Микрокапсулы на основе природных полиэлектролитов для включения биологически активных веществ

Существует большое разнообразие как синтетических, так и природных полимерных систем для изучения контролируемого высвобождения биологически активных веществ и получения систем направленной доставки лекарств (DDS) [71]. Разработка и изучение новых надмолекулярных образований является одним из направлений интенсивно развивающихся нанотехнологий. К надмолекулярным образованиям относятся, в том числе, такие коллоидные частицы, как микрокапсулы, которые находят применение в различных областях прикладной химии, биохимии и фармакологии.

В 1998 году группой исследователей Института Макса Планка был предложен новый способ получения микрокапсул — послойная (Layer-by-Layer) электростатическая самосборка (Electrostatic Self-Assembly) противоположно заряженных полиэлектролитов на коллоидных частицах микронных и субмикронных размеров [31, 28]. Данная технология позволяет получать микрокапсулы определенной формы и размера, зависящих от используемых матриц-ядер. Оболочка микрокапсул обеспечивает требуемые каталитические или аффинные свойства, стабильность, проницаемость, совместимость и регулирование высвобождения внутреннего материала капсулы.

Микрокапсулы, имеющие размер от нескольких десятков нанометров до микрометра, со стенками нанометровой толщины представляют как научный, так и технологический интерес, поскольку могут использоваться как новый перспективный тип микрои наноконтейнеров для решения различных задач. В частности, включение белков и нуклеиновых кислот в многослойные пленки может найти применение в биотехнологии, например, в качестве средства доставки внутрь клеток ДНК и белка для получения вакцин и в генной терапии.

Данная технология микрокапсулирования, однако, до настоящего времени отрабатывалась только на микрокапсулах, состоящих из синтетических полиэлектролитов. Получение при помощи послойной сборки микрокапсул на основе природных материалов не было описано и изучено. В связи с этим, представляется актуальной разработка технологии получения микрокапсул методом LbL ESA на основе биополимеров и изучение свойств полученных капсул.

Представленная работа является частью исследований, проводимых в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова на кафедре биотехнологии по теме «Синтез новых фармакологически активных веществ, изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» (регистрационный номер НИР: 1Б-5−866), а также в Государственном научном центре по антибиотикам по теме «Разработка новых лекарственных форм известных биологически активных веществ».

Часть работы выполнялась в Институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (Потсдам, Германия) в отделении «Поверхности», отделе «Полые капсулы» в группе «Полифункциональные микрои нанокапсулы» под руководством к.ф.-м.н. Сухорукова Г. Б. в рамках программы «Софья Ковалевская», финансируемой фондом Александра Гумбольдта Министерства образования и исследований Германии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Микрокапсулирование — это процесс заключения различных веществ в микрокапсулы, надмолекулярные образования, представляющие собой емкость диаметром от сотен нанометров до нескольких микрометров.

Заключенное в микрокапсулу вещество защищено от внешних воздействий, что обуславливает перспективность применения микрокапсулирования в медицине. Варьируя в широких пределах материал микрокапсул, толщину стенок и другие характеристики, возможно четкое регулирование скорости высвобождения, места всасывания и фармакокинетики лекарственных веществ, что позволяет снижать их травмирующее влияние на слизистые в случае неинъекционных форм. Помимо этого, значительно снижается острая токсичность ряда веществ, повышается их стабильность, пролонгируется действие. Система позволяет связывать антитела с поверхностью микрокапсулы и за счет этого осуществлять адгезию последней к органу-мишени или клетке. Благодаря субмикронным размерам, микрокапсулы используются, к примеру, в противоопухолевых препаратах для химиоэмболизации цитостатиками [73].

В микрокапсульных препаратах можно совмещать реагирующие или несмешивающиеся друг с другом вещества, маскировать их неприятный запах и вкус. Также микрокапсулированием достигается «превращение» жидкостей в псевдотвердое состояние, т. е. в сыпучую массу, состоящую из микрокапсул с твердой оболочкой, заполненных, например, жидкими лекарственными веществами [74].

В зависимости от морфологических особенностей можно различить полые и сплошные микрокапсулы. В липосомах, состоящих из амфифильных молекул, внутренний объем и внешняя среда гидрофильны, в то время как стенки мембраны липофильны. Надмолекулярные образования, получаемые коацервацией гидрофильных, ионогенных полимеров, в большинстве своем, не имеют очерченного стенками внутреннего объема, активное вещество распределено равномерно по всему объему.

В 1998 году группой исследователей в институте Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей в Германии был предложен новый тип полифункциональных микрокапсул, состоящих из ядра и оболочки, способ получения которых позволяет конструировать как внутренний объем, который может отличаться от внешней среды, так и состав стенок.

Данный обзор посвящен этому новому перспективному нанотехнологическому методу микрокапсул про вами я, основанному на пошаговом формировании оболочки путем адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на различных матрицах микронных н субмикронных размеров. В нем рассматриваются недавно опубликованные работы по способам получения оболочек на различных коллоидных ядрах, изготовлению и свойствам полых капсул, регулирования проницаемости капсульной стенки и методам включения различных материалов в эти капсулы.

