Распределение электрического потенциала на границах липидных мембран

Изучение клеточных мембран и их поверхностных характеристик является одной из важнейших проблем биологической физики. Решение этой проблемы стимулирует развитие методов измерения электрических полей в самой мембране и ее ближайшей окрестности, в том числе и в области гликокаликса. Основную роль при этом играет ионное окружение, хотя в последние годы становится очевидным, что влияние неорганических ионов не исчерпывается эффектами заряжения поверхности. Некоторые из этих ионов могут принимать прямое участие в изменении структуры бислойной части клеточных мембран, которое оказывается существенным фактором для функционирования мембранных белков, для фармакологической активности и токсичности различных веществ. Наиболее интересными в этом отношении являются ионы лантанидов, имеющие высокое сродство к фосфолипидам и известные как блокаторы механочувствительных каналов. Последние играют важнейшую роль в осмотической устойчивости клеток и в поддержании тонуса сосудистой стенки кровеносных сосудов. Блокирование неорганическими ионами имеет общие черты для каналов самых разных клеток и опосредованно, по-видимому, изменениями в их липидном окружении. Однако участие в этом процессе липидного бислоя, его связь с составом мембран и адсорбцией ионов требуют существенного уточнения. Эти и многие другие задачи биофизики мембран делают актуальным совершенствование физических методов анализа взаимодействия с поверхностью клеточных мембран неорганических ионов, особенно с высоким сродством к фосфолипидам, и органических молекул с разным сочетанием ионизованных групп, а также изучение молекулярной природы индуцированных ими изменений в структуре липидного матрикса. Традиционные для биофизики экспериментальные модели — плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ), липосомы и липидные монослои, предоставляют уникальные возможности для решения таких задач.

Межфазный скачок потенциала в области границ мембраны с водными растворами, граничный потенциал, включает в себя падение потенциала в диффузной части электрического двойного слоя, и так 7 называемую дипольную компоненту потенциала, которая непосредственно связана со структурой границы, включающей ориентированные у поверхности молекулы воды, адсорбированные ионы, органические вещества и макромолекулы. Дипольная компонента потенциала может служить поэтому индикатором эффектов, в которых изменения ионного равновесия сопряжено с изменением структуры мембран. Физическим мотивом таких эффектов служат межмолекулярные взаимодействия в липидном бислое, а потому они должны отражаться на его термодинамических и механических характеристиках. В данном исследовании использованы экспериментальные методы и подходы, которые позволяют зарегистрировать соответствующие явления, дать им количественную оценку и сделать определенные выводы относительно их молекулярной природы.

ГЛАВА 1.

Электрическое поле в клеточных мембранах и их окрестности.

Представление об активной роли липидной компоненты биомембран во многих биохимических процессах получило в последние годы существенную экспериментальную поддержку. Это связано с разработкой тонких методов биохимии и молекулярной биологии, которые сделали доступными для детального анализа индивидуальные свойства мембранных белков. При этом оказалось, что функции этих белков во многих случаях связаны не только с их конкретной структурой, но также с химическим составом и физическими характеристиками окружающего их липидного матрикса. Причин здесь может быть несколько и многие из них хорошо известны. Так, гидрофобное окружение и фазовое состояние прилегающих к белкам липидов является существенным условием их конформационной подвижности в мембране. Для работы транспортных систем особенно важно наличие поверхностного потенциала мембран, который в свою очередь зависит от степени ионизации поверхности, прежде всего полярных групп липидов. Неорганические ионы являются, очевидно, непременным участником этих явлений, а некоторые из них существенным образом влияют на межмолекулярные взаимодействия в мембранах и значительные изменения в клеточных мембранах. На работе мембранных белков не может не отразиться и фазовое разделение липидов, инициированное, например, присутствием высокомолекулярных веществ, которые могут приводить к латеральной неоднородности мембран, появлению кластеров и перераспределению липидов между двумя сторонами мембраны. Этот неполный список эффектов приводит к предположению, что изменение структуры и физических свойств липидного бислоя может служить одним из механизмов регулирования биохимических процессов в клеточных мембранах.

