Фенотипические и функциональные особенности иммунокомпетентных клеток и клеточной чувствительности к интерферону in vitro у больных почечно-клеточным раком

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Широко известно, что иммунная система играет центральную роль в механизмах противоопухолевой защиты организма [8,9]. Иммунокомпетентные клетки продуцируют ряд цитокинов, которые являются регуляторами межклеточных взаимодействий [2,12,21,30,32]. Кроме того, некоторые популяции клеток иммунной системы способны к ци-тотоксическому действию на опухолевые клетки [8,36,49,52,176]. Однако снижение уровня функциональной активности иммунной системы, а также особенности опухолевых клеток позволяют им не только преодолевать иммунологический барьер, но и оказывать иммуносупрессивное воздействие на организм, а в некоторых случаях использовать медиаторы иммунной системы для собственной прогрессии. В таких случаях могут развиваться онкологические заболевания [10,19,25,162].

Одной из актуальных проблем современной онкоурологии является высокий уровень заболеваемости почечноклеточным раком (ПКР), на долю которого приходится около 97% всех опухолей почек [29]. Ведущая роль в лечении ПКР, безусловно, принадлежит хирургическому методу [103,110,115,153,154]. Однако, более целесообразна комбинированная модель терапии, включающая в себя наряду с хирургическим лечением иммунотерапию препаратами интерферона, среди которых широкое распространение получил рекомбинантный интерферон-а2а [74,142,43,147]. Данный препарат кроме противовирусного и антипролиферативного действия, обладает ярко выраженными иммуномодулирующими свойствами: стимулирует активность естественных киллерных клеток, процессы фагоцитоза и цитотоксичность нейтрофильных гранулоцитов [26,104,105,152,157]. В то же время необоснованное или несвоевременное применение препаратов интерферона может снизить эффективность терапии или даже оказать негативное воздействие на организм в целом [14,118].

Важную роль в механизмах противоопухолевой защиты играют ней-трофильные гранулоциты. Хорошо известно, что модуляторами функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов являются не только вещества микробного происхождения, иммунные комплексы, медиаторы клеток крови и ткани, но и фармакологические препараты [1,59,69,70,73]. Кроме того, нейтрофильные гранулоциты характеризуются высокой мобилизационной активностью и способностью к быстрому и точному отражению изменений гомеостаза [34,36,60,61,78]. Это делает возможным оценить прямое и опосредованное действие фармакологических препаратов на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, что позволит определить чувствительность клеток к данному препарату и, в дальнейшем, судить об эффективности терапии.

Не подлежит сомнению, что изучение состояния иммунной системы, а также модуляции функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов интерфероном in vitro на фоне онкогенеза является одной из актуальных проблем современной биологии и медицины. Кроме того, изучая состояние иммунной системы и клеточную чувствительность к интерферону у больных ПКР, можно не только охарактеризовать патогенез ПКР, но и получить экспериментальное обоснование терапии данным препаратом, а также определить его оптимальную лечебную дозу и объективно оценивать эффективность интерферонотерапии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Изучить фенотипические и функциональные особенности иммунокомпетентных клеток и клеточную чувствительность нейтрофильных гранулоцитов к интерферону in vitro у больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие ЗАДАЧИ:

1. Изучить особенности клеточного и гуморального иммунитета у больных ПКР до хирургического вмешательства и через 14 дней после удаления опухоли.

2. Исследовать параметры спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР в период до хирургического лечения и в динамике после оперативного вмешательства.

3. Оценить показатели сывороточного ИФН, а также уровни спонтанной и стимулированной выработки ИНФ-а и ИФН-у мононуклеарами периферической крови больных ПКР до и через 14 дней после оперативного лечения.

4. Изучить влияние различных доз рекомбинантного интерферона-а2а in vitro на функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР в период до и в динамике после хирургического лечения.

5. Определить хемилюминесцентную активность нейтрофильных гранулоцитов при воздействии различных доз рекомбинантного интерферо-на-а2а in vitro после 1-го курса реаферонотерапии у больных ПКР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Впервые на современном методическом уровне проведено комплексное исследование клеточного и гуморального иммунитета, а также функционального состояния иммунокомпетентных клеток у больных ПКР.

