Иммуноферментный анализ антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза в норме и при патологии

Актуальность проблемы.

Исследования последних лет направлены на разработку новых методов иммунохимического анализа низкомолекулярных пептидных биорегуляторов и белков, играющих важную роль в патогенезе ряда заболеваний заболеваний.

Хорошо известно, что изменения гемостаза, связанные с функционированием его основных звеньев — белковых факторов системы свёртывания крови человека: тромбина и его ингибиторов (антитромбина III и аг-макроглобулина), а также пептидных биорегуляторов калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем, имеют большое значение в патогенезе атеросклероза, ишемической болезни сердца, гипертонии, нарушении обмена веществ.

В основе сердечно-сосудистых катастроф (острый инфаркт миокарда, инсульт) лежит, как правило, тромбоз, обусловленный активацией тромбоцитов и процессов свёртывания крови.

Вот почему актуальна задача создания надёжных диагностических методов контроля, позволяющих следить за состоянием организма человека, которые можно использовать в норме и при проявлении патологических симптомов.

В нашей стране и за рубежом используются традиционные подходы для создания диагностических тест-систем, которые заключаются в разработке способов количественного определения белковых либо пептидных факторов, участвующих в механизме развития заболевания.

Однако из литературных данных, известно насколько длительно создание надёжного и простого иммунохимического метода анализа перечисленных выше соединений. Это, в первую очередь, связанно с трудоёмкостью разработки специфического анализа и высокой чувствительностью, так как эти вещества в активном состоянии существуют в организме человека в небольших концентрациях и быстро метаболизируются, что затрудняет их выявление в сыворотке крови.

С другой стороны, в настоящее время выполнены исследования, свидетельствующие о наличии в организме здорового человека иммуноглобулинов, взаимодействующих с рядом эндогенных биорегуляторов и называемых естественными антителами.

При патологических состояниях происходит изменение нормального уровня е-ат, которое, как правило, связано с нарушением метаболизма того или иного эндогенного соединения, участвующего в патогенезе заболевания.

Вот почему большой интерес представляет обнаружение и изучение роли е-ат к ряду пептидных и белковых регуляторов системы гемостаза, изменение метаболизма которых имеет место при сердечно-сосудистых заболеваниях и нарушении обмена веществ. К ним относятся, в первую очередь, тромбин и его природные ингибиторы, а также пептиды — брадикинин и ангиотензин II.

Исследования по выявлению и изучению свойств е-ат к этим соединениям позволяют создать новые методы иммунохимического анализа, как для изучения механизма перечисленных выше заболеваний, так и для их диагностики.

Цель и задачи исследования

.

Цель данного исследования заключается в разработке различных вариантов твердофазного иммуноферментного анализа естественных антител к пептидным биорегуляторам и белкам системы гемостаза для практического применения в клинике заболеваний сердечно-сосудистой системы и нарушения обмена веществ.

В СООТВЕТСТВИИ С ПОСТАВЛЕННОЙ ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНЫ СЛЕДУЮЩИЕ ЗАДА ЧИ: ^ осуществить получение иммунохимических реагентов для разработки иммуноферментного анализа: синтезировать антигены пептидов (брадикинина и ангиотензина II) на полимерной матрице, разработать хроматографические способы выделения белков (аг-макроглобулина и антитромбина III) — разработать иммуноферментные методы определения антител к брадикинину и ангиотензину II, оценить возможность использования иммуноферментного анализа антител для данных биорегуляторов в клинике сердечно-сосудистых заболеваний и нарушения обмена веществвыделить с помощью аффинной хроматографии антитела к брадикинину и ангиотензину II из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, и исследовать их иммунохимические свойстваоптимизировать условия выявления твердофазным иммуноферментным анализом антител к тромбину и его природным ингибиторам (а2-макроглобулину и антитромбину III) в сыворотке крови людей- «Ф провести сравнительный анализ содержания специфических антител к белкам и пептидным биорегуляторам системы гемостаза в сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ для выявления взаимосвязи с биохимическими показателями этой системы и установления практической значимости разработанных вариантов иммуноферментного анализа.

Научная новизна работы. => Разработаны новые способы получения конъюгатов пептидных биорегуляторов на полимерной матрице. Синтезированы искусственные антигены брадикинина и ангиотензина П с использованием 4-полинитрофенилакрилата. => В сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ обнаружено наличие антител к эндогенным пептидным биорегуляторам. Причём, у больных по сравнению с донорами установлено изменение уровня антител к брадикинину и ангиотензину II. => На основе проведённых исследований разработаны оригинальные методы твёрдофазного иммуноферментного анализа антител к пептидным биорегуляторам в сыворотке крови людей. Показана возможность их использования в практической медицине. => Приготовлен новым способом иммуносорбент для аффинной хроматографиивпервые из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями выделены антитела к брадикинину и ангиотензину II и исследованы их иммунохимические свойства.

Практическая ценность работы.

Полученные в работе результаты по созданию новых методов ИФА для выявления е-ат к белкам и пептидным биорегуляторам имеют большое значение для практического использования в медицине.

Так, проведён сравнительный анализ содержания антител к тромбину и его ингибиторам, а также к брадикинину и ангиотензину II в сыворотке крови доноров и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ, в результате которого установлена взаимосвязь с биохимическими показателями, используемыми в качестве оценки состояния больного и течения этих заболеваний. Показана практическая ценность разработанныдх методов иммуноферментного анализа.

