Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В настоящее время все компоненты инфекционного процесса претерпевают непрерывные и существенные изменения, как за счет широкого распространения врожденных и приобретенных иммунодефицитов, так и из-за приобретения микроорганизмами новых патогенных свойств.
Патогенные микроорганизмы обладают целым набором факторов, препятствующих воздействию на них защитных механизмов хозяина — факторов патогенности. Основной задачей патофизиологии при изучении инфекционного процесса является выяснение механизмов, лежащих в основе бактериальных инфекций, исследование взаимодействия в системе возбудитель-макроорганизм, а также выяснение механизмов бактериальной патогенности с последующим практическим применением полученных знаний для разработки методов диагностики, лечения и профилактики заболевания.
Последние десятилетия ознаменовались значительными успехами в области молекулярной генетики микроорганизмов, что позволило с новых позиций подойти к изучению взаимодействия в системе паразит-хозяин. Особый интерес в этом плане представляют собой представители рода Yersinia. Патогенные представители этого рода являются близкородственными (степень генетического родства между Y. pseudotuberculosis и Y. pestis составляет 80% при 100% гомологии по плазмиде вирулентности), однако клинически заболевания протекают различно. Недавнее открытие у представителей рода Yersinia способности к III типу секреции изменило представление о данных микроорганизмах как об исключительно внутриклеточных патогенах [Anderson D.M., Schneewind О., 1999]. Полученные данные не согласуются с традиционными представлениями о патогенезе псевдотуберкулеза. Интенсивно изучается стратегия выживания данных бактерий в макроорганизме и процессы адаптации, позволяющие Yersinia преодолевать защитные механизмы хозяина. До сих пор остается не ясным влияние биологических свойств возбудителя, в частности его плазмидного спектра, способности к продукции суперантигена и других факторов патогенности, на молекулярные механизмы патогенеза псевдотуберкулеза, а также клинические особенности течения заболевания.
У различных штаммов Y. pseudotuberculosis описано 11 типов плазмид с молекулярной массой от 2 до 82 MDa, наиболее постоянными являются плаз-миды pYV 42−48 и pVM 82 MDa, что позволило Ф. Н. Шубину с соавт. [1989] отнести их к категории основных, а остальные — к дополнительным. В литературе широко освещается вопрос о роли плазмиды pYV 42−48 MDa в патогенности рода Yersinia. В частности, именно с этой плазмидой связывают способность Y. pseudotuberculosis к III типу бактериальной секреции, синтезу эффек-торных белков Yops, определяющих устойчивость к фагоцитозу и осуществляющих запуск апоптоза макрофагов [Cornelis G. et al., 1998; Hueck C. et al., 1998]. Роль остальных плазмид остается недостаточно ясной. Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 MDa, обнаруживаемая только у Y. pseudotuberculosis I серовара, который наиболее часто служит причиной заболевания у человека, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia.
В последнее время появились сообщения о способности штаммов Y. pseudotuberculosis, несущих плазмиду pVM 82 MDa, оказывать иммуносуп-рессивное действие [Волков JI.B. и др., 1991; Север И. С. и др., 1991; Север И. С., 1996], однако в доступной литературе нами обнаружены лишь единичные попытки связать наличие данной плазмиды в бактериальной клетке с морфологическими и клиническими особенностями течения псевдотуберкулеза.
Течение инфекционного процесса, степень тяжести и многообразие клинической симптоматики в значительной мере обусловлены иммуногенностью возбудителя. Клиническая картина и особенности течения инфекционных заболеваний напрямую зависят от уровней продукции прои противовоспалительных цитокинов и их влияния на иммунорегуляторные и эффекторные иммунные механизмы. В настоящее время доказана ведущая роль провоспа-лительных цитокинов и баланса их с антагонистами в выраженности и направленности системной воспалительной реакции [Ковальчук J1.B. и др., 1997; Кетлинский С. А. и др., 1999; Кирдей Е. Г., 2000]. Однако в литературе недостаточно освещены вопросы цитокинопродукции при псевдотуберкулезе.
