Актуальность проблемы.
Нарушение функций холинергического отдела нервной системы лежит в основе или сопутствует возникновению многих патологических состояний, к которым можно отнести паркинсонизм (Werneck G., 1997; Яхно Н. Н., Нодель М. Р., 2000), болезнь Альцгеймера (Рамш С. М., Петров А. Н., 1999; Takada-Takatori Y. et al., 2007; McQuail J. A. et al., 2006; Keverne J. et al., 2005), некоторые нарушения сердечного ритма (Steve В., Mark Е. D., 1999; Giessler С. et al, 1999; Xiao-Li Xu et al., 2006), язвенную болезнь (Машковский M. Д., 2005), отравления антихолинэстеразными ядами (Прозоровский В. Б., Саватеев Н. В., 1976; Крылов С. С. и др., 1999; Куценко С. А., 2004) и другие виды патологии (Fukutake Т. et al., 1993).
В связи с этим, холинергические лиганды, в частности блокаторы мускариновых рецепторов (синонимы: М-холинолитики, М-холино-блокаторы), находят широкое применение в качестве лекарственных средств.
Среди лекарственных средств, применяемых для профилактики и коррекции экстрапирамидных расстройств, важное место принадлежит препаратам, обладающим центральной холиноблокирующей активностью (McEvoy J. P., 1983). Наибольшее распространение, в настоящее время, получило применение таких М-холиноблокаторов как тригексифенидил (циклодол, паркопан, артан, апо-трайгекс, трифен), а также очень близких по структуре и активности препаратов — трипериден (норакин) и бипериден (акинетон). Реже используются бенактизин (центральный холинолитик, обладающий наряду с транквилизирующим, спазмолитическим действием, имеющий синонимы — амизил, актозин, парасан и т. д.), дифенилтропин (тропацин), дексетимид (тремблекс). До 1989 года применялся также отечественный препарат амедин. До появления синтетических холинолитиков в клинике паркинсонизма использовали атропин и препараты красавки.
В основе терапевтического действия мускариновых антагонистов так же, как и при возникновении побочных реакций, лежит их взаимодействие со специфическими биологическими мишенями — М-холинорецепторами. Кроме того, необходимость длительного применения холинонегативных препаратов также приводит к развитию «нежелательных» эффектовв основном, речь идет о проявлениях их периферического антихолинергического действия. Таким образом, разработка новых лекарственных средств из указанной группы должна быть, прежде всего, направлена на поиск веществ, обладающих высокой эффективностью, наряду с их безопасностью.
В связи с этим, на определенном этапе развития лекарственной токсикологии противоречие, возникающее между высокой терапевтической активностью и переносимостью препаратов, считалось принципиально непреодолимым. В настоящее время взгляды на использование мускариновых антагонистов в терапевтических целях претерпели существенные изменения в связи с развитием представлений о гетерогенности мускариновых рецепторов. Согласно этому представлению, мускариновые рецепторы в организме животных и человека образуют гетерогенную популяцию, состоящую из 5 генетически обусловленных подтипов. Подтипы мускариновых рецепторов отличаются химическим строением, расположением на различных частях нейрона, особенностями тканевой локализации, системой вторичных посредников и др.
Одним из путей повышения эффективности и безопасности М-холинолитиков явилось создание селективных антагонистов. Эта задача достаточно успешно решалась для веществ, обладающих периферическим действием. Появились высокоэффективные противоязвенное (пирензепин) и бронхолитическое (атровент) средства. Однако, поиск центральных.
М-холинолитиков селективного действия пока серьезных результатов не принес. Причиной этого явилась фрагментарность сведений о распространенности подтипов М-холинорецепторов в мозге и их роли в организации его работы.
Поэтому для успешного поиска средств, обладающих необходимым профилем избирательности для лечения заболеваний, связанных с дисфункцией холинергической системы, необходимо изучение роли отдельных подтипов мускариновых рецепторов в механизмах развития патологии и особенностей влияния на них потенциальных лекарственных препаратов.
Целью настоящего исследования являлся поиск антипаркинсонических средств из числа ацетиленовых аминоспиртов на базе изучения профиля их избирательности в отношении отдельных подтипов мускариновых рецепторов.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести скрининг активности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов по их способности предупреждать развитие экстрапирамидных нарушений на модели нейролептического паркинсонизма.