выводы.

В результате проведенной работы:

1. Разработан новый метод получения микрокапсул из альгината, протамин сульфата, декстрана и хитозана на основе послойной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов.

2. Проведен анализ существующих матриц для получения полых микрокапсул из природных полимеров, и синтезированы новые ядра из карбоната марганца.

3. Изучена проницаемость стенок полученных микрокапсул для низко-и высокомолекулярных соединений и гидрофобных растворителей.

4. Разработаны методы визуализации микрокапсул при помощи рентгеноконтрастных частиц серебра и флуоресцентных полупроводниковых нанокристаллов.

5. Разработаны методы включения в микрокапсулы белков и ДНК, и исследован фагоцитоз таких капсул антигенпредставляющими клетками.

Благодарности.

Автор выражает благодарность руководителю группы «Полифункциональные микрои нанокапсулы» Института Макса Планка коллоидной химии и химии поверхностей (г. Потсдам, Германия) Г. Б. Сухорукову за оформление стажировки, руководство и помощь в освоении метода послойной адсорбции, а также его сотрудникам О. Тюриной, И. Радченко, А. Антипову, Д. Шеною и Р. Георгиевой за неоценимые консультации в проведении экспериментов.

Выражаю благодарность моим научным руководителям проф. Василенко И. А., Сухорукову Г. Б., а также Марквичевой Е. А., Скляренко А. В., Курочкиной В. Б., Вагановой О. А., Дубовским П. В. и С.И., Гапонику Н. П., Моя С. и Радченко И. за помощь в решении научных проблем и подачу новых идей, положенных в основу представленной работы.

Часть экспериментов была проведена при помощи и сотрудничестве Dr. Й. Хартмана (ТЭМ, СЭМ и EDX), к.х.н. Щукина Д. (СЭМ), А. Хайлиг (АСМ, КЛСМ), Феофанова А. В., м.н.с. группы оптической спектроскопии ИБХ РАН Шаронова Г. В. (KJICM), Добровольского Н. А. (рентгенография), Федутика Ю. А. (получение ядер из карбоната марганца) и к.х.н. Свирщевской Е. В. (проточная цитофлуориметрия, иммунная активность), которым я искренне признательна.

Выражаю искреннюю благодарность моей маме и сыну за терпение и понимание, а также к.х.н. Мироновой Е. В. за неоценимые консультации и поддержку в период выполнения работы.

8.

Заключение

.

Суммируя вышесказанное, нельзя не отметить широкие возможности технологии послойной адсорбции полиэлектролитов на коллоидных частицах. Универсальность, простота и эксплуатационная гибкость — привлекательные особенности данной отрасли нанотехнологии. На рисунке 15 показаны возможные перспективные области применения данного способа микрокапсулирования.

Рисунок 15. Схематическое изображение многофункциональности микрокапсул.

В сформированные полые оболочки можно ввести люминесцентные полупроводниковые наночастицы для идентификации, визуализации и обнаружения микрокапсул в исследованиях in vitro и in vivo. Инкапсулированные магнитные частицы позволяют воздействовать на микрокапсулы извне, в частности, при помощи магнитного поля возможна доставка таких капсул к определенной клеточной культуре/ткани. Микрокапсулы можно использовать как средство доставки лекарственных веществ или ферментов для ускорения специфических реакций внутри клетки. Внешняя стенка может быть функционализирована рецепторами или антителами для нацеливания на молекулярном уровне.

В качестве исходной матрицы для получения оболочек могут быть использованы органические и неорганические частицы, нанокристаллы лекарственных веществ, биологические клетки, белковые агрегаты, фактически, любые коллоидные частицы, размером от 50 нм до десятковмикрон. Оболочка также может быть составлена из разнообразных материалов.

Существует, по крайней мере, два подхода для формирования оболочек. В случае техники послойной адсорбции, необходимо наличие пары противоположно заряженных полиэлектролитов. Их чередуемая адсорбция приводит к образованию оболочки с определенной толщиной, композицией и, следовательно, такими свойствами, как избирательная проницаемость, контролируемая доставка и высвобождение заключенных БАВ, биодеградация, биосовместимость, стабильность. Другим способом является техника контролируемого осаждения полимеров на поверхности (SCP), с помощью которой возможно за один цикл нанесения получить оболочку толщиной в 20 полиэлектролитных слоев.

Выборочная проницаемость оболочки обуславливает возможное использование капсул в качестве микроконтейнеров для хранения и транспортировки макромолекул. По сравнению с достаточно хорошо изученными за последние 40 лет липосомами, многослойные капсулы из полиэлектролитов имеют более высокую стабильность. Кроме того, технология их получения предоставляет большие возможности для манипулирования внутренним объемом, размером, составом оболочек и т. д.

Различные способы включения макромолекул, приводящие к разной степени загрузки, составу и физико-химическим свойствам включаемых веществ также привлекают интерес со стороны биотехнологов. Так, многообещающим приложением этой технологии может быть изготовление полимерной оболочки на поверхности компактной формы ДНК для моделирования вирусов. Закрепление на поверхности оболочки рецепторов привело бы к возможности направленной доставки.