Впервые выявлены особенности ИФН статуса у больных ПКР в период до и после оперативного вмешательства. Результаты проведенного исследования показали повышенный уровень общего сывороточного ИФН на фоне сниженной продукции мононуклеарами периферической крови ИФН-а у больных ПКР как до, так и через 14 дней после хирургического лечения. При этом спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови у больных ПКР до и после хирургического лечения значительно превышает контрольные показатели. В то время как стимулированная продукция ИФН этого типа снижена в дооперационном периоде и восстанавливается через 14 дней после хирургического лечения.

Впервые изучена функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов крови больных ПКР до и в динамике после хирургического лечения, что позволило обнаружить повышенный уровень кислородзависимого метаболизма и сниженные компенсаторные возможности данной клеточной популяции.

Впервые установлено, что клеточную чувствительность к препаратам интерферона in vitro можно определять с помощью хемилюминесцентного анализа функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов.

Определено оптимальное время для начала интерферонотерапии у больных ПКР — через 1,5 месяца после операции. Поскольку в этот период наиболее широк диапазон клеточной чувствительности к интерферону in vitro.

Доказано, что изменение параметров хемилюминесценции нейтрофи-лов крови в ответ на различные дозы реаферона in vitro носит индивидуальный характер.

Впервые установлено, что после 1-го курса интерферонотерапии клеточная чувствительность изменяется у 85% пациентов с ПКР, что указывает на необходимость оценки индивидуальной чувствительности не только до начала лечения, но и перед рециклом.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Проведенные исследования установили возможность с помощью хемилюминесцентного (XJI) анализа реактивности нейтрофильных гранулоцитов крови до начала интерферонотерапии определять индивидуальную чувствительность к препарату, а также осуществлять подбор оптимальной дозы. Это дает возможность корригировать дозу препарата в процессе интерферонотерапии, что позволит оптимизировать схему лечения и повысить клиническую эффективность иммунотерапии.

По результатам исследования получены 2 приоритетные справки на изобретения.

Результаты проведенных исследований внедрены в практическую работу Красноярского краевого онкологического центра, клиники ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями.

Основные положения диссертации используются в учебном процессе на кафедре биохимии и физиологии человека и животных Красноярского государственного университета и кафедре клинической иммунологии Красноярской государственной медицинской академии.

Работа поддержана ККФН (конкурсный грант 11F0164C, 2002;2003гг.).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Иммунные нарушения у больных ПКР характеризуются изменением фенотипического спектра лимфоцитов и параметров интерферонового статуса, а также изменением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов периферической крови.

2. Хемилюминесцентный анализ реактивности нейтрофильных гранулоцитов при воздействии реаферона in vitro позволяет объективно оценить индивидуальную клеточную чувствительность к данному препарату у больных ПКР.

3. После 1-го курса реаферонотерапии чувствительность нейтрофильных гранулоцитов больных ПКР к воздействию данного препарата in vitro изменяется в 85% случаев, что необходимо учитывать для повышения клинической эффективности иммунотерапии в каждом конкретном случае.

АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ: Основные положения доложены и обсуждены на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодая наука — XXI веку» (Иваново, 2001), на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы урологии» (Кемерово, 2002), на итоговой научно-практической конференции НИИ Медицинских проблем Севера СО РАМН «Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири» (Красноярск, 2002), на XI международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003), на VII Всероссийском научном форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Метаболические механизмы иммунореактивности» (Красноярск, 2004), на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкорадиоло-гии» (Красноярск, 2004), на Объединенном иммунологическом форуме (III Съезд иммунологов России и VI Национальный конгресс РААКИ) (Екатеринбург, 2004), на заседании Красноярского регионального отделения РААКИ (Красноярск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ: Основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 8 рисунками, список литературы включает 176 библиографических изданий (97 отечественных и 89 иностранных).

выводы.

1. Общей закономерностью развития иммунопатологических состояний у больных ПКР является повышение содержания зрелых Т-лимфоцитов (CD3+), увеличение количества экспрессирующих HLA-DR+ CD3±клеток, снижение количества С019'-клеток и повышение относительных уровней синтеза IgA и IgG.

2. У больных ПКР после хирургического лечения (через 14 дней) состояние иммунного статуса характеризуется повышением иммунорегуля-торного индекса, снижаем содержания С016+/56±лимфоцитов, и сохранением увеличенной экспрессия маркеров активации Т-клеток (HLA-DR+), на фоне повышенного синтеза IgA, IgM и IgG.