2. Изучить профиль фармакологической избирательности соединений из ряда ацетиленовых аминоспиртов в сравнении с М-холиноблокаторами из других химических групп в экспериментах на крысах.
3. Разработать способы оценки активности мускариновых антагонистов в отношении Mt-холинорецепторов in vivo.
4. Определить роль блокады М^-холинорецепторов в осуществлении противопаркинсонической (антигалоперидоловой) активности соединений в опытах на крысах.
5. Оценить взаимодействие пентифина, соединения из ряда ацетиленовых аминоспиртов, с дофаминовыми и мускариновыми рецепторами в экспериментах in vitro и in vivo.
6. Сопоставить антипаркинсоническую активность М-холиноблокаторов с их влиянием на высвобождение ацетилхолина в стриатуме крыс.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Соединения из химической группы ацетиленовых аминоспиртов проявляют выраженную антипаркинсоническую («антигало-перидоловую») активность.
2. Блокада М-холинорецепторов играет значимую роль в антипаркинсо-нической («антигалоперидоловой) активности мускариновых антагонистов.
3. Соединение пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М4.
Научная новизна работы.
Настоящее исследование продолжает цикл работ, направленных на поиск препаратов, предназначенных для лечения паркинсонизма, а также на выяснение механизмов их лечебного действия. Новизна работы определяется тем, что в ней впервые установлена роль блокады М-холинорецепторов в лечебном действии препаратов при экспериментальном паркинсонизме. Впервые обнаружено выраженное избирательное Мгхолинолитическое действие у производных ацетиленовых аминоспиртов.
Выявлена связь между способностью соединений блокировать Мгхолинорецептор и их антипаркинсонической активностью. Доказана перспективность поиска новых антипаркинсонических средств среди холинолитиков, в частности производных ацетиленовых аминоспиртов.
Практическая значимость работы.
В ходе проведения исследования был разработан способ количественной оценки степени блокады холинорецепторов, принадлежащих к подтипу М*. Сочетание указанного способа с ранее разработанными приемами для оценки состояния Мр, М2- и Мз-холинорецепторов дало возможность оценить профили рецепторной избирательности ряда мускариновых антагонистов in vivo.
В ходе этих исследований были выявлены мускариновые антагонисты, проявляющие высокую избирательность в отношении М-холинорецепторов, принадлежащих к подтипу Mr и Mr. Соединения, проявляющие указанные свойства, могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения в качестве средств для лечения паркинсонизма.
На два таких соединения получены соответствующие патенты. Кроме того указанные соединения могут быть использованы в аналитических целях, как избирательные блокаторы МЦи Мг холинорецепторов.
Апробация диссертационного материала.
Основные положения работы доложены и обсуждены: на XVIII съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 2001; на XII Всероссийской конференции «Нейроиммунология», 2003; на 2-ом съезде токсикологов России, 2003; на конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты», 2004; на конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты», 2005; на 8th ECNP Regional Meeting «European Neuropsychopharmacology», 2005; на конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзиматические основы деятельности центральной нервной системы», 2006; на V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения», 2006; на Всероссийской конференции с международным участием.
Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга", 2006.
Материалы диссертации опубликованы в 19 печатных работах по материалам диссертации оформлено 2 патента на изобретение.
Работа выполнена в рамках программы МЗ РФ, шифр 024, «Разработка научных основ медицинского обеспечения химической безопасности населения России», 2001;2005 гг. и грантов РФФИ № 00−04−49 432, 2000;2002 гг. и № 0304−49 696,2002;2004 гг.
1. Обзор литературы.
Паркинсонизм — синдром, характеризующийся гипокинезией, ригидностью, тремором. Болезнь Паркинсона (БП) — представляет собой идиопатическое нейродегенеративное заболевание, обычно возникающее в среднем или пожилом возрасте (Northoff G. et al., 2000).
Этиологическими факторами могут служить как генетические нарушения, так и воздействие среды обитания — вирусные инфекции, интоксикация (тяжелые металлы, токсины), медикаментозное лечение (прием нейролептиков, резерпинсодержащих средств), атеросклероз сосудов головного мозга, тяжелые и повторные черепно-мозговые травмы (Tanner С. М. et al., 1999; Northoff G. et al., 2000; Denny-Brown D. et al., 1958; Tippen J., Dunner F. J., 1981; Howard R., 1989; Saver J. L. et al., 1993; Saposnik G. et al., 1999; Saposnik G. et al., 2001; Руководство по психотерапии, 1979).