Кроме того, микрокапсулы, полученные LbL ESA, могут быть использованы в качестве микрореакторов, что является важной областью исследований в ферментативном катализе. Фундаментальные аспекты исследования этих капсул, представляющих уникальную систему для изучения химических и физических явлений в микронном и субмикронном масштабе, определяют направление исследований в прикладной химии и биологии.

На основании анализа литературных данных можно сделать вывод, что микрокапсулы, получаемые на основе описанной технологии, могут быть использованы для решения различных задач, стоящих перед современной биотехнологией. Эксплуатационная гибкость описанного микрокапсулирования стимулирует дальнейшее его исследование и развитие.

В литературе не описано получение микрокапсул из биополимеров, которые могли бы быть биосовместимыми. Применение на всех стадиях получения микрокапсул биосовместимых материалов расширяет возможности использования микрокапсул в медицинской биотехнологии.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Представленный обзор литературных данных свидетельствует о том, что нанотехнология является интенсивно развивающейся отраслью науки с многообещающими перспективами воплощения результатов исследований в практической деятельности.

Возможность создавать различные по составу и форме надмолекулярные структуры описанным способом микрокапсулирования стимулирует дальнейшее его исследование и развитие.

1. Разработка методов получения микрокапсул.

Существующие методы микрокапсулирования имеют ряд недостатков, связанных с высокой полидисперсностью и большим размером частиц-носителей, а также неконтролируемой степенью загрузки активным компонентом [78]. В 1998 году был предложен новый метод получения микрокапсул, основанный на поочередной адсорбции противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов на коллоидных частицах. В случае разрушения коллоидной матрицы при условиях, в которых полимерная оболочка стабильна, образуется полая капсула определенного размера, формы и с требуемой толщиной стенки, обладающей необходимыми свойствами.

Для решения прикладных биотехнологических задач в настоящей работе было предложено использовать данную технологию для создания микрокапсул из биополимеров с различными способами включения БАВ.

1.1. Подбор полиэлектролитов.

Необходимым условием образования капсульной стенки способом послойной адсорбции, как упоминалось в обзоре литературы, является наличие заряда у используемых материалов.

Задачей настоящей работы было получение микрокапсул на основе биополимеров, которые в дальнейшем могут быть использованы в качестве средств доставки БАВ. Понятие биосовместимости включает в себя биотолерантность и биоинертность. Одним из подходов получения «биосовместимых» микрокапсул является использование в качестве исходных компонентов веществ, разрешенных к применению в лекарственных препаратах.

Таким образом, из существующего в природе разнообразия заряженных полимеров, таких как полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и т. п., в настоящей работе были использованы полимеры, лекарственные препараты на основе которых внесены в действующие фармакопеи США, Европы и Российской Федерации и разрешены к применению (см. таблицу 1).

В качестве положительно заряженного полиэлектролита впервые использовался протамин сульфат (Prot) — полипептид, выделяемый из икры лососевых рыб (сальмин). Данный гемостатик, являющийся одновременно слабым антикоагулянтом, используется в хирургии для нейтрализации свертываемости крови за счет образования стабильных комплексов протамин сульфата с гепарином [106, Т1. стр. 476].

Примерно 67% аминокислотного состава протамина составляет аргинин, который делает его сильно щелочным поликатионным веществом с молекулярным весом приблизительно 5 кДа [101].

Оптимальные толщина слоя и равномерность покрытия были достигнуты при адсорбции протамина из раствора в концентрации 2 мг/мл, содержащего 0,5 М NaCl.

Кроме протамин сульфата в качестве поликатиона также использовался низкомолекулярный хитозан (Chit) — поли-Э-глюкозамин, получаемый из хитина [108, стр.656] путем 75−85%-ного деацетилирования. Этот уникальный биополимер, называемый многими веществом XXI века, активно исследуется в России последние десятилетия [109−112]. Хитозан используется в медицине как БАВ, обладающее гиполипидемическими свойствами [106, Т1. стр.453−461].

Низкомолекулярный хитозан (вязкость по Брукфильду 1% раствора в 1% уксусной кислоте составляет 20−200 сантипуаз, плотность 0.22) растворим в разбавленных водных растворах кислот (рН < 6.5). Оптимальные толщина слоя и равномерность покрытия были достигнуты при адсорбции низкомолекулярного хитозана из раствора в концентрации 1 мг/мл, содержащего 0,5 М NaCl.

Чем меньше молекулярная масса хитозана, тем выше значение рН его раствора [110]. В экспериментах по включению белка в микрокапсулы использовался в качестве поликатиона олигохитозан (o-Chit) (MW 4437), предоставленный A. Bartkowiak (Институт полимеров Технического университета г. Щецин, Польша), являющийся продуктом химической деструкции коммерческого хитозана [60, 61]. Значение рН 0,2%-ного раствора олигохитозана в воде составляет приблизительно 4. Для того чтобы избежать растворения карбоната марганца, значение рН было доведено до 6 добавлением 2% NaOH.