Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии

Диссертация: Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Полученные антитела к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНП-связывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тест-системы определения… Читать ещё >

Содержание

  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Общая характеристика рецептора ЛНП
    • 1. 2. Мультидоменная структура рецептора ЛНП
    • 1. 3. Структурно-функциональная организация лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП
    • 1. 4. Структура гена РЛНП
  • ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. 1. Штаммы Е. coli, питательные среды, условия роста
    • 2. 2. Плазмидные векторы
    • 2. 3. Выделение плазмидной ДНК
    • 2. 4. Трансформация E. col
    • 2. 5. Гибридизация
    • 2. 6. Очистка рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, слитого с ß--галактозидазой
    • 2. 7. рЕТ система
      • 2. 7. 1. Индукция DE3 лизогенов
      • 2. 7. 2. Получение клеточного экстракта и белков культуральной среды для хроматографии на смоле His-Bind
      • 2. 7. 3. Подготовка смолы His-Bind и аффинная хроматография
    • 2. 8. Культивирование фибробластов человека линии НТ-1080 и получение клеточных лизатов
    • 2. 9. Получение антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену
  • РЛН человека
    • 2. 10. Денатурация и рефолдинг рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП
    • 2. 11. Оценка лиганд-связывающей активности рекомбинантного белка в иммунохимическом тесте на микроячеечных планшетах
    • 2. 12. Визуализация РЛНП в белках клеточных лизатов и рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП (с помощью и ммуноблоттинга и лигандного блоттинга)
      • 2. 12. 1. Иммуноблоттинг
      • 2. 12. 2. Лигандный блоттинг
    • 2. 13. Аналитические методы
  • ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
    • 3. 1. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии pUEX
    • 3. 2. Выделение рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде слитого белка
    • 3. 3. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии рЕТ
    • 3. 4. Выделение лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП в виде рекомбинантного индивидуального белка
    • 3. 5. Характеристика антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену рецептора ЛНП
    • 3. 6. Анализ функциональной активности рекомбинантного лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП
    • 3. 7. Исследование взаимодействия белков Escherichia coli с ЛНП человека
  • ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
  • ВЫВОДЫ
  • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Изучение структурно-функциональных отношений в мультидоменных белках клеточной поверхности, функционирующих как рецепторы специфических белковых или иных лигандов и участвующих либо в переносе веществ между клетками и внеклеточными пространствами, либо в передаче сигналов от внеклеточных лигандов, является одной из центральных проблем современной молекулярной медицины. Среди рецепторов, интернализирующих связанные лиганды, наиболее изучен рецептор липопротеинов низкой плотности (РЛНП). Прогресс в исследовании РЛНП связан, прежде всего, с классическими работами Голдштейна и Брауна (Brown, Goldstein, 1976, 1986; Goldstein, Brown, 1989), которые впервые описали РЛНП и показали, что одно из наиболее распространенных аутосомно-доминантных заболеваний человека — семейная гиперхолестеринемия обусловлена мутациями в гене РЛНП с гетерогенными биохимическими проявлениями (количественный дефицит РЛНП, нарушение его лиганд-связывающей активности, блоки интернализации комплекса РЛНП-лиганд и реутилизации РЛНП с его возвращением на поверхность клетки). В дальнейшем эти авторы и их сотрудники (Yamamoto et al., 1984) осуществили клонирование кДНК, кодирующей РЛНП, определили ее нуклеотидную последовательность и исследовали экзонно-интронную структуру гена РЛНП. На основании этих данных в разных странах, в том числе, в России, проведено изучение нарушений структуры мутантных аллелей гена РЛНП у больных с семейной гиперхолестеринемией (Мандельштам и др., 1995а, б, 1998; Chakir et al., 1998а, бMandelshtam et al., 1998), которое продемонстрировало множественность и гетерогенность этих мутаций (к настоящему времени описано более 300 мутаций гена РЛНП (Hobbs et al., 1992; Varret et al., 1997), в России — 8 мутаций). В то же время все представления о пространственной и мультидоменной структуре РЛНП основаны лишь на предсказаниях, базирующихся на сведениях об аминокислотной последовательности этого белка, и лишь в последние годы появились сообщения о прямом анализе трехмерных структур относительно коротких фрагментов РЛНП (цистеин-богатых повторов внеклеточного домена), изолированных в виде рекомбинантных белков — продуктов экспрессии соответствующих плазмид в клетках Escherichia coli (Bieri et al., 1995; Daly et al., 1995a, 6- Blacklow, Kim, 1996; Fass et al., 1997). В связи с этим мы предприняли попытку получить рекомбинантный белок со структурой и активностью полноразмерного лиганд-связывающего домена РЛНП человека. Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями: 1) для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лиганд-связывающего домена- 2) наличие индивидуального белкалиганд-связывающего домена РЛНП имеет существенное значение для выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этом домене- 3) на основе рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тест-система для изучения структурных аномалий ЛНП-частиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП- 4) лиганд-связывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лиганд-связывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные (как правило, N-концевые) фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов (Tomida et al., 1994; Han et al., 1994). Механизмы образования таких растворимых рецепторов in vivo могут быть разнообразными (ограниченный протеолиз со «слущиванием» внеклеточных фрагментов рецептора в среду, инициация транскрипции с альтернативных промоторов, альтернативный сплайсинг пре-мРНК, сдвиги рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др.). Рекомбинантные лиганд-связывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецептор-лиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и по последовательности аминокислот лиганд-связывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью (Fischer et al., 1993). В связи с этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоспецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме.