Основными задачами лечения паркинсонизма являются:
1) подавление активности холинергической системы, направленное на восстановление баланса между дофамином и ацетилхолином;
2) повышение уровня дофамина до нормального, что также нацелено на восстановление баланса между уровнями дофамина и ацетилхолина.
Для воздействия на холинергическую систему применяют ряд соединений из различных химических групп, препятствующих возбуждению М-холинергического отдела центральной нервной системы. По мере развития заболевания холиноблокаторы применяются по разным показаниям. Так, на ранних этапах их применение корригирует дефицит дофамина, возникающий вследствие его пониженной выработки черной субстанцией, а на поздних — они применяются с целью коррекции избытка дофамина, возникающего как результат побочного действия его предшественника — леводопы. Как было отмечено во введении, в современной практике применяются следующие препараты: тригексифенидил, трипериден, бипериден, бенактизин, дифенилтропин. Из природных соединений в клинике длительное время использовали атропин и препараты красавки.
Для воздействия на состояние дофаминергической системы применяется ряд соединений различных химических групп, способствующих:
1) восполнению дефицита дофамина — леводопа, предшественник дофамина, проникающий, в отличии от дофамина, через гемато-энцефалический барьер;
2) увеличению биодоступности леводопы тканям ЦНС, за счет ингибирования в периферическом кровотоке катехол-О-метил-трансферазы — толкапон;
3) увеличению времени жизни дофамина в тканях мозга, за счет снижения активности МАО-В — селегилин;
4) непосредственному возбуждению рецепторов дофамина при использовании прямых агонистов дофамина — перголид, ропинирол, апо-морфин.
Эффективность терапии определяется как этиологическим фактором, обусловливающим возникновение паркинсонизма, так и стадией его развития. Наиболее распространенной является точка зрения о том, что современная терапия паркинсонизма (болезни Паркинсона) является средством улучшения качества жизни и не влияет на ее продолжительность (Stanley F. et al., 2004).
Выводы.
1. Соединения пентифин, CJ1−22, CJ1−23, CJI-28, из химической группы ацетиленовых аминоспиртов, проявляют выраженную антипаркинсоническую («антигалоперидоловую») активность, сопоставимую и, в отдельных случаях, превосходящую активность официнапыюго препарата циклодол. Наиболее выраженным «антигалоперидоловым» действием обладает соединение пентифин, превосходящее по галоперидоловому тесту циклодол в 17 раз.
2. На модели нейролептического паркинсонизма показано, что в организации нарушения деятельности экстрапирамидной системы ведущим фактором является возбуждение Мгподтипа холинорецептора. Эффективность блокады Мгхолинорецептора определяет способность лиганда оказывать корригирующее действие в условиях этой модели.
3. Эффективность М-холиноблокаторов в отношении экстрапирамидных нарушений в условиях нейролептического паркинсонизма обусловлена как их высокой фармакологической избирательностью к Mr холинорецептору, так и низкой избирательностью к Мг-подтипу холинорецептора.
4. Пентифин предотвращает значимое увеличение выброса ацетилхолина в области стриатума, вызванное введением галоперидола, что не наблюдается в случае коррекции экстрапирамидных нарушений неселективными холиноблокаторами.
5. Способность пентифина связываться с рецепторами различных медиаторных систем в экспериментах in vitro снижается в ряду: рецепторы мускариновой > адреналовой > дофаминовой систем. В экспериментах in vivo, с применением метода «открытого поля» и изучением параметров ориентировочного рефлекса, было выявлено отсутствие непосредственного влияния пентифина на дофамин-ергическую систему.
6. На основании проведенных фармакологических, тестов показано, что пентифин является избирательным блокатором мускариновых рецепторов, принадлежащих к подтипу М*.
Заключение
.
На базе Института Токсикологии д. х. н. профессором С. Г. Кузнецовым и д. х .н. Н. М. Либманом был синтезирован ряд химических соединений — лигандов группы ацетиленовых аминоспиртов и, к началу настоящего исследования, было известно, что некоторые соединения обладают.
