение костно-мозговых Т-клеток вплоть до 10 суток [9], снижение количества незрелых миелоидных и эритроидных элементов [10]. В процессе репарации костно-мозгового кроветворения происходит ускорение созревания гемопоэтических предшественников [8], [6]. Пролиферация в ответ на введение фитогемагглютинина и конкавалина подавляется незначительно. При введении ЦФ в дозе порядка 200 мг/кг в течение более 2 дней отмечается развитие нейтропении [34, 38].

Миелои лимфосупрессивный эффект ЦФ был описан еще в середине 60-х годов [77, 78] [152]. Супрессивное действие ЦФ проявляется в терапевтических дозах, которые для мышей составляют более 10 мг/кг веса тела животных, а для человека более 5 мг/кг. ЦФ уже в дозе 20 мг/кг вызывает уменьшение числа спленоцитов у мышей. При этом количество Т-клеток уменьшается на 50% процентов. Высокодозная химиотерапия в максимально переносимых дозах вызывает резкое снижение количества Т-лимфоцитов до 90% [151]. В малых дозах алкилирующие химиотерапевтические агенты способны оказывать иммуномостимулирующее действие за счёт угнетения Т-супрессорной субпопуляции [151]. ЦФ при ежедневном введении в течение 7 дней по 20 мг/кг вызывает снижение пролиферативной активности спленоцитов [172].

В исследованиях на мышах для создания иммунодефицитных состояний применяется, в том числе ЦФ в дозе 50 мг/кг массы тела [204]. Исследовалась эффективность введения полисахаридов в качестве иммуностимуляторов у мышей с иммунодефицитом, вызванным ЦФ. В качестве маркеров оценивалась фагоцитарная активность, стимулированная пролиферация Т-клеток, усиление гемолиза и реакция гиперчувствительности замедленного типа в ответ на динитрофторбензол [65].

Также исследовали эффективность введения лактоферрина в качестве стимулятора иммунитета у мышей, леченых ЦФ. Было выявлено, что лактоферин не оказывает действия на количество клеток или их состав, но ускоряет процесс восстановления лимфопоэза и миелопоэза [34]. Для стимуляции лимфопоэза и миелопоэза применяют гормоны тимуса, цитокины, вещества с низкой молекулярной массой [33].

На фоне применения ЦФ у мышей со спонтанным развитием сахарного диабета 1 типа отмечается поражение Т регуляторных клеток СБ4+СВ25+РохрЗ+, у них снижается супрессивная активность и увеличивается экспрессия маркеров апоптоза [52]. Показано, что нафталан увеличивает количество и функциональную активность макрофагов у белых мышей с индуцированным ЦФ иммунодефицитом [15]. Тимозин, а также изучали на мышах с иммунодефицитом, индуцированным введением ЦФ.

Введение

тимозина, а статистически значимо увеличивает уровень С08+, при оценке уровеня ФНО-а, интерферона у, интерлейкина 2, интрелейкина 6 и интерлейкина 10 статистически значимых различий не выявлено [64].

Миелосупрессорное состояние у мышей для изучения действия иммуномодуляторов можно вызвать введением ЦФ и гидрокортизона в дозах 160 мг/кг и 40 мг/кг массы тела животных. Гидрокортизон до 21 суток от начала наблюдения вызывает снижение общего количества ядросодержащих клеток костного мозга. Однократное подкожное введение полиоксидония в дозе 40 мг/кг массы тела животных через 10 суток после введения гормона достоверно ускоряет восстановление количества ядросодержащих клеток костного мозга мышей. Внутрибрюшинное введение ЦФ приводит к развитию гипоплазии костного мозга. Однократное введение полиоксидония на 3 сутки после введения цитостатика значительно ускоряет регенерацию лимфоцитарного, эритроцитарного и гранулоцитарного ростков костномозгового кроветворения [21].

Изучение морфофункциональных особенностей тучных клеток на фоне иммуносупрессии, вызванной ЦФ, показало, что у мышей отмечается более выраженная и более длительная супрессия морфофункционального статуса тучных клеток и естественных факторов защиты при инфицировании стафилококком [13].

Иммуномодуляторы различной природы оказывают стимулирующее влияние на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками как в монорежиме, так и в сочетании с введением цитостатиков [3], [14], [68], [190]. По мнению некоторых авторов, именно цитокины являются связующим звеном между врождённым и адаптивным противоопухолевым иммунитетом [43], [84].