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимической специфичности и функциональной активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие этапные задачи исследования:

1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП, на основе векторов серий pUEX и рЕТ и плазмиды pLDLR-З, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП.

2. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках.

3. Разработка процедур выделения рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде гомогенного белка.

4. Получение антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека.

5. Оптимизация процедур восстановления-денатурации и рефолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНП-связывающей активностью.

Научная новизна работы.

Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лиганд-связывающий домен РЛНП человека — продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах Е. coli. Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановления-денатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности.

Практическая значимость работы.

Полученные антитела к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНП-связывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тест-системы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. 9.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Escherichia coli.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП препаративно выделен в виде электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам этого рекомбинантного белка (слитого с ß—галактозидазой и индивидуального), дающие перекрестную иммунологическую реакцию с природным РЛНП мембран клеток человека.

4. Для получения функционального активного рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, синтезируемого в клетках Escherichia coli, необходимо его восстановление, денатурация и последующий рефолдинг путем медленного диализа против кальций-содержащих буферных растворов. При этом происходит реконструкция специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности, первоначально не определяемой для исходного рекомбинантного белка.

ВЫВОДЫ.

1. На основе экспрессионных векторов pUEX2 и рЕТ22Ь (+) сконструированы рекомбинантные плазмиды, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Е. coli в виде слитого с ß—галактозидазой белка — pUEXL45 и индивидуального белка — рЕТЬЗЗ.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП выделен в виде индивидуального электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам рекомбинантного белка (слитого с бактериальной ß—галактозидазой и индивидуального), дающие иммунологическую реакцию с природным РЛНП плазматических мембран клеток человека.

4. Пространственная укладка рекомбинантного домена РЛНП в клетках Е. coli отличается от конформации природного белка.

5. Получен функционально активный индивидуальный белок рекомбинантного домена РЛНП путем его денатурации-рефолдинга методом медленного диализа против буфера, содержащего ионы кальция.

