Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Выживание бактерий при взаимодействии с кислородзависимыми бактерицидными механизмами фагоцитов

Диссертация: Выживание бактерий при взаимодействии с кислородзависимыми бактерицидными механизмами фагоцитов
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Представленные результаты второго этапа исследования, по нашему мнению, позволили лишь отчасти приблизиться к решению поставленных задач исследования и предполагали поиск иных подходов к оценке способности бактерий выживать при взаимодействии с кислородзависимыми механизмами бактерицидности фагоцитов. Во-первых, несмотря на выявленную высокую роль ферментов-антиоксидантов в выживании бактерий при… Читать ещё >

Содержание

  • Глава 1. Биоокислительные процессы при фагоцитозе. Обзор литературы
    • 1. 1. Универсальность окислительных и антиоксидантных механизмов в природе
    • 1. 2. Кислородзависимые бактерицидные механизмы фагоцитов
    • 1. 3. Выживание патогенов при взаимодействии с кислородзависимыми механизмами бактерицидности фагоцитов
    • 1. 4. Вирулентность бактерий и их антиоксидантные ферменты
    • 1. 5. Сравнительный анализ методов определения активности бактериальных каталазы и супероксиддисмутазы
  • Глава 2. Материалы и методы исследования
    • 2. 1. Характеристика культур микроорганизмов
    • 2. 2. Методы идентификации бактерий
    • 2. 3. Определение антилизоцимной активности бактерий
    • 2. 4. Определение антиинтерцидной активности бактерий
    • 2. 5. Определение антикомплементарной активности бактерий
    • 2. 6. Оценка уровня каталазной/пероксидазной активности бактерий
    • 2. 7. Оценка уровня супероксиддисмутазной активности бактерий
    • 2. 8. Получение суспензии нейтрофилов крови человека
    • 2. 9. Определение степени активации нейтрофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия
    • 2. 10. Определение бактерицидного действия нейтрофилов на бактериальные клетки
    • 2. 11. Моделирование инфекционного процесса, сопровождающегося транслокацией E. coli из кишечника во внутренние органы
    • 2. 12. Моделирование инфекционного процесса, переходящего в длительное персистирование Staphylococcus aureus в почечной ткани
    • 2. 13. Статистическая обработка результатов
  • Глава 3. Распространенность и уровни активности каталаз и супероксиддисмутаз бактерий
    • 3. 1. Эковариантные различия по каталазной активности бактерий
    • 3. 2. Эковариантные различия активности бактериальной супероксиддисмутазы
  • Глава 4. Бактериальные факторы, воздействующие на активацию и бактерицидность фагоцитов
    • 4. 1. Общие закономерности варьирования степени активации и бактерицидное&trade- нейтрофилов
    • 4. 2. Роль различных секретируемых факторов бактерий в выживании при фагоцитозе
    • 4. 3. Разработка методических подходов для определения спектра устойчивости бактерий к различным АФК
    • 4. 4. Апробация тестов на выживание бактерий при контакте с АФК
    • 4. 5. Сравнительный анализ роли антиоксидантных и персистентных свойств бактерий в выживании при фагоцитозе
  • Глава 5. Биологическое значение антиоксидантных механизмов бактерий
    • 5. 1. Каталазная активность E. coli в условиях экспериментальной транслокации из кишечника во внутренние органы
    • 5. 2. Активность каталазы и супероксиддисмутазы S. aureus при длительном персистировании в макроорганизме
    • 5. 3. Антиоксидантные свойства энтерококков возбудителей инфекций мочевых путей
    • 5. 4. Клинико-микробиологическое исследование отделяемого гнойных ран ожоговых больных

Выживание бактерий при взаимодействии с кислородзависимыми бактерицидными механизмами фагоцитов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы.

Обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни является генерация так называемых кислородных метаболитов [Зенков Н.К., Меньшикова Е. Б. 1993]. Эти высокореактивные соединения обладают широким спектром биологического действия, в том числе проявляют свой мощный окислительный потенциал в бактерицидности фагоцитов.