ЦФ индуцированный иммунодефицит является простой и воспроизводимой моделью, которая позволяет изучить воздействие на различные звенья иммунного ответа, оценить активность иммуномодуляторов. Учитывая противоречия, неоднозначность трактовки накопленных данных, а также новые взгляды на роль отдельных субпопуляций лимфоцитов и цитокинов, эта классическая модель иммуносупресии требует детального описания с целью выявления наиболее значимых критериев нарушения функции иммунитета. Представление полной картины изменений, происходящих у лабораторных животных на фоне введения ЦФ, позволит охарактеризовать эффективность иммуномодуляторов и их перспективность для коррекции изменений иммунного ответа у больных с индуцированными специфическим лечением нарушениями.

В настоящее время широко исследуется влияние различных веществ на функцию иммунной системына основании полученных данных разрабатываются методики иммуносупрессивной или иммуностимулирующей терапии [73] [123] [102, 169] [31, 121, 142, 150, 187, 231, 236, 238] [202, 216] [85, 105].

Одновременный метаболизм веществ в организме.

Говоря о применении одного вещества для отмены нежелательных побочных эффектов другого препарата, не следует забывать о возможности появления новых терапевтических эффектов комбинации этих препаратов. Такие терапевтические эффекты могут проявляться вследствие взаимного влияния веществ на метаболизм друг друга.

Любое вещество, которое попадает в организм, подвергается метаболическим превращениям. Общую стратегию метаболизма ксенобиотиков можно определить следующим образом — превратить соединение в более гидрофильное, которое бы было просто вывести из организма с биологическими жидкостями. Такая стратегия эффективна, но имеет серьезные изъяны. Первый изъян заключается в том, что может возникать ситуация, когда метаболическим превращениям должны подвергаться сразу несколько ксенобиотиков. В этом случае один ксенобиотик может резко нарушать выведение другого. Результатом нарушения такого выведения может явиться увеличение биологической активности вещества. Чтобы продемонстрировать, как сильно может меняться биологическая активность вещества, приведем пример сочетанного применения препарата клофелина и алкоголя. От обычной терапевтической дозы человек может потерять сознание и даже погибнуть. Второй изъян такой стратегии метаболизма — при окислении (для увеличения гидрофильности) ксенобиотиков последние могут приобретать новую биологическую активность, в частности, цитотоксическую и канцерогенную. Более детальный анализ взаимного влияния ксенобиотиков на их фармакологическую активность проведен в диссертационной работе Т. А. Богуш [4].

ЦФ — это алкилирующий противоопухолевый препарат, который очень эффективен для лечения онкологических, аутоиммунных заболеваний. Вот уже более 50 лет он является одним из наиболее часто используемых препаратов. Главной особенностью ЦФ является то, что исходный препарат не обладает фармакологической активностью. Фармакологической активностью обладают только реактивные метаболиты, которые образуются при его метаболической активации в печени под действием монооксигеназ. Поэтому при нарушении метаболической активации (заболевания печени и т. д.) ЦФ теряет свою фармакологическую активность. Эти же реактивные метаболиты ЦФ опосредуют и его токсическое действие. Поэтому токсическое и противоопухолевое действие ЦФ тесно связано между собой.

В клинической практике наиболее изучен микросомальный метаболизм ЦФ: выделены и идентифицированы его реактивные метаболиты и продукты детоксикации. Для ЦФ, а также продуктов его метаболизма изучена фармакокинетика, в том числе у онкологических больных. Общую схему метаболизма ЦФ в организме можно представить следующим образом (рис.1). Цитотоксическая и алкилирующая активность ЦФ появляются под действием монооксигеназ в печени [29] [94]. На первом этапе происходит окисление гетероциклического кольца с образованием 4-оксиЦФ и альдофосфамида, который может спонтанно разлагаться с образованием высокореактивного акролеина и фосфамидиприта. При ферментативном окислении оксициклофосфана и альдофосфамида под действием альдегиддегидрогеназы, альдегидоксидазы и алкогольдегидрогеназы образуются кетоциклофосфан и карбоксифосфамид, не обладающие противоопухолевой активностью и являющиеся продуктами детоксикации.

При неферментативном разложении неактивного карбоксифосфамида образуется нороазоиприт, обладающий высокой алкилирующей активностью и высокой токсичностью, но не обладающий противоопухолевым эффектом.

В литературе описано, что микросомальные ферменты печени и НАДФН увеличивают токсический противоопухолевый эффект ЦФ. Важно помнить о многообразии ферментативных систем организма, в связи с чем совместный метаболизм препаратов может значительно изменять их первоначальный эффект, вызывая изменение активности (увеличение токсичности, снижение клинического эффекта, усиление клинической эффективности, появление новых форм токсичности). аснгснг о/*^.

А сн? н о-снг о] сснгс. н.

СМхоюШЫф" Н аснгснг о мсн2 сюнгснг о снг.

СусйфЫмрЬапшй.

КЯ н он сенгснг о^-сн м СН2 сюнгснг осн2.

Н ООН сюнгснг о, м СЮН2СН2 о-сн2 Р сюнгснг о," с.