Большая часть исследований, проведенные в данной работе, направлены на экспериментальное подтверждение и детализацию гипотезы, согласно которой весьма значимым для функционирования многих мембранных систем является изменение фундаментальных физических характеристик липидного бислоя, и прежде всего распределения заряда и электрического поля внутри мембраны и ее ближайшей окрестности. Достаточно очевидно, что распределение электрического потенциала в клеточных мембранах существенным образом влияет на транспорт через мембрану ионов и заряженных молекул. Такие процессы конечно зависят от разности электрических потенциалов между водными фазами с обеих сторон мембраны на достаточно большом удалении от ее поверхности. Однако эта разность далеко не всегда совпадает с падением потенциала внутри самой мембраны и, конечно, не отражает реальную довольно сложную структуру электрического поля в мембране и в области ее границ с водными растворами. В то же время именно это электрическое поле принимает непосредственное участие в транспортных процессах и влияет на функционирование мембранных белков.

Электрическое поле на границе мембран с водными растворами в значительной степени определяется взаимодействием ионов электролита с липидами, формирующими бислойные мембранные структуры. По этой причине многие поверхностные свойства биологических мембран изучаются в опытах с липосомами, плоскими бислойными липидными мембранами (БЛМ) и липидными монослоями. Эти объекты привлекательны еще и потому, что в отличие от биомембран их химический состав, плотность поверхностного заряда и другие существенные для электростатических взаимодействий условия контролируются достаточно просто, а методы их исследования взаимно дополняют друг друга. Однако ценность такого подхода намного шире. В опытах с липидными мембранами проявляются общие закономерности распределения электрического поля на границе раздела двух фаз. Скачок потенциала на этой границе, граничный потенциал, включает в себя диффузную часть двойного электрического слоя, т. е. падение потенциала в омывающем мембрану растворе. Значительная часть граничного потенциала имеет дипольную природу и непосредственно связана с молекулярной структурой границы, и, конечно представляет наибольший интерес. Для большинства объектов физической и коллоидной химии хорошо изучена лишь первая, диффузная компонента граничного потенциала, доступная для измерений электрокинетическими методами Достоверные сведения о дипольной компоненте граничного потенциала можно получить только при сочетании независимых измерений потенциала в разных плоскостях, параллельных границе раздела. Соответствующие методы были разработаны, в том числе и автором данной работы, именно для липидных мембран, которые предоставляют поэтому уникальную возможность для изучения связи структурных факторов с распределением граничного потенциала.

Развитие экспериментальных методов исследования липидных и клеточных мембран имеет достаточно любопытную и долгую историю. Особые физико-химические свойства липидов, обусловленные сочетанием у этих молекул гидрофобных и гидрофильных участков, привлекали внимание исследователей и без какой-либо связи с их биологической ролью. Достаточно упомянуть пионерские исследования монослоев из органических кислот А. Н. Фрумкина (см. главу 4). Однако наибольшее развитие подобные исследования получили после того, как была осознана биологическая роль липидов — основного структурного элемента клеточных стенок. Два важнейших обстоятельства послужили импульсом к разработке новых методов изучения биомембран. Прежде всего это предложенная Митчеллом идея, в которой образование трансмембранного градиента ионов прямо связывалось с энергозатратными транспортными процессами [Рубин, А.Б. (1987)]. Попытки ее экспериментального подтверждения стимулировали развитие техники формирования плоских бислойных липидных мембран (БЛМ), удобной для регистрации электрических потенциалов и проводимости мембран [Кругляков, П.M.et al. (1978)] [hbkob, B.r.et al. (1981) — hbkob, B.r.et al. (1982)].