W гтч U холинергическои активностью. Так, детальному рассмотрению свойств одного из ряда производных ацетиленовых аминоспиртов, пентифина, было посвящено исследование, в котором показано, что этот лиганд, обладающий слабовыраженными антихолинергическими свойствами является одним из наиболее активных среди известных препаратов, противодействующих проявлениям интоксикации нейролептиками (А. В. Храброва, 2001).
Из 21 изученного соединения, в тесте фармакологической избирательности к Мгподтипу холинорецептора, было отобрано 9 наиболее активных (СЛ-17, СЛ-18, СЛ-22, СЛ-23, СЛ-26, СЛ-28, СЛ-31, СЛ-32, пентифин). Анализ их эффективности в сравнении с холиноблокаторами из других химических групп проводили на общепринятой модели нейролептического паркинсонизма (галоперидоловая каталепсия). Среди них высокая активность по предупреждению каталепсии, сравнимая с применяющимся корректором экстрапирамидных нарушений циклодолом, отмечена у 4 соединений (СЛ-22, СЛ-23, СЛ-28, пентифин). При этом, активность соединений СЛ-17, СЛ-18, СЛ-26, СЛ-31, СЛ-32 в тесте каталепсии была значительно ниже активности неселективного холиноблокатора атропина. Отсутствие в исследованной группе соединений с промежуточными значениями фармакологической активности делит их на группы высокои низкоактивных веществ.
Анализ химического строенения высокактивных соединений выявил их особенности, которые заключаются в наличии определенных концевых радикалов и основной углеродной цепи. Обязательным является наличие фенольного кольца в положении первого атома углерода, а у концевого — пиперидинового остатка. Менее жесткие требования относятся к длине собственно углеродной цепочки (4−5 атомов углерода) и второму радикалу первого атома углерода — он должен являтся кольцевой структурой произвольной длинны. Соблюдение вышеперечисленных условий очевидно обеспечивает строго определенную конформацию молекулы, коррелирующую с ее высокой биологической активностью. Это положение хорошо иллюстрируется при сравнении структуры соединения CJI-17 и CJI-23 (введение метильной группы в радикал циклопентил увеличивает активность почти в 20 раз).
Гипотеза о наличии у пентифина значимого непосредственного влияния на рецепторы дофамина (А. В. Храброва и др., 2001), на основании собственных исследований in vitro и in vivo, не подтвердилась.
Анализ данных литературы позволил предположить, что ключевую роль в развитии экстрапирамидных нарушений играет М^-подтип мускаринового рецептора. Для выявления Мгизбирательных свойств была разработана методика оценки фармакологической избирательности холиноблокатора к Мгподтипу рецептора. Было выявлено, что способность холинолитиков нормализовать количество ДНЧ в условиях действия пилокарпина изменяется следующим образом: пентифин > CJI-23 > глипин > амедин > атропин.
На основе анализа эффективности ряда лигандов, обладающих холинергической активностью, было высказано предположение о профиле фармакологической избирательности, которым должен обладать холиноблокатор максимально эффективный в предупреждении развития экстрапирамидных нарушений, вызванных нейролептиком. Для проверки гипотезы о значении одновременной блокады различных подтипов холинорецепторов на способность ряда холиноблокаторов предупреждать развитие двигательных расстройств, с учетом уровня блокады каждого из подтипов (М1-М4) холинорецепторов, была построена регрессионная модель:
Y=2,99+0,16 х ((X3)3/Xi) + 0,03 х ((Х4)2/Х2) с высоким уровнем значимости по критерию Фишера (Р<0,001), где за Y принималась активность холиноблокатора по способности предупреждать развитие каталепсии, вызванной введением галоперидола. Модель предполагает включение рецепторов М4- и М2-подтипов в системы с антагонистическими свойствами. Блокада Мгхолинорецепторов противодействует развитию кататонического синдрома, а блокада М2- холинорецепторов не оказывает корригирующего действия, и, возможно, потенцирует развитие каталепсии.
Таким образом, применение математического анализа позволило построить модель, описывающую связь фармакологических свойств блокатора с эффективностю коррекции двигательных нарушений, вызванных блокадой Д2-рецепторов. Из анализа модели следовало, что определяющим фактором является способность препарата максимально блокировать Mr, при минимальном влиянии на М2-подтип рецептора. Оказалось, что в ряду обследованных холиноблокаторов именно у пентифина наиболее высока избирательность по отношению к Мгхолинорецептору. В этом ряду следующими стоят официнальные препараты — циклодол и амедин.