N Р снг сюнгснг о снг.

Д-КйосусЯорЬсирЬшпмЬ аснгснг о, мн.

НР аснгснг аг а^-ас: сюнгснг 0 N н р сюнгснг н о— р сюнгснг о-снгснгс'^ 0″ «*0»" *" сюнгснг о сн^н^.

АМорЫлр^игчде.

СагЬохурЬоврНатк!".

ОН.

Рисунок 1. Активация ЦФ под действием ферментов печени.

Поэтому ЦФ можно рассматривать как своеобразный индикатор взаимных метаболических превращений ксенобиотиков. Приведем один из примеров того, как метаболические превращения ЦФ могут сопровождаться увеличением его фармакологической активности. В 80-х годах прошлого столетия была очень популярна гипотеза, что опухольэто ловушка глюкозы [23]. В экспериментальной и клинической онкологии возникло направление, утверждающее, что при искусственной гипергликемии опухолевый узел будет закисляться. Закисление клетки будет нарушать в ней репарационные процессы. Отсюда исследователи делали вывод о необходимости проведения химиотерапии на фоне искусственной гипергликемии. Данная гипотеза полностью игнорировала метаболизм препаратов в организме. Действительно, комбинация искусственной гипергликемии и ЦФ сопровождалась выраженным увеличением противоопухолевой активности цитостатика. По новому направлению в клинической онкологии в НИИ онкологии и медицинской радиологии было проведено широкомасштабное клиническое испытание на 488 больныхбыла изучена фармакокинетика ЦФ на фоне искусственной гипергликемии. Гипергликемия блокирует разрушение реактивных метаболитов ЦФ, и все эффекты по увеличению противоопухолевой активности ЦФ объясняются не закислением опухолевых клеток в результате гипергликемии, а изменением фармакокинетики ЦФ [1] [12, 22]. Меньшая доза ЦФ на фоне изменения фармакокинетики вызывала токсическое и, следовательно, лечебное действие цитостатика. А поскольку в терапевтических схемах химиотерапии доза цитостатиков жестко регламентирована, то использование данной комбинации в клинической практике было смертельно опасно для пациентов.

Таким образом, изменение фармакологического действия ЦФ при его совместном применении с другими препаратами указывает на нарушение метаболизма ЦФ. Нарушение метаболизма ЦФ сопровождается изменением его лечебного и токсического действия, что делает невозможным использованием этой комбинации без углубленного исследования фармакокинетики цитостатика в клинической практике.

Степень и характер влияния противоопухолевых цитостатических препаратов на гемопоэз во многом определяют возможности применения этих веществ в клинической практике. При изучении действия ЦФ был установлен его выраженный миелои лимфосупрессивный эффект [5] [11] [137]. В то же время клетки-предшественники гранулоцитов менее подвержены действию ЦФ, чем эритроидные ядросодержащие клетки и клетки-предшественники лимфоцитов [186]. Установлено, что влияние ЦФ на иммунную систему зависит от концентрации препарата, а также от времени его введения относительно антигенной стимуляции. Наиболее чувствительны к ЦФ клетки на стадии пролиферации [55]. В последние годы было показано, что алкилирующие химиотерапевтические агенты в малых дозах способны оказывать иммуностимулирующее действие за счёт угнетения Т-супрессорной субпопуляции [151]. Напротив, в терапевтических концентрациях они способны угнетать иммунный ответ. В частности, ЦФ в дозе 20 мг/кг вызывает уменьшение числа спленоцитов у мышей [137]. При этом число Т-клеток снижается на 50%. Высокодозная химиотерапия (200 мг/кг) вызывает резкое уменьшение количества Т-лимфоцитов (на 90%) [151]. По данным литературы, ЦФ при ежедневном введении в течение 7-ми дней в дозировке 20 мг/кг вызывает снижение пролиферативной активности лимфоцитов селезёнки на такие митогены, как липополисахарид, конкавалин, А и Pseudomonas aeruginosa [110] [172]. Показано также, что однократное введение ЦФ приводит к снижению числа лимфоцитов — особенно В-клеток, экспрессирующих В220. Кроме того, ЦФ вызывает снижение продукции иммуноглобулинов клетками Пейеровых бляшек [110]. Эти результаты, по мнению авторов, свидетельствуют о необходимости комбинации химиотерапии и иммунотерапии при лечении злокачественных новообразований. В ряде исследований показано, что иммуномодуляторы различной природы способны восстанавливать количественный и супопуляционный состав лимфоидных клеток после действия цитостатиков [151] [21, 68] [70].