3. У больных ПКР до операции изменена кинетика и повышен уровень XJI ответа нейтрофильных гранулоцитов крови. Через 14 дней после операции при нормализации кинетики сохраняется повышенным уровень спонтанного XJI ответа, и резко увеличены показатели индуцированной XJI. Через 1,5 месяца наблюдается снижение компенсаторных возможностей нейтрофильных гранулоцитов.

4. У больных ПКР до и после хирургического лечения повышено содержание ИФН в сыворотке крови и увеличена спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови. Через 14 дней после операции наблюдается снижение спонтанной продукции ИФН-а в сочетании с повышенной способностью мононуклеаров периферической крови к индуцированной выработке ИФН-у и ИФН-а.

5. Воздействие реаферона in vitro на нейтрофилы периферической крови больных ПКР до операции не приводит к изменению кинетики и уровня XJI ответа. Через 14 дней после операции отмечается изменение кинетики XJI ответа при наличии реаферона в реакционной среде в дозах 4000 ME и 10 000 ME, а также площади индуцированной XJI кривой при дозе 10 000 ME. Через 1,5 месяца после хирургического лечения расширяется диапазон доз реаферона, в ответ на которые нейтрофилы реагируют изменением параметров XJI. Появляется чувствительность к низкой дозе реаферона — 2000 ME.

6. Установлено, что у больных ПКР через 3 недели после 1-го курса реа-феронотерапии в 85% случаев изменяется XJI ответ нейтрофильных гранулоцитов крови на реаферон in vitro относительно показателей XJI перед началом иммунотерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Взаимодействие организма и опухоли является одной из проблем современной иммунологии опухолей. Значение иммунного ответа на развитие опухоли хорошо известно из классической экспериментальной иммунологии опухолей и исследованиям по «иммунологическому надзору» (термин, предложенный Бернетом и сейчас включающий в себя значительно более широкое понятие), а также из современных исследований по механизму естественной противоопухолевой резистентности. За последние годы установлено существенное значение фактора иммунодепрессии в развитии опухолей. Кроме того, большое внимание уделяется исследованию иммунологической реактивности организма и изучению взаимосвязи уровня иммунного ответа с клиническим течением и прогнозом заболевания, т.к. отмечено, что рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями показателей различных звеньев иммунного ответа [31].

Активное использование иммуномодуляторов началось в 70-х гг. XX века, когда было показано, что использование ряда различных препаратов способствовало восстановлению иммунологических показателей. Клинические исследования, проведенные в то время, выявили как положительные, так и отрицательные стороны этого вида лечения: наряду с данными об эффективности некоторых иммуномодуляторов было показано, что неадекватное применение препаратов способствовало ускорению опухолевого роста и гибели больного [25]. В настоящее время свыше 40 препаратов, обладающих иммуномодулирующими свойствами, разрешены к применению в Россииэто в основном цитокины, препараты тимуса и синтетические препараты. Большинство иммуномодуляторов обладает хорошо изученным механизмом действия с преимущественным влиянием на то или иное звено иммунной системы, хотя, в зависимости от различных условий, препарат может оказывать влияние и на другие ее компоненты. Все это указывает на необходимость предварительной оценки параметров иммунной системы в каждом конкретном случае с последующим назначением соответствующего препарата. В последние годы проведено большое количество исследований по использованию иммуномодуляторов для коррекции иммунологических показателей у больных, получающих химиотерапию. Оказалось, что применение этих препаратов способствует уменьшению токсичности химиопрепаратов, сокращению сроков восстановления лейкоцитов, снижению заболеваемости от вирусных инфекций, а в ряде случаев — увеличению продолжительности ремиссии [31,50]. Особое место среди исследуемых препаратов занимают ци-токиныисследования последних лет показали эффективность их использования при некоторых злокачественных новообразованиях, в частности, при ПКР [44].

В связи с этим целью исследования явилось изучение фенотипических и функциональных особенностей иммунокомпетентных клеток и клеточной чувствительности нейтрофильных гранулоцитов in vitro к интерферону у больных ПКР до операции, и в динамике после хирургического лечения.

На базе Краевого онкологического центра проведены динамические наблюдения за больными nKP (T3NoM0) до хирургического лечения (N=132), через 14 дней после оперативного вмешательства (N=45) и через 1,5 месяца после радикальной нефрэктомии (N=12), а также пациенты после 1-го курса реаферонотерапии (N=20) в возрасте 40−55 лет. В качестве контрольной группы были обследованы 30 здоровых доноров.

