Актуальность темы
исследования.
Хронический миелолейкоз (XMJI) — клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия — «филадельфийская хромосома», РЬ’хромосома (в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами образуется химерный онкоген BCR-ABL). На момент установления диагноза XMJ1 в костном мозге при кариологическом анализе выявляется 95−100% РЬ'-положительных клеток.
Современная терапия препаратами интерферона-альфа (ИФН-альфа) и ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниб мезилат) позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона и восстановления нормального кроветворения, что приводит к увеличению выживаемости больных. Полный цитогенетический ответ (ПЦО), при котором у пациентов определяется восстановление нормального кариотипа и не выявляется РЬ’хромосома, является стандартным критерием эффективности терапии у больных XMJ1.
При лечении иматинибом получение ПЦО через 5 лет терапии отмечено у 87% больных в поздней хронической фазе XMJ1 и у 96% больных в ранней хронической фазе XMJI (А.Ю. Зарицкий, Е. Г. Ломаиа, 2007) [94]. При терапии ИФН-альфа получение ПЦО через 1 год терапии отмечено у 14% больных в хронической фазе ХМЛ (международное исследование IRIS)[76], через 2 года терапи — у 20% (Faderl S., 1999)[101].
Однако у больных с достигнутым ПЦО оказалось возможным обнаружить BCR-ABL положительные клетки при применении более чувствительного молекулярно-биологического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Стало очевидно, что данных стандартного цитогенетического исследования (чувствительность 1:10″ клеток) может быть недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию, особенно у пациентов, достигших не только полной клинико-гематологической ремиссии, но и ПЦО. Поэтому для детекции химерного гена BCR-ABL и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) при XMJI целесообразным является использование метода ПЦР. Изучение МОБ у больных XMJI дает основания определять новые критерии полноты достигнутой ремиссии, распознавать наиболее ранние признаки рецидива заболевания и разрабатывать терапевтические подходы при персистировании остаточной популяции опухолевых клеток.
Поэтому вопрос количественной оценки остаточной опухолевой массы и мониторинга МОБ у больных XMJI является актуальным.
Использование метода ПЦР в реальном времени {Real-time ПЦР) с чувствительностью 10″ 4−10″ 5 дает возможность количественно охарактеризовать остаточную опухолевую массу у больных XMJI по уровню экспрессии гена BCR-ABL и проводить мониторинг МОБ. Метод двухстадийной ПЦР обладает большей чувствительностью (1:10 6клеток) по сравнению с Real-time ПЦР, но является только качественным и не позволяет оценить объем опухолевой массы.
В настоящей работе представлены данные, полученные при использовании методов качественной и количественной ПЦР у больных XMJI, у которых было достигнуто значительное подавление Ph'-положительного опухолевого клона.
Цель исследования:
Оценить клиническую значимость молекулярно-биологических методов детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом.
Задачи исследования:
1. Оценить информативность количественного метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом при разных видах терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия).
2. Сравнить уровень экспрессии гена BCR-ABL в костном мозге и периферической крови для решения вопроса о возможности использования периферической крови при мониторинге минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом.
3. Определить взаимосвязь цитогенетических рецидивов и уровня экспрессии гена BCR-ABL по данным полимеразной цепной реакции в реальном времени у больных хроническим миелолейкозом при терапии иматинибом.
4. Оценить взаимосвязь режима терапии и стабильности достигнутого цитогенетического и молекулярного ответа у больных хроническим миелолейкозом при терапии интерфероном-альфа, иматинибом и комбинированной терапии (иматиниб, интерферон-альфа и курсы малых доз цитозара).
5. Оценить частоту выявления остаточного опухолевого клона с помощью наиболее чувствительного метода двухстадийной ПЦР у больных с полным молекулярным ответом по данным количественного метода ПЦР в реальном времени.
Научная новизна:
На основе данных молекулярно-биологических методов исследования и данных кариологического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа, терапию иматинибом и комбинированную терапию (иматиниб, интерферон-альфа, курсы малых доз цитозара). Установлено, что при динамическом исследовании экспрессии гена BCR-ABL с помощью метода количественной Real-time ГИДР у большинства (90,4%) больных с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом определяется персистирование остаточного опухолевого клона, что диктует необходимость продолжения терапии.