При введении ЦФ наблюдается тимическая атрофия с уменьшением размеров органа и заметным обеднением долек, кроме того в тимусной паренхиме выявляются миелометапластические изменения, особенно в субкапсулярной и кортико-медуллярной зонах [146] [171]. В капсулярной зоне и в перегородках наблюдается истончение соединительнотканных элементов [146]. Среди клеток долек тимуса увеличивается число апоптозированных тимоцитов с фрагментированной ДНК. Такие тимоциты имеют высокий уровень экспрессии каспазо-активируемой ДНКазы [171]. Показано, что ЦФ вызывает практически полное истощение лимфоидных клеток в фолликулах бурсы Фабрициуса и значительное уменьшение её массы [194].

В первую очередь под действием ЦФ в фолликулах бурсы снижается число пиронинофильных клеток. Через 26 дней после введения ЦФ клеточный состав фолликулов бурсы полностью восстанавливается, но репопуляция кортикальной зоны в фолликулах бурсы имеет место только после мозговой зоны [194]. В настоящее время почти нет сведений о морфогистохимических характеристиках лимфоидных органов при проведении иммунокоррекции на фоне супрессивного действия цитостатиков. Использование результатов морфогистохимических исследований позволит расширить характеристику иммуномодулирующих эффектов, проявляющихся как на уровне центральных и периферических органов иммунной системы, так и субпопуляционного состава составляющих их и периферическую кровь лейкоцитов. Подобные исследования, наряду с изучением макроскопических изменений и клинико-патологическими данными, способствуют установлению иммуномодулирующего эффекта того или иного препарата непосредственно на иммунную систему.

2. Материалы и методы.

5. Выводы.

1. Разработана модель стойкой (7−10 дней) иммуносупрессии при трехкратном внутрибрюшинном введении ЦФ мышам в дозе 100 мг/кг с интервалом 72 часа с учетом фармакокинетики активных метаболитов ЦФ, морфологии органов иммуногенеза, состава форменных элементов периферической крови, продукции цитокинов, содержания основных субпопуляций лимфоцитов селезенки мышей и цитотоксической активности N К-клеток.

2. Фармакокинетика ЦФ при трехкратном введении по сравнению с однократным характеризуется снижением концентрации активных метаболитов ЦФ, увеличением времени достижения их максимальной концентрации с 10 до 15 мин, периода полуэлиминации с 11,3 до 15,1 мин и периода полного выведения из организма с 5 до 6 часов.

3. Показано, что при морфогистологическом исследовании органов иммуногенеза (красный костный мозг, тимус, селезенка) трехкратное введение ЦФ угнетает миелои лимфопоэз, уменьшает количество молодых, зрелых и дифференцирующихся форм клеток, нарушает строму и сосудистую сеть органов с последующим неполным восстановлением в течение 120 часов преимущественно элементов стромы, а в периферической крови наблюдается выраженная лейкопения с 3 по 12 сутки при минимальном количестве лейкоцитов на 8−9 сутки (3,7−1,7)х103 в мм3, повышение содержания сегментоядерных лейкоцитов и отсутствие моноцитов.

4. Установлено, что при трехкратном введении ЦФ в сыворотке крови мышей существенно снижается уровень ИЛ-1|3, кратковременно уменьшается уровень ИЛ-12 и транзиторно повышается ИЛ-6 и ИНФ-у, уменьшается содержание Т- (СЭЗ+, СБ4+) и В клеток (С019+), Т регуляторных лимфоцитов (СБ4+/0)25+), ЫК.

БХ5+) и снижается цитотоксическая активность натуральных киллеров.

5. ВП-4 восстанавливает нарушения, вызванные ЦФ в органах миелои лимфопоэза, что проявляется в появлении молодых клеток, находящихся на различных стадиях дифференцировки, нормализации сосудистой сети кроветворных и лимфоидных органов, а в периферической крови повышением уровня лимфоцитов, моноцитов и появлением до 18% бластных форм клеток.

6. Установлено, что при введении ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии, в сыворотке крови кратковременно снижается ИЛ-1повышается продукция ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-12, ИНФ-у, ИЛ-4, ИЛ-10 при снижении уровня супрессорного цитокина ТФР-Р, в селезёнке мышей повышается число СБ4+ Т-лимфоцитов с 17 до 28,4% и В-клеток с маркером СЭ19+ с 7 до 19%.

7. Комбинированное применение ВП-4 (200 мкг/мышь) и ЦФ (50−100 мг/кг) способствует усилению противоопухолевого действия цитостатика у мышей с плазмоцитомой МОРС-21, что проявляется в увеличении СПЖ животных с 25,4±0,7 до 40,0±0,9 суток и с 37,3±0,9 до 45,8±1,9 суток соответственно при 50 и 100мкг/кг ЦФ.

8.

Введение

ВП-4 на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии позволяет корригировать иммунологические нарушения, обусловленные супрессивным действием цитостатика.