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода проточной цитофлюориметрии, используя FACS-Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test IMK-lymphocyte Kit (USA). Концентрацию иммуноглобулинов класса A, M и G в сыворотке определяли методом радиальной иммунодиффузии [140]. Содержание ЦИК в сыворотке определяли турбидиметрическим методом [124]. В супернатантах мононуклеаров периферической крови, культивированных в течение 72 часов, оценивали уровень спонтанной и стимулированной продукции ИФН-а и ИФН-у методом твердофазного иммуноферментного анализа, с помощью тест-систем ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия). Уровень сывороточного ИФН также определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа на тест-системе ООО «Протеиновый контур». Изучение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и определение влияния различных доз ИФН-а2а на реактивность нейтрофилов проводилось с помощью хемилюминесцентного метода.

Исследование иммунологических показателей у больных ПКР показало изменения в клеточном и гуморальном звене иммунной системы. У пациентов в период до хирургического лечения наблюдалась тенденция к повышению, относительно группы контроля, количества зрелых Т-лимфоцитов. Крометого, в группе больных ПКР до хирургического лечения обнаружено увеличение концентрации IgA в сыворотке крови и повышенные относительные уровни синтеза IgA и IgG по сравнению с контрольными величинами, что отражает напряжение гуморального иммунитета.

Через 14 дней после хирургического лечения наблюдается позитивная динамика иммунологических изменений у больных ПКР. Повышается величина иммунорегуляторного индекса за счет увеличения содержания CD4± и понижения количества С08±лимфоцитов. Однако, наряду с этим, в иммунной системе пациентов после радикальной нефрэктомии все же отмечается сниженный уровень лимфоцитов, NK-клеток, а также тенденция к увеличению экспрессии маркеров активации на Т-лимфоцитах. Это свидетельствует о нарушениях в системе противоопухолевой резистентности организма. Гуморальное звено у больных ПКР после хирургического лечения «работает» в усиленном режиме, о чем свидетельствует увеличение по сравнению с контрольными значениями относительного уровня синтеза IgA, IgM и IgG.

Анализ функционального состояния нейтрофильных гранулоцитов у больных ПКР показал, что в клетках больных ПКР до хирургического лечения процессы синтеза активных форм кислорода протекают более активно, чем в нейтрофилах здоровых людей, что свидетельствует об исходно повышенных энергетических затратах нейтрофильных гранулоцитов у пациентов с исследуемой патологией. Однако при дополнительной функциональной нагрузке in vitro в нейтрофильных гранулоцитах лиц с ПКР до хирургического лечения не наблюдается адекватного усиления кислородного метаболизма клеток относительно уровня здоровых доноров, что отражает пониженные резервные метаболические возможности данной клеточной популяции.

У больных ПКР через 14 дней после оперативного вмешательства сохраняется повышенный уровень кислородного метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, но, следует отметить увеличение времени, за которое клетка достигает максимальной интенсивности продукции высокоэнергетических оксидантов. Это способствует менее быстрому истощению функционально-метаболической активности клетки, что, безусловно, является положительным изменением. При изучении функционального ответа нейтрофильных гранулоцитов на стимуляцию опсонизированным зимозаном выявлено, что «респираторный взрыв», регистрируемый с помощью XJI анализа становится еще более выраженным не только по сравнению с уровнем, зафиксированном в контрольной группе, но и превышает соответствующие параметры больных ПКР в период до хирургического лечения. Это отражает повышенные компенсаторные возможности нейтрофильных гранулоцитов у прооперированных пациентов.

Через 1,5 месяца после радикальной нефрэктомии в функциональном состоянии нейтрофильных гранулоцитов больных ПКР были зарегистрированы следующие изменения. Значимо замедлилась скорость синтеза активных форм кислорода за единицу времени относительно группы контроля, однако уровень продукции высокоэнергетических оксидантов остался на прежнем, повышенном относительно группы контроля уровне. При проведении нагрузочных проб с опсонизированным зимозаном, на фоне высокой интенсивности «респираторного взрыва» отмечается значительное снижение компенсаторных возможностей нейтрофилов в данной группе пациентов.