С другой стороны, значительный прогресс в понимании физических процессов на поверхности мембран был достигнут с использованием данных электрокинетических измерений в суспензии липосом. Целый цикл таких исследований был проведен Стюартом Маклафлиным с группой соавторов. Ему, в частности, принадлежит один из первых и подробный обзор электростатических явлений в биомембранах [McLaughlin, S. (1977)], а также ретроспективный обзор исследований в этой области [McLaughlin, S. (1989)]. Работы с его участием выполнены и представлены в публикациях настолько глубоко и детально, что они безусловно стали в ряд классических образцов научной литературы. Полученные им результаты сложились в солидный фундамент, на котором строятся современные представления об электростатике биомембран. Не случайно именно эти работы стимулировали многих исследователей к разработке методов и изучению электростатических эффектов с применением плоских липидных мембран. К их числу относятся исследования, проводимые в нашей лаборатории (см. например, монографии [Богуславский, Л.И. (1978)] [Маркин, В.C.et al. (1974)] и диссертации [Абидор, И.Г. (1986)], [Белая, М.Л. (1981)]) в том числе и автором данного труда. Предваряя более подробное изложение материала таких исследований в последующих главах, мы сформулируем здесь общий подход и модельное представление о распределении электрического поля на границах липидных и биомембран. В обзорную главу включены лишь самые общие сведения о межфазном потенциале и методах его исследования. В каждой из последующих глав содержится краткий обзор исследований и результатов, которые имеют прямое отношение к материалам главы. К сожалению при этом не всегда удавалось избежать повторений.

ВЫВОДЫ.

1. Предложен метод независимого определения констант равновесия и плотности центров связываниядано количественное описание ионного равновесия в рамках модифицированной модели Гуи-Чепмена-Штерна для ионов, различающихся по сродству к фосфолипидам более, чем на четыре порядка. Показано, что адсорбция некоторых из них (СЮ" 4, ТМА+) приводит к изменению не только поверхностного заряда, но и способности фосфолипидов к ионизации.

2. Обнаружены и количественно описаны электростатические, изотопные и калориметрические эффекты, вызванные взаимодействием ионов, заряженных молекул и полиэлектролитов с липидным бислоем: погружение амфифильных молекул в липидный бислойизменение состояния примембранной воды в присутствии ионов с разными хаотропными свойствамиизменение ориентации полярных групп фосфолипидов при адсорбции многовалентных катионов, латеральная сегрегация липидов в бислое и трансмембранный перенос заряженных липидов (флип-флоп) в присутствии заряженных макромолекул.

3. В опытах с амфифильными молекулами (флуоресцентные зонды, некоторые противоопухолевые препараты, порфирины) обнаружен компенсационный эффект: граничный потенциал мембран почти не меняется с концентрацией фонового электролита. Развита модель, в которой этот эффект связан с погружением молекул в бислой.

4. Показано, что адсорбция на поверхности мембран лантанидов (1а, Ос!, УЬ) и катионов Ве, в отличие от других многовалентных катионов (Мд2+, Са2+, № 2+) характеризуется высоким сродством к фосфолипидам (константы связывания Ве2+ и Ос13+ с мембранами из фосфатидилхолина, соответственно, 400 и 103М" 1 и фосфатидилсерина — 103и 5104М" 1, и сопровождается значительным изменением дипольной компоненты граничного потенциала и механических характеристик мембран. Предложен механизм, в котором блокирующее действие этих катионов на механочувствительные каналы связывается с их влиянием.

244 на структуру липидного матрикса и с особой ролью ионизованных молекул фосфатидилсерина.

5. Проведен анализ распределения электрического поля в модели гликокаликса, представленном в виде слоя ионизованного полимера вблизи заряженной поверхности мембраны. Показано, что решение уравнения Пуассона-Больцмана для профиля электрического потенциала существенно зависит от поверхностного потенциала внешней границы слоя |/8, и критического значения этого потенциала |/*, выраженного через основные параметры слоя — плотность объемного заряда Р и концентрации анионов, п и катионов п+.