Первоначально изучение активных кислородных радикалов, образующихся в ходе респираторного взрыва при фагоцитозе, было направлено на обнаружение механизмов их возникновения, а также на выявление вклада продуктов неполного восстановления кислорода в бактерицидность фагоцитов по отношению к целому ряду микроорганизмов [Allen R. С., Stjernholm R. L., Steele R. H., 1972; Babior В., 1978; Clark R., Klebanoff S., 1978; Samokyszyn V.W., Thomas C.E., Reif D.W., Saito M., Aust.D., 1988; Ginsburg I., Kohen R., 1995]. В последние годы наряду с супероксиданион-радикалом, перекисью водорода, гидроксильным радикалом, синглетным кислородом и гипогаллоидами, были обнаружены новые бактерицидные агенты фагоцитов — азотсодержащие метаболиты кислорода. В частности, показана важная роль оксида азота (NO), образующегося при взаимодействии азота аргинина с молекулярным кислородом, и пероксинитрита — продукта неферментативного взаимодействия N0- с супероксид анионом [Gryglewski R., Palmer R., Moneada S., 1986; Beckman J., Beckman T., Chen J., 1990; Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J., 1992].

Кроме того, предметом пристального изучения являются механизмы и условия выживания бактериальной клетки при столкновении с кислород-зависимыми бактерицидными факторами фагоцитов. При этом выживание бактерий при фагоцитозе наиболее часто связывается с выработкой бактериальными клетками ферментов-антиоксидантов (каталаз/пероксидаз и су-пероксиддисмутаз), которым нередко приписывается ведущая роль в обеспечении устойчивости к активным формам кислорода (АФК) [Fridovich I. 1989; Wendel А. 1988; McCord J.M., Fridovich I., 1969а, бKlebanoff S.J., 1993].

Тем не менее, спектр и выраженность рассматриваемых свойств у патогенных и условно-патогенных бактерий, также как и вклад этих свойств в выживание микроорганизмов в организме хозяина остаются недостаточно выясненными. Открытым остается вопрос о роли иных, неферментативных, антиоксидантных механизмов бактерий. До сих пор не разработана классификация бактериальных антиоксидантов, отсутствует единое мнение в отношении предпочтительных методов изучения устойчивости бактериальных клеток к АФК. Наконец, слабо разработаны вопросы практической применимости знаний об антиоксидантных механизмах бактерий для дифференциации патогенов и/или прогнозирования течения инфекционно-воспалительных процессов.

Поиску ответов на перечисленные вопросы посвящена настоящая диссертационная работа, в которой основное внимание уделено оценке вклада антиоксидантных механизмов бактерий в их выживание при фагоцитозе.

Цель исследования: выявление ключевых механизмов выживания бактерий в условиях взаимодействия с кислородзависимыми бактерицидными механизмами фагоцитов. Задачи исследования:

1. Сравнительный анализ ферментных механизмов устойчивости к окислительным бактерицидным факторам фагоцитов, в частности, каталазы и супероксиддисмутазы, у различных эковаров S. aureus, Е. coli, Е. faecalis.

2. Определение удельного вклада бактериальных каталазы и супероксиддисмутазы в выживание бактерий при фагоцитозе нейтрофилов.

3. Сравнительный анализ показателей устойчивости бактерий к ключевым кислородзависимым факторам бактерицидности фагоцитов.

4. Определение биологической значимости механизмов устойчивости бактерий к активным формам кислорода на моделях экспериментальных инфекций и в клинико-микробиологическом исследовании.

Научная новизна.

Для бактерий — представителей видов S. aureus, Е. coli, Е. faecalisвпервые определены эковариантные различия по уровню и частоте встречаемости каталазы и супероксиддисмутазы. При этом выявлены существенные отличия в уровнях активности указанных ферментов у культур, изолированных из внешней среды и из организма человека. В целом, для активности супероксиддисмутазы показана тенденция к нарастанию в ряду «внешняя среда — здоровыебольные люди».

