Химико-токсикологическое исследование оксибензола и его монометильных производных

Актуальность темы

Оксибензол и его монометильные производные широко применяются в качестве полупродуктов в ряде важнейших органических синтезов, известны как лекарственные средства, стабилизаторы, реактивы. Данная группа соединений является побочными продуктами коксово-газовой промышленности.

Оксибензол и его монометильные производные обладают значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления оксиаренами, в том числе и с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе производства, хранения и применения, вследствие аварий, техногенных катастроф, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, употребления недоброкачественных продуктов питания, а также при суицидных попытках.

Имеются данные, согласно которым LD50 оксибензола и его монометильных производных для мышей и крыс составляет приблизительно 400−500 мг/кг, летальные дозы оксибензола и крезолов для человека соответственно около 14 мг/кг и 150 мг/кг. Большие объемы промышленного синтеза, широкое применеие оксибензола и его метальных производных, их высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования оксибензола и монометилоксибензолов из объектов биологического происхождения, их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых соединений в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных является актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей диссертации является разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: I.

1. Определить особенности хроматографической активности исследуемых веществ и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов. Выявить оптимальные условия идентификации и количественного определения оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методом ТСХ и ВЭЖХ .

2. Изучить возможность применения спектрофотометрии в УФ-, видимой, и ИК-областях для идентификации рассматриваемых соединений в субстанциях и в извлечениях из биологических объектов. I.

3. Исследовать особенности взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов. Показать возможность применения отдельных реакций электрофильного замещения и образования молекулярных продуктов типа п-донор — п-акцептор в условиях анализа рассматриваемых соединений.

4. Провести изучение возможности применения жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии для концентрирования, разделения и очистки объектов исследования.

5. Исследовать особенности изолирования рассматриваемых веществ различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

6. Изучить характер распределения объектов исследования в организме теплокровных животных.

7. Исследовать сохраняемость рассматриваемых соединений в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности хроматографической активности оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов в сорбентах с гидроксилированной поверхностью и поверхностью с привитыми алкильными радикалами, выявлены оптимальные условия и расчитаны отдельные параметры хроматографирования рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов.

По результатам исследования разработаны методики идентификации и количественного определения оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ.

Исследованы некоторые особенности электронных и ИК-спектров рассматриваемых соединений. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения исследуемых веществ.

Показана возможность идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе образования молекулярных продуктов и ионных ассоциатов в хромогенных реакциях с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, родамином Ж после предварительного переведения анализируемых веществ в их полинитропроизводные.

Исследованы особенности экстрагирования рассматриваемых веществ из водных растворов в зависимости от рН среды, природы органических экстрагентов, насыщения экстрагентов водой, присутствия электролитов в водном слое.

Для извлечения оксибензола и его монометильных производных из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях, приемлемые для исследования свежего и гнилостно измененного трупного материала.

На примере оксибензола и его 4-монометильного производного показаны особенности распределения монооксиаренов в органах и биожидкостях теплокровных (кролики).

Изучена сохраняемость рассматриваемых соединений в трупном материале в зависимости от продолжительности процесса сохранения .

На основании проведенных исследований разработана общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометильными производными.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

— методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации, и количественного определения монои динитропроизводных 2- и 4-метилоксибензолов (информационное письмо «Об определении нитрафена при судебно-химическом исследовании биологического материала» (утверждено Российским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ, № 330 от 19. 06. 2000).- Москва, 2000;

— методики идентификации оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ (внедрены в. токсикологической лаборатории Ейской больницы (г.Ейск, Краснодарский край), акты внедрения № 235 и № 236 от 21 октября 2003 г.;

— методики идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе хромогенных реакций с производными ксантена и тетразолия после предварительного введения в структуру анализируемых веществ электрофильных заместитетелей (нитрогруппы) (внедрены в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической химии, акты внедрения № 219 и № 220 от 2 ноября 2003 г., и кафедры органической химии, акты внедрения № 224 и № 225 от 7 октября 2003 г., Курского государственного медицинского университета;

— методика идентификации и количественного определения оксиароматических соединений по реакции с гидроксидом натрия после предварительного нитрования (методические рекомендации.

Идентификация и количественное определение лекарственных средств производных 8-оксихинолина" (разрешены к опубликованию цикловой методической комиссией физико-химических и фармацевтических дисциплин Курского государственного медицинского университета от 01.12.99 г., протокол № 2).-Курск, 1999.

На защиту выносятся:

— результаты исследования хроматографической подвижности оксибензола и его монометильных производных и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностью;

— особенности светопоглощения исследуемых веществ в УФ-видимой и ИК-областях спектра;

— оптимальные условия взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов;

— методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений хроматографическими и фотометрическими методами;

— результаты изучения особенностей экстракции исследуемых веществ из водных растворов;

— методики изолирования из биологического материала и очистки оксибензола и его монометильных производных;

— особенности распределения оксибензола и его 4-метилпроизводного в организме теплокровных;

— сохраняемость монооксиаренов и их основных метаболитов в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы апробированы на III Всероссийской конференции «Экоаналитика-98» с международным участием (Краснодар, 1998 г) — на V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000 г) — на Всероссийской конференции «Экоаналитика -2000» с международным участием (Краснодар, 2000 г) — на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2003 г) — на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003г).