6. В клетках Е. coli впервые обнаружен белок с молекулярной массой 48 кДа, обладающий эффективной кальций-зависимой ЛНП-связывающей активностью.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А.Н., Никульчева Н. Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб: Питер Пресс, 1995.-304 с.
  2. Мандельштам М, Ю., Голубков В. И., Шур Ю. А., Липовецкий Б. М., Гайцхоки B.C. Новая мутация 347 delGCC в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека. // Биоорганическая химия. 1998. — Т. 24, № 10. — с. 797 — 800.
  3. Мандельштам М, Ю., Липовецкий Б. М., Шварцман А. Л., Гайцхоки B.C. Мультиэкзонная делеция в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека, как причина семейной гиперхолестеринемии. // Генетика. 1995а. — Т. 31, № 2. — с. 259 — 263.
  4. Мандельштам М, Ю., Липовецкий Б. М., Шварцман А. Л., Гайцхоки B.C. Молекулярная гетерогенность семейной гиперхолестеринемии в популяции жителей Санкт-Петербурга. // Генетика. 19 956. — Т. 31, № 4. — с. 521 — 527.
  5. Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ., М.: Мир, 1984. — 480 с.
  6. Н., Ингильд А. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу, VI. Получение антисывороток (ред. Н. Аксельсен, И. Крелль, Б. Вееке).М.: Мир, 1977. — с.200 — 205.
  7. Basu S.K., Goldstein J.L., Brown M.S. Characterization of the low density lipoprotein receptor in membranes prepared from humann fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. — vol. 253. — p. 3852 -3856.
  8. Beisiegel U., Schneider W.J., Brown M.S., Goldstein J.L. Immunoblot analysis of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from subjects with familial hypercholesterolemia // J. Biol. Chem. 1982. — vol.257, N21. -p.13 150- 13 156.
  9. Bieri S., Djordjevic J.T., Daly N.L. et al. Disulfide bridges of a cystein-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain // Biochemistry. 1995. — vol.34. — p. 13 059 — 13 065.
  10. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA // Nucl. Acid Res. 1979. — vol.7, N6. — p. l513 — 1524.
  11. Blacklow S.C., Kim P. S. Protein folding and calcium binding defects arising from familial hypercholesterolemia mutations of the LDL receptor // Nature Structural biology. 1996. -vol.3, N9. — p.758 — 762.
  12. Bressan G.M., Stanley K.K. pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal host specificity // Nucl. Acids Res. 1987. — vol.15, N23. — p.10 056.
  13. Brown M.S., Anderson R.G.W., Goldstein J.L. Recycling receptors: the round-trip itinerary of migrant membrane proteins // Cell. 1983. — vol. 32. — p. 663 — 667.
  14. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor-mediated control of cholesterol metabolism // Science. -1976. -vol.191, -p.150- 154.
  15. Brown M.S., Goldstein J.L. How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis // Sci. Amer. 1984. — vol. 251. — p. 58 — 66.
  16. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis // Science. 1986. — vol.232, N4746. — p.34 — 47.
  17. Brown M.S., Herz J., Goldstein J.L. Calcium cages, acid baths and recycling receptors // Nature. 1997. — vol.388. — p.629, 630.
  18. Catomeris P., Thibert R. J., Draisey T.F. Low-density lipoprotein binding assay using the calf adrenocortical low-density lipoprotein receptor. // Clinical Biochemistry. — 1994. vol. 27, N4. -p. 249−257.
  19. Chen W.-J., Goldstein J.L., Brown M.S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic tails is required for coated pitmediated internalization of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1990. — vol.265, N6. — p.3116 — 3123.
  20. Cummings R.D., Kornfeld S., Schneider WJ. et al. Biosynthesis of the N- and O-linked oligosaccharides of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1983. — vol.258. -p.15 261 — 15 273.
  21. Dagert V., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells // Gene. 1979. — vol.6, N1. — p.23 — 28.
  22. Daly N.L., Djordjevic J.T., Kroon P.A., Smith R. Three-dimensional structure of the second cysteine-rich repeat from the human low-density lipoprotein receptor // Biochemistry. 1995a. -vol.34.-p. 14 474- 14 481.
  23. Daly N.L., Scanion M.J., Djordjevic J.T. et al. Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor // Procced. Natl. Acad. Sei. USA 19 956. -vol.92. — p.6334 — 6338.
  24. Daniel T.O., Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Visualization of lipoprotein receptors by ligand blotting // J. Biol. Chem. 1983. — vol.258, N7. — p.4606 — 4611.
  25. Davis C.G., van Driel I.R., Russell D.W. et al. The low density lipoprotein receptor. Identification of aminoacids in cytoplasmic domain required for rapid endocytosis // J. Biol. Chem. 1987a. — vol.262, N9. — p.4075 — 4082.