Практическая ценность:
Установлено, что метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени является информативным для детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом. На основании сопоставления данных цитогенетического исследования и количественного метода Real-time ПЦР установлен уровень экспрессии гена BCR-ABL, прогностически значимый для возникновения цитогенетического рецидива и уровень экспрессии, ассоциированный со стабильным полным цитогенетическим ответом. Установлена возможность исследования периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни, что позволяет оценивать стабильность полученного молекулярного ответа в динамике без применения повторных стернальных пункций. Определена схема обследования больных хроническим миелолейкозом при использовании молекулярно-биологических методов исследования.
Основные положения данной работы с 2004 г. внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук (далее — ГНЦ РАМН): настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Разработка стратегии терапии хронического миелолейкоза» (2003;2007 гг.) № 1 200 301 557. Результаты исследований явились основанием для внедрения иматиниба в клиническую практику лечения больных XMJI. Полученные в ходе исследования заключения включены в практическое пособие для врачей и методические рекомендации по обследованию и лечению больных XMJT.
— 12.
ВЫВОДЫ:
1. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени является информативным методом для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом на фоне проведения направленной терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа). Установлено, что при динамическом наблюдении у 90,4% больных с полным цитогенетическим ответом отмечается персистирование минимальной остаточной болезни.
2. Выявлена корреляция уровня экспрессии гена BCR-ABL в периферической крови и костном мозге (коэффициент корреляции 0,9), что позволяет рекомендовать к использованию периферическую кровь для мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом в процессе терапии.
3. Установлено, что у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, высокие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению менее, чем на 1,9 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы с возникновением цитогенетического рецидива. Полный молекулярный ответ и низкие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению более, чем на 3 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы со стабильным полным цитогенетическим ответом.
4. Больным хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом показана непрерывная постоянная терапия (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия), поскольку при отмене лечения отмечается потеря достигнутого ответа и увеличение процента Ph'-положительных клеток в костном мозге.
5. Исследование с помощью метода двухстадийной полимеразной цепной реакции с чувствительностью до 10″ 6 позволяет выявить минимальную остаточную болезнь в 55% случаев полного молекулярного ответа, что свидетельствует о возможности персистирования остаточного опухолевого клона и необходимости проведения постоянной терапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Современные достижения в терапии ХМЛ позволяют не только получить полную клинико-гематологическую ремиссию у больных ХМЛ, но и добиться значительного подавления Ph'-положительного опухолевого клона. Важность достижения ПЦО как фактора увеличения продолжительности жизни у больных ХМЛ подтверждена во многих исследованиях [36−39].
Терапия ИФН-альфа и иматинибом (специфический ингибитор BCR-ABL-зависимой тирозинкиназы) уже доказали свою ценность и значимость использования в качестве «золотого стандарта» в лечении больных с хронической фазой ХМЛ. Однако точного ответа на вопрос о том, возможно ли полное искоренение опухолевого клона на фоне проводимой консервативной терапии, а также на вопрос о том, как долго должна продолжаться эта специфическая терапия у больных с полной цитогенетической ремиссией, на сегодняшний день еще нет. Единственным методом полного уничтожения опухолевого клона при ХМЛ в настоящее время признана аллогенная трансплантация костного мозга.
В связи с этим возрастает важность оценки МОБ у каждого больного ХМЛ, достигшего ПЦО на фоне консервативной терапии. Традиционно использующиеся в гематологии цитогенетические методы не всегда позволяют это сделать из-за их относительно низкой чувствительности. Молекулярные методы (качественная nested ПЦР и количественная Real-time ПЦР), чувствительность которых находится в пределах Ю^-Ю" 6, позволяют более детально изучить остаточный опухолевый клон при ХМЛ.