Впервые проведен сравнительный анализ взаимосвязи ряда феноти-пических характеристик бактерий (ферментов-антиоксидантов, антикомплементарной, антилизоцимной и антиинтерцидной активностей) со способностью активировать нейтрофилы крови человека и выживать при фагоцитозе. Показана доминирующая роль каталазы и супероксиддисмутазы бактерий в их выживании при фагоцитозе. Обнаружено преимущественное влияние изученных признаков бактерий на феномен их выживания при фагоцитозе, по сравнению с феноменом активации нейтрофилов крови человека.

Разработаны новые подходы к оценке устойчивости бактерий к ключевым активным формам кислорода, идентичным образующимся в ходе респираторного взрыва при фагоцитозе: супероксиданиону, оксиду азота и пероксинитриту.

При сопоставлении роли ферментов-антиоксидантов, резистентности к активным формам кислорода, а также персистентных свойств бактерий в феномен их выживания при нейтрофильном фагоцитозе идентифицированы ключевые механизмы, обеспечивающие устойчивость к фагоцитарному киллингу (ферментные антиоксиданты, устойчивость к пероксинитриту и супероксиданиону). Выявлены факторы, обеспечивающие потенцирование антикиллингового/антиоксидантного эффекта при фагоцитозе.

При экспериментальном моделировании инфекционных процессов на животных показана связь каталазы кишечных палочек с феноменом транслокации из кишечника во внутренние органы, а также связь каталазы и супероксиддисмутазы золотистых стафилококков с длительным персисти-рованием в организме лабораторных животных.

В клинико-микробиологическом исследовании при изучении бактерий, выделяемых из гнойных ран ожоговых больных, показана прогностическая значимость показателя устойчивости к пероксинитриту и активности супероксиддисмутазы золотистых стафилококков в отношении неблагоприятного течения раневого гнойно-воспалительного процесса. При анализе ан-тиоксидантных свойств уропатогенных штаммов энтерококков показана высокая информативность активности супероксиддисмутазы для дифференциации культур, выделенных при пиелонефрите, от транзиторных уроизо-лятов энтерококков.

Научно-практическая ценность работы.

Полученные результаты исследования расширяют патогенетические представления о роли антиоксидантных свойств бактерий в их выживании при взаимодействии с эффекторными механизмами антибактериального иммунитета, в феноменах транслокации энтеробактерий из кишечника во внутренние органы, а также длительной персистенции стафилококков в организме хозяина.

В результате клинико-микробиологического исследования инфекций мочевых путей показана высокая информативность активности супероксиддисмутазы энтерококков в отношении дифференциации их уропатогенных изолятов, что послужило основой соответствующих рекомендаций. При исследовании микрофлоры ожоговых ран показана значимость теста на устойчивость к пероксинитриту стафилококков для прогнозирования неблагоприятного течения раневых гнойно-воспалительных процессов у ожоговых больных. Рекомендации по использованию антиоксидантных свойств бактерий для повышения информативности бактериологической диганостики отражены в Методическом письме «Антиоксидантные свойства бактерий в диагностике инфекционно-воспалительных процессов» (Оренбург, 2001).

Положения, выносимые на защиту:

1. Антиоксидантные механизмы бактерий, представленные ферментными и неферментными факторами, имеют ключевое значение в выживании при фагоцитозе.

2. Активность ферментов-антиоксидантов бактерий связана с эпитопом обитания и обеспечивает наибольший вклад в их устойчивость к активным кислородным метаболитам и фагоцитарному киллингу. Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов (Оренбург 1998, 2000, 2001) — заседаниях Ученого совета Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (2001) — Российской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2000). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, главу, описывающую материалы и методы исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, а также указатель литературы, включающей 40 отечественных и 173 зарубежных источника. Иллюстрации представлены 32 таблицами и 16 рисунками.

Выводы.

1. Для бактерий — представителей видов S. aureus, Е. coli, Е. faecalisопределены эковариантные различия по уровню и частоте встречаемости каталазы и супероксиддисмутазы. При этом наиболее выраженные отличия в уровнях активности указанных ферментов наблюдались между культурами, изолированными из внешней среды и из организма человека.