Недавно у Y. pseudotuberculosis установлена способность синтезировать суперантиген [Yoshino К. et al., 1994; Ito Y. et al., 1995]. Ранее считалось, что бактериальные суперантигены синтезируются только грамположительными кокками, такими как Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит, болезнь Крона, острая почечная недостаточность в результате острого интерстициального нефрита и синдром Кавасаки [Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al., 1985; Saari K. et al., 1986; Davenport et al., 1987; Baba K. et al., 1991]. Открытие способности к синтезу суперантигена позволяет пересмотреть механизм появления некоторых патологических симптомов при псевдотуберкулезе.
Исходя из вышесказанного, представляет большое практическое и теоретическое значение изучение роли генетических элементов бактерий Y. pseudotuberculosis, а также их влияние на течение инфекционного процесса и клинические проявления заболевания.
Цель исследования: раскрыть неизвестные ранее патогенетические механизмы формирования псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с различным плазмидным спектром и на этой основе обосновать принципы ранней клинической и лабораторной диагностики заболевания.
Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Изучить закономерности развития морфологических изменений внутренних органов экспериментальных животных при заражении Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
2. Выяснить особенности циркуляции Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa в организме экспериментальных животных.
3. Установить особенности клинической картины псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
4. Оценить цитокиновый ответ (IFN-a, IL-1, IL-6, TNF-a) культуры клеток цельной крови человека под воздействием липополисахарида, суперантигена YPMa и различных штаммов Y pseudotuberculosis.
5. Разработать концептуальную схему включения патогенетических механизмов развития псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
6. Оценить целесообразность применения полимеразной цепной реакции с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза в очагах, обусловленных циркуляцией Y. pseudotuberculosis с плазмидами 82:47 MDa.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Наличие у возбудителя псевдотуберкулеза плазмиды с молекулярной массой 82 MDa определяет большую скорость распространения возбудителя и тяжесть патоморфологических изменений в организме экспериментальных животных.
2. Для заболевания, обусловленного Y. pseudotuberculosis (47 MDa), характерно легкое и среднетяжелое течение, частое развитие экзантемы.
Для патологического процесса, вызванного Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), типично среднетяжелое и тяжелое течение, вовлечение в патологический процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, развитие артралгий.
3. Под действием штаммов Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) происходит угнетение продукции провоспалительных иммуноцитокинов (IL-1, IL-6, TNF-cx) и IFN-a культурой клеток цельной крови доноров, позднее формирование иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки экспериментальных животных, замедленное развитие гуморального иммунного ответа у больных, что свидетельствует о сниженной иммуногенности штаммов, несущих плазмиду с молекулярной массой 82 MDa.
4. Обоснована целесообразность использования полимеразной цепной реакции с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза и разработана концептуальная схема включения патогенетических механизмов развития заболевания, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis с плазмидами 47 MDa и 82:47 MDa.
Научная новизна:
Получены новые данные о патогенезе псевдотуберкулеза. Проведенные исследования расширили представления о факторах патогенности Y. pseudotuberculosis и формировании иммунологической реактивности под влиянием штаммов возбудителя псевдотуберкулеза с различным плазмидным спектром.
Установлено, что Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) обладает большей скоростью распространения в организме экспериментальных животных и вызывает более тяжелые патоморфологические изменения в кишечнике, печени и селезенке, чем Y. pseudotuberculosis (47 MDa).
Новыми являются данные о том, что заболевание, обусловленное штаммами Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) протекает тяжелее и характеризуется большей частотой вовлечения в патологический процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, селезенки и суставов, чем обусловленное Y. pseudotuberculosis (47 MDa).
Впервые выявлен механизм влияния криптической плазмиды pVM 82 MDa на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе, заключающийся в замедленном развитии иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки экспериментальных животных, снижении выработки специфических антител против возбудителя заболевания, угнетении продукции иммуно-цитокинов (IFN-a, IL-1, IL-6, TNF-a) культурой клеток цельной крови доноров.
Впервые на модели культуры клеток цельной крови доноров исследован вклад отдельных факторов патогенности возбудителя псевдотуберкулеза (суперантигена YPMa, липополисахаридаУ. pseudotuberculosis) в воздействии на выработку провоспалительных иммуноцитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a) и IFN-a. Доказано, что наибольшим потенциалом в воздействии на продукцию иммуноцитокинов обладает суперантиген YPMa Y. pseudotuberculosis.