В нашем исследовании представлена характеристика МОБ у 83 больных (39 мужчин и 44 женщин в возрасте от 16 до 70 лет) с ХФ Ph'-позитивного ХМЛ, получающих терапию ИФН-альфа, иматинибом и комбинированную терапию. Медиана наблюдения в группе больных, получавших терапию ИФНальфа, составила 66 мес.(6−108 мес.) — в группе больных, получавших терапию иматинибом — 48 мес. (6−60 мес.) — в группе больных, получавших комбинированную терапию — 36 мес. (24−36 мес.). В группе больных, получавших терапию ИФН-альфа и в группе больных, получавших комбинированную терапию, все пациенты находились в ранней ХФ. В группе больных, получавших терапию иматинибом 67.9% пациентов были в поздней ХФ, 32,1% - в ранней ХФ.
В указанных трех клинических группах пациентов регулярно проводился цитогенетический мониторинг. Мониторинг МОБ производили у 19 больных с помощью метода качественной nested ПЦР и у 74 больных — с помощью количественного метода Real-time ПЦР.
Для проведения анализа выделяли РНК из клеток костного мозга или периферической крови, выполняли реакцию обратной транскрипции с целью получения комплементарной ДНК.
Для проведения качественной двухстадийной (nested) ПЦР проводили амплификацию на приборе «PCR sprint thermal cycler» фирмы Hybaid и визуализировали ПЦР-продукт с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле.
Количественную Real-time ПЦР проводили при помощи прибора ICycler IQ (фирмы BioRad) с использованием технологии TaqMan. Количество копий транскрипта гена BCR-ABL и гена [32-микроглобулина (выбранного в качестве контрольного гена) определяли относительно стандартной калибровочной кривой, представляющей собой серию разведений плазмиды, содержащей известное количество копий. Окончательный результат у выражали в виде соотношения: число копий BCR-ABL х 10 /число копий [32-микроглобулина.
Для оценки динамики МОБ определяли десятичный логарифм снижения уровня транскрипта BCR-ABL относительно НБУ по формуле: log 10 НБУ-loglO результат {BCR-ABL х 107/р2-микроглобулин). За величину начального базального уровня (НБУ) была принята медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL, полученная при диагностическом анализе 35 пациентов с впервые выявленным XMJI. Этот уровень (НБУ) составил 11 245 {BCR-ABL х 107 /[32-микроглобулин) копийlg НБУ = 4,05.
При анализе ЦО выяснилось, что наиболее раннее получение БЦО и ПЦО (к 3 мес. терапии) и наибольшее число стабильных ПЦО (63,6%) было отмечено среди пациентов, получающих комбинированную терапию, наиболее позднее (до 48 мес.) и наименьшая стабильность ПЦО (5,3%) — в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа. Частота возникновения ЦР была выше в группе больных, получающих лечение ИФН-альфа (36,8%). Снижение стандартных доз и перерывы в терапии могли быть ассоциированы с возникновением ЦР во всех трех клинических группах.
При анализе с помощью качественной ПЦР в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа, было установлено, что частота ПМО возрастает при увеличении срока терапии, однако полученный ПМО не был стабильным. Положительные результаты качественной ПЦР свидетельствовали о сохранении МОБ даже на поздних сроках терапии ИФН-альфа. Развитию цитогенетической нестабильности могли предшествовать как положительные, так и отрицательные результаты качественной ПЦР.
На фоне снижения доз ИФН-альфа или перерывов в терапии была возможна потеря ПМО и ПЦО, а при коррекции терапии — их восстановление. Учитывая нестабильность полученных ПМО, и возможность их потери при прерывании лечения, отрицательный результат качественной ПЦР не может являться показанием к прекращению терапии ИФН-альфа.
Таким образом, качественный метод двухстадийной nested ПЦР позволил охарактеризовать МОБ у больных ХМЛ, получающих специфическую терапию, однако более полную информацию удалось получить с помощью количественного метода Real-time ПЦР.
Среди всех проанализированных с помощью количественного метода Real-time ПЦР 250 образцов 91 были отрицательными, 149 положительными.