Корреляционный анализ параметров иммунного статуса и XJI ответа нейтрофилов показал увеличение числа взаимосвязей у больных ПКР до хирургического лечения и снижение числа коррелирующих между собой параметров у прооперированных пациентов относительно группы контроля. Кроме того, установлено, что в группе больных ПКР до операции преобладают отрицательные корреляционные взаимосвязи, однако после хирургического лечения соотношение положительных и отрицательных корреляций составляет 1:1, как и в группе здоровых доноров. Необходимо отметить, что в группе здоровых доноров большинство корреляций выявлено между параметрами спонтанного XJI ответа нейтрофилов и Т-клеточным звеном иммунной системы. У больных ПКР до хирургического лечения значительно увеличивается число корреляционных взаимосвязей с параметрами индуцированной XJI и появляются взаимосвязи с показателями, характеризующими гуморальное звено. Через 14 дней после операции снижается число корреляций с показателями Т-клеточного звена. В то же время выявляются взаимосвязи между содержанием В-лимфоцитов, уровнем ЦИК и параметрами XJI ответа нейтрофилов.

К показателям, характеризующим функциональное состояние иммуно-компетентных клеток относятся параметры ИФН-статуса. В сыворотке крови больных ПКР как до, так и после хирургического лечения отмечалось повышенное, относительно уровня контрольных значений, содержание ИФН. Также, в обеих группах пациентов наблюдалась повышенная спонтанная продукция ИФН-у мононуклеарами периферической крови по сравнению с соответствующим параметром здоровых доноров. Однако уровень индуцированной продукции данного цитокина клетками пациентов с ПКР различается в зависимости от периода: до или после операции, а именно, мононуклеары периферической крови больных до хирургического лечения продуцируют ИФН-у примерно на уровне клеток здоровых доноров (статистически значимых отличий между этими группами выявлено не было). В период после оперативного вмешательства мононуклеары периферической крови более интенсивно реагируют на стимул, и, как следствие этого, наблюдается повышенный уровень продукции ИФН-у. Кроме того, у больных ПКР через 14 дней после хирургического лечения наблюдалось снижение спонтанной продукции ИФН-а по сравнению с соответствующим показателем в группе больных до операции. Уровень стимулированной продукции ИФН-а моно-нуклеарами периферической крови больных ПКР снижен относительно контрольных величин. При этом отмечается повышение уровня индуцированной продукции ИФН-а у прооперированных пациентов по сравнению с показателями больных ПКР до хирургического лечения.

Вероятно, изменения ИФН-продуцирующей системы у больных ПКР, зарегистрированные в период до хирургического лечения, являются следствием опухолевой иммуносупрессии. Так, у больных ПКР до операции отмечается дисбаланс продукции ИФН-у мононуклеары периферической кровиповышенный спонтанный уровень этого цитокина не сопровождается адекватным увеличением продукции ИФН-у в ответ на стимуляцию. Возможно, это обусловлено снижением функционально-метаболических компенсаторных возможностей иммуноцитов. Также это может быть связано с нарушением рецепторного аппарата и/или сигнал-передающих систем иммунокомпе-тентных клеток. Кроме того, у пациентов в период до операции отмечены нарушения синтеза ИФН-а в ответ на стимуляцию in vitro, хотя усиленного спонтанного синтеза ИФН-а по сравнению с контрольным уровнем не было обнаружено.

Необходимо отметить, что через 14 дней после хирургического лечения отмечается положительная динамика изменений параметров ИФН статуса, в частности повышаются резервные возможности мононуклеары периферической крови к выработке ИФН-у. Однако полного восстановления ИФНпродуцирующей системы не наблюдается. Установлено, что после удаления очага иммуносупрессии сохраняется повышенным уровень спонтанной продукции ИФН-у относительно контрольного диапазона.

На фоне относительного восстановления ИФН-у-продуцирующей системы, совершенно другая картина наблюдается при оценке изменений ИФН-а-продуцирующей системы. Выявлен пониженный по сравнению с параметрами в дооперационный период уровень спонтанной продукции ИФН-а. Кроме того, не смотря на увеличение уровня индуцированной продукции ИФН-а относительно параметров в группе больных ПКР до хирургического лечения, концентрация ИФН данного класса не достигает контрольного уровня. Таким образом, по результатам проведенных исследований можно констатировать дефицит продукции эндогенного ИФН-а у больных ПКР как до, так и через 14 дней после хирургического лечения, что дает основание для проведения иммунотерапии препаратами ИФН-а у данной категории больных.