  26. Davis C.G., Elhammer A., Russell D.W. et al. Deletion of clustered O-linked carbohydrates does not impair function of low density lipoprotein receptor in transfected fibroblasts // J. Biol. Chem. 1986a. — vol.261, N6. — p.2828 — 2838.
  27. Davis C.G., Goldstein J.L., Suedhof T.C. et al. Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region // Nature. 19 876. -vol.326, N6115. — p.760 — 765.
  28. Davis C.G., Lehrman M.A., Russell D.W. et al. The J.D. mutation in familial hypercholesterolemia: aminoacid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors // Cell. 19 866. — vol.45, N1. — p. 15 — 24.
  29. Esser V., Limbird L.E., Brown M.S. t al. Mutational analysis of the ligand-binding domain of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1988. — vol.263, N26. — p.13 282 — 13 290.
  30. Fass D., Blacklow S.C., Kim P. S., Berger J.M. Molecular basis of familial hypercholesterolemia from structure of LDL receptor module // Nature. 1997. — vol.388. -p.691 -693.
  31. Filipovic I. Effect of inhibiting N-glycosylation on the stability and binding activity of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1989. — vol.264, N15. — p.8815 — 8820.
  32. Fisher D.G., Tal N., Novick D., Barak S., Rubinstein M. An antiviral soluble form of the LDL receptor inducedby interferon. // Science. 1993. — vol. 262, N5131. — p. 250 — 253.
  33. Gilbert W. Genes-in-piece revisited // Science. 1985. — vol. 228, N4701. — p. 823 — 824.
  34. Goldstein J.L., Anderson R.G.W., Brown M.S. Coated pits, coated vesicles and receptor-mediated endocytosis // Nature. 1979. — vol. 279. — p. 679 — 685.
  35. Goldstein J.L., Basu S.K., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis of LDL in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. — vol. 98. — p. 241 — 260.
  36. Goldstein J.L., Brown M.S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis // Ann. Rev. Biochem. 1977. — vol. 46. — p. 897 — 930.
  37. Goldstein J.L., Brown M.S. The LDL-receptor and the regulation of cellular cholesterol metabolism // J. Cell Biochem. 1985. — suppl., N3. — p.131 -137.
  38. Goldstein J.L., Brown M.S. Familial hypercholesterolemia // In: The Metabolic Basis of Inherited Deseases / Eds. C.R.Scriver, A.L.Beaudet, W.S.Sly, D.Valle. N.Y., McGraw Hill, 6th Edn.- 1989.-p.1215 1250.
  39. Grunstein M., Hogness D. Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs, that contain a specific gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1975. — vol.72, N10. — p.3961 -3965.
  40. Han J., Mathison J.C., Ulevich R. J., Tobias P. Lipopolysacharide (LPS) binding protein, truncated at Ile-197, binds LPS but does not transfer LPS to CD14. // J. Biol. Chem. 1994. -vol.269, N 11. -p. 8172−8175.
  41. Herz J., Willnow T.E. Functions of the LDL receptor gene family // Ann. N.Y. Acad. Sei. -1994.-vol.737.-p.14−19.
  42. Hobbs H.H., Brown M.S., Goldstein J.L. Molecular Genetics of the LDL Receptor Gene in Familial Hypercholesterolemia // Human Mutation. 1992. — vol.1. — p.445−466.
  43. Hobbs H.H., Lehrman M.A., Yamamoto T., Russell D.W. Polymorphism and evolution of Alu sequences in the human low density lipoprotein receptor gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1985. — vol.82, N22. — p.7651 — 7655.
  44. Hobbs H.H., Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein // Annu. Rev. Genet. 1990. -vol.24.-p. 133 — 170.
  45. Kingsley D.M., Kozarskey K.F., Hobbie L., Krieger M. Reversible defects in O-linked glycosylation and LDL receptor expression in a UDP-Gal/UDP-GalNAc 4-epimerase deficient mutant // Cell. 1986. — vol.44. — p.749 — 759.
  46. Knott T.J., Rail S.C., Innerarity T.L. et al. Human apolipoprotein B: structure of carboxylterminal domains, sites of gene expression, and chromosomal localization // Science. -1985.-vol.230.-p.37−43.
  47. Kozarsky K.F., Kingsley D.M., Krieger M. Use of a mutant cell line to study the kinetics and function of O-linked glycosylation of low density lipoprotein receptors // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. — vol.85, N12. — p.4535 — 4539.
  48. Kyhse-Anderson J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from Polyacrylamide to nitrocellulose. // J. Biochem. And Biophys. Meth. 1984. — vol. 10. — p. 203 — 209.
  49. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. — vol.227, N5259. — p.680 — 685.
  50. Lehrman M.A., Goldstein J.L., Russell D.W., Brown M.S. Duplication of seven exones in LDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject with familial hypercholesterolemia // Cell. 1987a. — vol.48, N5. — p.827 — 835.