Совместно с сотрудниками Клиники лечебного питания Института питания РАМН подготовлен проект методических рекомендаций по практическому применению данных методов иммуноферментного анализа в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуноферментный способ анализа, основанный на выявлении антител к белкам системы гемостаза (тромбину и его ингибиторам) в сыворотке крови, можно использовать в качестве контроля за состоянием организма человека в норме и при появлении патологических изменений.

2. Обнаружено наличие в сыворотке крови человека антител к пептидным биорегуляторам гемостаза (брадикинину и ангиотензину II). Выявлено изменение, по сравнению с нормой, уровня антител к этим соединениям у людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ. Разработаны методы анализа антител к данным эндогенным веществам.

3. Установлена взаимосвязь между содержанием антител к тромбину, антитромбину III и аг-макроглобулину в сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ и биохимическими показателями, используемыми для характеристики течения и прогноза этих патологий в клинике. Показана практическая значимость разработанных методов иммуноферментного анализа.

Апробация работы.

Основные материалы и положения диссертационной работы доложены и утверждены: игна межлабораторной конференции Института физиологически активных веществ РАН (протокол № 1 от 24 апреля 1997 года);

— на межлабораторной конференции Московского научно-исследовательского института им. Г. Н. Габричевского (протокол № 1 от 25 апреля 1998 года).

Результаты исследования также были доложены на: игМеждународном конгрессе по аналитической химии (г. Москва, 1997 год) — иг Ш-ем Международном симпозиуме «Питание и здоровье. Б АД в профилактике и лечении наиболее распространённых заболеваний» (г. Тюмень, 1997 год).

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

А1 — ангиотензин I;

АП — ангиотензин II;

АД — артериальное давлениеосг-МГ — а2-макроглобулин,.

АПС — аминопропилированное стекло;

АПФ — ангиотензин-превращающий фермент;

АТ — антитела;

АТШ — антитромбин III;

БК — брадикинин;

ВМК — высокомолекулярный кининогенГБ — гипертоническая болезньГЛП — гиперлипопротеидемия;

ДВС-синдром — синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания,.

ДМФА — диметилформамид,.

Е-ат — естественные антитела;

ЗФР — забуференный раствор,.

ИБС — ишемическая болезнь сердца,.

ИБХ РАН — Институт биоорганической химии Российской академии наук;

ИФА — иммуноферментный анализ;

ИЭФ — иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу;

Ка — константа аффинности;

КА — конъюгированные антигены;

КДИ — мета-толуол-сульфанат-1 -циклогексил-2(морфолин-этил)карбодиимидККС — калликреин-кининовая системаКНЦ — кардиологический научный центрЛА — латексная агглютинация;

МГУ им. М. В. Ломоносова — Московский Государственный университет им. М. В. Ломоносова;

МИТХТ им. М. В. Ломоносова — Московский институт тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова;

МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского — Московский научно-исследовательский институт им. Г. Н. Габричевского;

ОИМ — острый инфаркт миокарда,.

ПК — прекалликреин;

ПНЖК — полиненасыщенные жирные кислоты;

РАМН — Российская академия медицинских наук;

РАН — Российская академия наук;

ПЭГ — полиэтиленгликоль;

РАС — ренин-ангиотензиновая система;

РИД — радиальная иммунодиффузия по Мапсш;

СГК — спонтанно-гипертензивные крысы;

СМК — сополимер стирола с метакриловой кислотой;

ТР — тромбин;

ЧСА — человеческий сывороточный альбуминРВБ — 0.01 М солевой фосфатный буфер;

— иммуноглобулин класса в-^М — иммуноглобулин класса М.

ВЫВОДЫ.

I. Получены иммунохимические реагенты для иммуноферментных методов анализа специфических антител к белкам и пептидным биорегуляторам гемостаза. Синтезированы оригинальным способом конъюгированные антигены брадикинина и ангиотензина II с использованием 4-полинитрофенилакрилата в качестве высокомолекулярной матрицы. Из сыворотки крови выделены высокоочищенные белки: аг-макроглобулин и антитромбин III с помощью аффинной хроматографии.

П. Оптимизированы условия проведения твердофазного иммуноферментного анализа для выявления в сыворотке крови больных и доноров антител к тромбину, а2-макроглобулину и антитромбину III. Доказана практическая значимость метода определения антител к антитромбину III при выборе терапии и установлении прогноза течения заболевания.

Ш. Обнаружены в сыворотке крови здоровых людей естественные антитела к брадикинину и ангиотензину II. Установлено изменение уровня специфических антител к данным биорегуляторам у больных с сердечно-сосудистыми патологиями и нарушением обмена веществ по сравнению с донорами. Показана возможность использования твердофазного иммуноферментного анализа антител к указанным биорегуляторам в клинике для наблюдения за эффективностью лечения.

ГУ. Аффинной хроматографией выделены антитела к брадикинину и ангиотензину II из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми патологиями. Установлено, что при возникновении заболевания происходит изменение аффинности и специфичности этих антител.

V. Установлена корреляционная зависимость между содержанием в сыворотке крови больных естественных антител к исследуемым антигенам и рядом биохимических показателей (концентрацией холестерина, триглицеридов, фибриногена, протромбиновым индексом, фибринолитической активностью), которые используются в качестве оценки состояния больных. Полученные при этом результаты показывают возможность использования методов определения уровня естественных антител к указанным выше соединениям в качестве дополнительного критерия для характеристики заболевания.