Была выявлена высокая корреляция уровня экспрессии BCR-ABL в периферической крови и костном мозге при одновременном анализе 20 пар образцов крови и костного мозга. Коэффициент корреляции составил 0.9. Подобные данные были также получены в других исследованиях [76, 77], что послужило основанием рекомендовать использовать для анализа периферическую кровь.
Цитогенетически не имеющие различий пациенты имели разный уровень МОБ по данным молекулярного исследования.
Для большинства (83,3%) пациентов с ЦР было свойственно снижение уровня BCR-ABL транскрипта менее, чем на 1 lg. На момент ЧЦО снижение уровня транскрипта менее, чем на 1 lg по сравнению с НБУ определялось в 43,8% случаев, на 1−2 lg — в 37,5% случаев.
Похожие данные были получены в исследовании T. Bumm с соавторами [73], по данным которого БЦО не всегда был ассоциирован со снижением уровня транскрипта BCR-ABL более чем в 10 раз.
Среди пациентов с ПЦО отмечался наибольший диапазон экспрессии BCR-ABL. В большинстве случаев (43,5%) при ПЦО отмечалось снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 2−3 lg по сравнению с НБУ. Снижение уровня транскрипта на 3 lg и более по сравнению с НБУ (БМО) отмечалось в 24,4% проанализированных образцов у больных с ПЦО. Подобные данные были получены также в исследовании итальянских авторов [75], в котором все случаи стабильного ПЦО были ассоциированы со снижением уровня экспрессии BCR-ABL более, чем на 2 lg.,.
По данным нашего исследования, медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО среди всех больных составила 2,42 lg (-0,4 — 4,03 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО составила 1,18 lg (0,13−2,43 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЦР составила 0,62 lg снижения по отношению к НБУ (-0,42 -1,18 lg).
По данным исследования T. Bumm с соавторами [73], все отрицательные результаты Real-time ПЦР были положительными при проверке стандартной двухстадийной ПЦР. В нашей работе при анализе 37 из 91 отрицательных по данным количественного метода Real-time ПЦР образцов крови и костного мозга с помощью более чувствительных методов (качественной nested ПЦР с чувствительностью до 10'6) BCR-ABL транскрипт удалось выявить в 20 (55%) из 37 образцов. Выявление МОБ в меньшем проценте случаев в нашем исследовании может быть обусловлено тем фактом, что медиана наблюдения была больше, чем в исследовании T. Bumm с соавторами, соответственно, степень подавления остаточного опухолевого клона также могла быть более выраженной при более длительном сроке терапии и мониторинге. Этот анализ продемонстрировал возможность сохранения МОБ на крайне низких уровнях, которые могут остаются за пределами чувствительности применяемого нами количественного метода. Клиническая значимость этих данных заключается в том, что отрицательный результат Real-time ПЦР у больных ХМЛ, получающих консервативную терапию, может не означать полного отсутствия болезни и окончательного искоренения BCR-ABL-позитивного клона.
В группе пациентов, получающих терапию ИФН-альфа, молекулярный анализ с помощью количественного метода Real-time ПЦР показал сохранение МОБ и нестабильность полученного ПМО у всех пациентов. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL у пациентов с сохраняющимся ПЦО на этой терапии составляла 2,41 lg снижения по сравнению с НБУ. В 3 случаях была отмечена возможность сохранения полной клинико-гематологической ремиссии и ПЦО (в 1 случае — стабильного, в 2 случаях — нестабильного) во время длительных (12−36 мес.) перерывов в терапии у пациентов на поздних сроках терапии ИФН-альфа.
В группе пациентов, получающих терапию иматинибом были отдельно проанализированы больные со стабильным ПЦО, нестабильным ПЦО и ЦР. У пациентов со стабильным и нестабильным ПЦО медианы уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО не различались и составили 2,56 и 2,57 lg снижения по сравнению с НБУ. Уровень экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО был выше, чем при ПЦО: медиана 1,41 lg снижения по сравнению с НБУ.
Наиболее высокие уровни экспрессии BCR-ABL среди пациентов на терапии иматинибом были выявлены в момент развития ЦР (медиана 0,62 lg снижения по сравнению с НБУ). При проведенном в 6 случаях молекулярном анализе за 6−12 мес. до возникновения ЦР также отмечалось появление высоких уровней экспрессии BCR-ABL: медиана 0,86 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ПЦО и 0,89 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ЧЦО.
Снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 1−1,99 lg по отношению к НБУ было характерно как для пациентов с ПЦО, так и для пациентов с ЧЦО и могло предшествовать развитию ЦР.
Низкие уровни экспрессии BCR-ABL (более 3 lg снижения по сравнению с НБУ) и отрицательные результаты Real-time ПЦР у больных ХМЛ на терапии иматинибом были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. Именно при таком уровне редукции уровня экспрессии BCR-ABL в течение 12 месяцев терапии иматинибом дальнейшая выживаемость без признаков прогрессии составила 100% по данным Hudges с соавторами [76] в рамках исследования IRIS. Подобные данные были получены также и в нашей работе.
В группе пациентов, получающих комбинированную терапию, на момент ПЦО медиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 2,4 lg ниже НБУмедиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 0,9 lg ниже НБУ при сохраняющемся ЧЦО. Высокие уровни экспрессии BCR-ABL (менее 1,99 и менее 1 lg снижения по отношению к НБУ) и повышение уровня транскрипта в динамике могли предшествовать развитию ЦР, а также выявляться при цитогенетической резистентности. Выявление этих относительно высоких уровней также было отмечено на ранних (менее 3 мес.) сроках терапии при достижении ЧЦО. Снижении уровня экспрессии BCR-ABL на 1,5−1,9 lg также наблюдалось за 3−6 мес. до развития ЦР. Уровни экспрессии BCR-ABL, соответствующее более, чем 2 lg снижения по сравнению с НБУ, и отрицательные результаты у больных ХМЛ, получающих комбинированную терапию, были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. При длительных перерывах в лечении (3−4 мес.) на 1−2 году комбинированной терапии в 2 случаях отмечалось развитие ЦР.
Возможность получения отрицательных результатов Real-time ПЦР была отмечена у 72,8% пациентов на терапии иматинибом, 72,7% пациентов на комбинированной терапии и у 80% больных, длительно получающих терапию ИФН-альфа. По сведениям литературы (Lin с соавторами [78]) было установлено, что на терапии иматинибом что повторные отрицательные результаты Real-time ПЦР (стабильный ПМО) наблюдается редко. Данные нашего исследования подтверждают этот факт: стабильные ПМО при терапии иматинибом были отмечены только у 5 (9,4%) из 53 больных. При этом достоверно большая (р<0,05) частота достижения ПМО (72,8%) была выявлена у пациентов со стабильным ПЦО по сравнению с таковой у больных с нестабильным ПЦО (31,3%). Стабильные ПМО были отмечены также у 3 (27,3%) из 11 больных на комбинированной терапии.
С помощью клинических примеров на разных видах терапии (ИФН-альфа, иматиниб, комбинированная терапия) было продемонстрировано влияние изменения схемы и доз применяемой терапии, а также перерывов в терапии, на полноту и стабильность достигнутых цитогенетических и молекулярных ремиссий. Была показана динамика МОБ у отдельных пациентов и взаимосвязь роли цитогенетического и молекулярного мониторинга.
Учитывая длительное, хроническое течение заболевания у больных с хронической фазой XMJI, для мониторинга МОБ в динамике оптимально производить исследование с помощью Real-time ПЦР 1 раз в 3 мес., чтобы вовремя обнаружить тенденцию к изменению экспрессии BCR-ABL, выявить уровень экспрессии, ассоциированный с возникновением цитогенетического рецидива. Наиболее информативен для определения динамики изменения экспрессии гена BCR-ABL молекулярный мониторинг у больных с ПЦО. Возможность исследования периферической крови для мониторинга МОБ позволяет оценить стабильность полученного молекулярного ответа и избежать повторных стернальных пункций.
Таким образом, количественный метод Real-time ПЦР является важным в анализе МОБ при XMJT. Анализ с помощью этого метода позволяет определить относительно безопасные уровни МОБ, ассоциированные с сохраняющимся ПЦО, а также своевременно выявить ранние признаки развития рецидива.