  51. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. vol.193, N1. — p.265 — 275.
  52. Maeda Y., Koga H., Yamada H. et al. Effective renaturation of reduced lysozyme by gentle removal of urea // Protein Engng.- 1995. vol.8, N2. — p.201 — 205.
  53. Maeda Y., Ueda T., Imoto T. Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G in vitro without assistance of chaperone // Protein Engng. 1996. — vol.9, N1. — p.95 — 100.
  54. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology // Science. 1988. — vol. 240. — p. 622 — 630.
  55. Mahley R.W., Innerarity T.L. Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis // Biochim. Biophys. Acta. 1983. — vol.737. — p. 197 — 222.
  56. Mahley R.W., Innerarity T.L., Rail S.C., Weisgraber K.H. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function // J. Lipid Res. 1984. — vol. 25. — p. 1277 — 1294.
  57. Mandel M., Higa A. Calcium deendent bacteriophage DNA infection. // J. Mol. Biol. 1970. -vol. 53.-p. 154.
  58. PCR technology. Principles and applications for DNA amplification. Ed. Erlich H. A. Stocktons New York and Mc Milan London, 1989. p. 7 — 16.73. pET system manual 3rd edition. Novagen, 1993. Medison, USA.
  59. Promega protocols and applications guide. Promega, 1990. p.40,41. — Medison, USA.
  60. Reed K.C., Mann D.A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes // Nucl. Acid Res. 1985. — vol.13, N20. — p.7207 — 7221.
  61. Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. Different combinations of cysteine-rich repeats mediate binding of low density lipoprotein receptor to two different proteins // J. Biol. Chem. -1989. vol.264, N36. — p.21 682 — 21 688.
  62. Russell D.W., Schneider W.J., Yamamoto T. et al. Domain map of the LDL receptor sequence homology with the epidermal growth factor precursor // Cell. 1984. — vol.37. — p.577 — 585.
  63. Russell D.W., Yamamoto T., Schneider W.J. et al. cDNA cloning of the bovine low density lipoprotein receptor: feed-back regulation of a receptor mRNA // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1983. — vol.80, N24. — p.7501 — 7505.
  64. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. — c.
  65. Schneider W.J. The low density lipoprotein receptor // Biochim. Biophys. Acta. 1989. -vol.988.-p.303 -317.
  66. Schneider W.J., Basu S.K., McPhaul M.J. et al. Solubilization of the low density lipoprotein receptor // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1979. — vol.76. — p.5577 — 5581.
  67. Schneider W.J., Beisiegel U., Goldstein J.L., Brown M.S. Purification of the low density lipoprotein receptor, an acidic glycoprotein of 164.000 molecular weight // J. Biol. Chem. -1982. vol.257. — p.2664 — 2673.
  68. Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Partial purification and characterization of the low density lipoprotein receptor from bovine adrenal cortex // J. Biol. Chem. 1980. — vol.255. -p.11 442- 11 447.
  69. Schneider W.J., Slaughter C.J., Goldstein J.L. et al. Use of anti-peptide antibodies to demonstrate external orientation of NH2-terminus of the LDL receptor in the plasma membrane of fibroblasts // J. Cell Biol. 1983. — vol.97. — p.1635 — 1640.
  70. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. — vol.98, N3. — p.503 — 517.
  71. Suedhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins // Science. 1985a. — vol.228, N4701. — p.815 — 822.
  72. Suedhof T.C., Russell D.W., Goldstein J.L. et al. Cassette of eight exons shared by genes for LDL receptor and IGF precursor // Science. 19 856. — vol.228, N4701. — p.893 — 895.
  73. Tolleshaug H., Goldstein J.L., Schneider W.J., Brown M.S. Posttranslational processing of the LDL receptor and its genetic disruption in familial hypercholesterolemia // Cell. 1982. -vol.30.-p.715−724.
  74. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozum M. Three different cDNAs encoding mouse D-factor/LIF receptor. // J. Biochem. 1994. — vol. 115. — p. 557 — 562.
  75. Varret M., Rabes J.P., Collod-Beroud G. et al. Software and database for the analysis ofmutations in the human LDL receptor gene // Nucl. Acids Res. 1997. — vol. 25. — p. 172 -180.
  76. Weisgraber K.H., Innerarity T.L., Mahley R.W. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. — vol.253. — p.9053 — 9062.
  77. Yamamoto T., Bishop R.W., Brown M.S. et al. Deletion in cysteine-rich region of LDL receptor impedes transport to cell surface in WHHR rabbit // Nature. 1986. — vol.232, N4755. -p.1230- 1237.
  78. Yamamoto T., Davis C.G., Brown M.S. et al. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell. 1984. — vol.39, N1. — p.27 — 38.108
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?