Связь задач исследования с проблемным плано м фармацевтических наук. Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01. 20. 4 473), отраслевой научно-исследовательской программой № 35 МЗ РФ.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 публикациях, одна из которых — патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, общих выводов, общей схемы исследования и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 198 страницах, содержит 18 рисунков, 52 таблицы. Список цитируемой литературы включает 222 источника, из которых 121 на русском и 101 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. При хроматографировании оксибензола, изомеров метилоксибензола и их метаболитов в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов (соответственно «Silpearl» и «Силасорб-600») оптимальными элюентами являются системы растворителей гексан-диоксан-хлороформ (20:10:4), гексан-пропанол-2 (20:1), и гексан-диоксан-пропанол-2 (20:5:1), при хроматографировании 2,4,6-тринитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензола — системы гексан-диоксан (7:3) и гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2), при хроматографировании 4,6- и 2,6-динитропроизводных соответственно 2- и 4- метилоксибензола — система гексан-диоксан-пропанол-2 (40:50:1).

Оксибензол и изомеры монометилоксибензола могут быть полностью разделены в виде соответствующих полинитропроизводных в тонком слое сорбента «Silpearl», обработанном вазелиновым маслом (модель привитой фазы С10-С15), с использованием элюента ацетонитрил-вода (1: 9). При этом хроматографическая подвижность полинитропроизводных увеличивается в ряду: 2-метил-4,6-динитрооксибензол < 4-метил-2,6-динитрооксибензол < З-метил-2,4,6-тринитрооксибензол < 2,4,6-тринитрооксибензол.

Разработаны методики количественного определения анализируемых соединений непосредственно или в виде соответствующих полинитропроизводных методом ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата не превышает 2,5%.

2. Изучены особенности поглощения электромагнитного излучения рассматриваемым рядом соединений в различных областях спектра.

Наличие специфических особенностей в поглощении отдельными соединениями УФ-, видимого и ИК-света обусловливает возможность использования методов электронной и колебательной спектрофотометрии для их идентификации.

На основе особенностей поглощения исследуемыми веществами УФ-излучения в среде 95% этанола разработаны методики их количественного определения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает 1%.

3. Исследованы особенности нитрования (электрофильное замещение) исследуемых монооксиаренов и их метаболитов с последующим получением окрашенных продуктов в реакциях образования аци-нитросолей (с гидроксидом натрия), ионных ассоциатов (с родамином Ж), молекулярных комплексов (с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, ДМФА, пирроксаном), а также особенности реакции окисления объектов исследования хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия.

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количественного фотометрического определения анализируемых веществ. Относительная ошибка среднего результата при количественном определении не превышает 2%.

4. Изучена экстрагируемость оксибензола, его монометильных производных и их метаболитов из водных растворов органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды и присутствия электролитов.

Установлено, что монооксиарены наиболее полно извлекаются из кислых, нейтральных, и слабощелочных растворов, их метаболиты — из растворов с кислой и нейтральной реакцией среды.

5. Определены особенности препаративного хроматографирования рассматриваемых веществ в колонке с силикагелем L 40/100ц при последовательном использовании подвижных фаз гексан-диэтиловый эфир (6:4) и гексан-диэтиловый эфир (2:8).

Установлено, что потери исследуемых оксиаренов в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов незначительны и не превышают соответственно 2 и 1,5%.

С использованием методов электронной и ИК-спектрофотометрии показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки исследуемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала.

6. Проведено сравнительное изучение изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала изолирующими агентами различной химической природы.

Установлено, что наибольшие значения степени извлечения исследуемых оксиаренов достигаются при использовании в качестве изолирующего агента этилацетата.

Определены оптимальные условия изолирования объектов исследования этилацетатом.

Разработаны методики определения монооксиаренов и их метаболитов в ткани трупных органов (печени), крови и моче на основе изолирования этилацетатом и очистки методами экстракции и хроматографии.

7. При содержании рассматриваемых соединений в биологическом материале в количестве 100 мг в 100 г (100 мл) биологического материала разработанные методики позволяют определить в ткани печени 67,2184,85%, монооксиаренов и 67,13−87,77% их метаболитов, в кровисоответственно 68,29−86,21% и 68,97−79,56%, в моче — соответственно 70,38−88,93% и 71,16−88,26% этих соединений.

Предложенные методики отличаются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемых монооксиаренов и их основных метаболитов составляет 0,4−1,2 мг в 100 г ткани трупного органа, 0,3−1,0 мг в 100 мл крови и 0,15−0,50 мг в 100 мл мочи.

Показано, что разработанные методики применимы для определения исследуемых веществ в гнилостно изменённом биологическом материале.

8. На примере оксибензола и 4-метилоксибензола исследованы особенности распределения монооксиаренов в организме теплокровных животных при внутрижелудочном введении отравляющего вещества.

Установлено, что монооксиарены в наибольших количествах обнаруживаются в моче, печени и почках отравленных животных.

9. Изучена сохраняемость рассматриваемых монооксиаренов и их метаболитов в трупном материале. Показано, что данные соединения могут быть обнаружены в сохраняемом трупном материале по крайней мере в течение 8−12 недель.

10. На основе проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометцльными производными.