Показано, что суперантиген YPMa и плазмиды pYV и pVM, действуя через изменение продукции цитокинов, являются существенными факторами патогенности Y. pseudotuberculosis.
На основании проведенного исследования разработана концептуальная схема патогенеза псевдотуберкулеза.
Доказана недостаточная эффективность традиционных методов диагностики псевдотуберкулеза (бактериологический анализ, РНГА) в очагах, обусловленных Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa). Обоснована высокая эффективность исследования испражнений больных методом ПЦР с целью ранней диагностики псевдотуберкулеза в очагах, вызванных циркуляцией Y. pseudotuberculosis с плазмидами 82 и 47 MDa.
Теоретическая и практическая ценность.
На основании экспериментальных и клинических исследований установлены принципиально различные механизмы формирования псевдотуберкулеза, распространения возбудителя в организме и закономерности морфологических изменений внутренних органов при псевдотуберкулезе, вызванном штаммами Y. pseudotuberculosis 47 MDa и 82:47 MDa. На этой основе разработана схема включения патогенетических и саногенетических механизмов развития псевдотуберкулеза и обоснована целесообразность применения ПЦР с целью ранней диагностики заболевания в очагах, обусловленных штаммами Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa).
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского «Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний», г. Москва, 1991 г.- на конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», г. Иркутск, 1993 г.- на заседаниях Иркутской региональной ассоциации врачей-инфекционистов, г. Иркутск, 1993, 1995, 2000, 2003 г.- на научной конференции сотрудников медико-профилактического факультета, посвященной 75-летию образования Иркутского государственного медицинского института, г. Иркутск, 1995 г.- на IV русско-японском международном симпозиуме, г. Иркутск, 1996 г.- на второй международной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», г. Новосибирск, 2002 г.- на семинаре для медицинских работников г. Иркутска по клинике, диагностике, эпидемиологии и профилактике иерсиниозов, 2002 г.- на научно-практической конференции «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения», г. Иркутск, 2003 г.- на научно-практической конференции, посвященной 80-летию кафедры инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета, г. Иркутск, 2003 г.- на совместном заседании обществ патофизиологов и иммунологов г. Иркутска, 2003 г.
Внедрение результатов исследований.
Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Иркутского государственного медицинского университета, в лечебной практике городской инфекционной больницы г. Иркутска. Метод ПЦР-диагностики псевдотуберкулеза внедрен в практику работы городской инфекционной больницы г. Иркутска. Материалы диссертации вошли в методическое пособие для инфекционистов, врачей поликлинических учреждений, эпидемиологов «Псевдотуберкулез. Клинико-эпидемиологичес-кие особенности и тактика обследования больных», изданное Центром Госсанэпиднадзора по Иркутской области и Комитетом здравоохранения администрации Иркутской области (Иркутск, 2003 г.).
Разработан способ определения цитокинопродуцирующей способности штамма возбудителя (заявка на изобретение № 2 001 119 710/14 (20 834) «Способ определения цитокинопродуцирующей способности штамма возбудителя» И. А. Шурыгина, А. В. Воропаев, В. Т. Климов, И. В. Малов, Е. Г. Кирдей. Приоритет от 16 июня 2001 г.), позволяющий оценивать иммуногенность возбудителей инфекционных заболеваний.
По теме диссертации опубликована 41 работа.
Объем и структура диссертации.
Работа изложена на 269 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, 3 глав собственного наблюдения, заключения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 58 рисунками и 27 таблицами, семью выписками из историй болезни. Список источников литературы включает 458 работ, из которых 180 работ отечественных и 278 — зарубежных авторов.
Работа выполнена на базе лаборатории кафедры инфекционных болезней ИГМУ (зав. каф. д.м.н., профессор И.В. Малов), отдела электронной микроскопии Центральной научно-исследовательской лаборатории Иркутского государственного медицинского института (зав. отд. д.м.н. проф. И.Ж. Се-минский), лаборатории эпидемиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. А.С. Марамович) и лаборатории патофизиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. Е.П. Голубинский) Научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (директор д.м.н., проф. Е.П. Голубинский), МУЗ городской инфекционной больницы г. Иркутска (главный врач Л.И. Губанова), МУЗ городской инфекционной больницы г. Ангарска, инфекционных отделений ЦРБ г. г. Железногорска-Илимского, Усть-Илимска, Тулуна.
выводы.
1. Морфологические изменения в тонком кишечнике, печени и селезенке у животных, инфицированных штаммом возбудителя, имеющим плазмиду 82 MDa, появляются в более ранние сроки и ярче выражены, чем у инфицированных штаммом возбудителя, не имеющим данной плазмиды. Наличие у возбудителя псевдотуберкулеза плазмиды 82 MDa ведет к позднему развитию иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки.
2. Скорость распространения Y. pseudotuberculosis в организме экспериментальных животных зависит от плазмидного спектра возбудителяналичие у микроорганизма криптической плазмиды pVM 82 MDa ведет к быстрой диссеминации возбудителя.
3. Клинические проявления псевдотуберкулеза зависят от плазмидного спектра возбудителя, обусловившего заболеваниезаболевание, вызванное штаммами Y. pseudotuberculosis, имеющими плазмиду 82 MDa, характеризуется более выраженными симптомами интоксикации, частым вовлечением в процесс органов желудочно-кишечного тракта, печени, возникновением артралгий в острый период заболевания, а также редким развитием экзантемы, чем связанное с Y. pseudotuberculosis (47 MDa).
4. При спорадическом уровне заболеваемости в основном регистрируются больные с наиболее типичными формами заболевания, при этом наблюдается гиподиагностика локализованных и вторично-очаговых форм заболевания.
5. У больных псевдотуберкулезом на первой неделе заболевания имеется дисбаланс в уровнях продукции цитокинов по сравнению с донорами: на фоне пониженного уровня IFN-a уровень провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6 и TNF-a) повышенк стадии реконвалесценции.
3 неделя) соотношение в продукции цитокинов выравнивается, однако сохраняется гиперпродукция IL-1.
6. Штамм Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa) индуцирует меньшую продукцию IFN-a и провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6 и TNF-a) культурой клеток цельной крови доноров, чем штаммы иерсиний, не имеющие плазмиды pVM 82 MDa. Максимальная выработка IFN-a и провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6 и TNF-a) происходит под действием суперантигена YPMa Y. pseudotuberculosis.
7. Применение РН ГА для диагностики псевдотуберкулеза в очагах, обусловленных Y. pseudotuberculosis (82:47MDa), ограничено в связи с поздним образованием антител у лиц, перенесших заболевание.
8. Штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие плазмиду с молекулярной массой 82 MDa, обладают сниженной иммуногенностью, что подтверждается большей скоростью распространения возбудителя, поздним формированием иммуноморфологических изменений в белой пульпе селезенки экспериментальных животных, угнетением продукции провоспалительных иммуноцитокинов (IL-1, IL-6, TNF-a) и IFN-a культурой клеток цельной крови доноров, замедленным развитием гуморального иммунного ответа у больных.
9. Внедрение в клиническую практику метода ПЦР, особенно в очагах, обусловленных Y. pseudotuberculosis (82:47MDa), позволяет значительно эффективнее в ранние сроки подтверждать диагноз при псевдотуберкулезе, что приводит к сокращению времени пребывания больного в стационаре.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. При обследовании и лечении больных псевдотуберкулезом необходимо учитывать сниженную иммуногенность штаммов Y. pseudotuberculosis (82:47 MDa), что определяет поздний антительный ответ при заболевании.
2. Широко внедрить в практику диагностики псевдотуберкулеза метод ПЦР.
3. При исследовании методом ПЦР необходимо учитывать, что наиболее информативным субстратом являются испражнения больного во все периоды болезни, исследование крови рационально проводить в острый период заболевания на фоне повышения температуры тела, а также при развитии рецидивов и затяжном течении псевдотуберкулеза.