2. Идентифицирован комплекс ключевых механизмов, обеспечивающих устойчивость к фагоцитарному киллингу, включающий в себя ферментные антиоксиданты, устойчивость к пероксинитриту и су-пероксиданиону. Определены факторы, обеспечивающие потенцирование антикиллингового/антиоксидантного эффекта при фагоцитозе.

3. При сравнительном анализе взаимосвязи каталазы и супероксиддисмутазы бактерий, их антикомплементарной, антилизоцимной и анти-интерцидной активностей со способностью активировать нейтрофи-лы крови человека и выживать при фагоцитозе показана доминирующая роль ферментов-антиоксидантов бактерий в их выживании при фагоцитозе.

4. Персистентные и ферментные антиоксидантные свойства бактерий оказывают преимущественное влияние на феномен их выживания при фагоцитозе, в сравнении с феноменом активации нейтрофилов крови человека.

5. Разработаны методические подходы к оценке устойчивости бактерий к ключевым активным формам кислорода, образующимся в ходе респираторного взрыва при фагоцитозе: супероксиданиону, оксиду азота и пероксинитриту.

6. При моделировании инфекционных процессов на животных показаны селективные преимущества бактерий, обладающих высокой активностью ферментов-антиоксидантов, при транслокации из кишечника во внутренние органы (Е. coli) и при длительном персистирова-нии в макроорганизме (S. aureus).

7. При изучении свойств бактерий, выделенных из отделяемого гнойных ран ожоговых больных, показана прогностическая значимость показателя устойчивости к пероксинитриту и активности суперок-сиддисмутазы золотистых стафилококков в отношении неблагоприятного течения гнойно-воспалительного процесса.

8. При анализе антиоксидантных свойств уропатогенных штаммов энтерококков показана высокая информативность активности суперок-сиддисмутазы для дифференциации культур, выделенных при пиелонефрите, от транзиторных уроизолятов энтерококков.

Заключение

.

В последние годы предметом пристального изучения являются механизмы и условия выживания бактерий при их взаимодействии с кислородза-висимыми бактерицидными механизмами фагоцитов. При этом выживание бактерий при фагоцитозе наиболее часто связывается с выработкой бактериальными клетками ферментов-антиоксидантов (каталаз/пероксидаз и су-пероксиддисмутаз), которым нередко приписывается ведущая роль в обеспечении устойчивости к активным формам кислорода [Fridovich I. 1989; Wendel А. 1988; McCord J.M., Fridovich I., 1969а, бKlebanoff S.J., 1993].

Тем не менее, спектр и выраженность рассматриваемых свойств у патогенных и условно-патогенных бактерий, также как и вклад этих свойств в выживание микроорганизмов в организме хозяина остаются недостаточно выясненными. Открытым остается вопрос о роли иных, неферментативных, антиоксидантных механизмов бактерий, слабо разработаны вопросы практической применимости знаний об антиоксидантных механизмах бактерий.

Представленная диссертационная работа посвящена изучению механизмов выживания бактерий в условиях взаимодействия с кислородзависи-мыми бактерицидными механизмами фагоцитов. В работе дан сравнительный анализ ферментных антиоксидантных механизмов бактерий (каталазы и супероксиддисмутазы). Проведено сопоставление вклада каталазы и су-пероксиддисмутазы бактерий, их антикомплементарной, антилизоцимной и антиинтерцидной активностей в способность активировать нейтрофилы крови человека и выживать при фагоцитозе. На моделях экспериментальных инфекций и в клинико-микробиологическом исследовании определена биологическая значимость антиоксидантных механизмов бактерий.

Работа выполнена на 329 штаммах бактерий — представителях видов Staphylococcus aureus (114 штаммов), Escherichia coli (121 штамм), Enterococcus faecalis (94 штамма). Перечисленные культуры были изолированы из воды открытых водоемов, от клинически здоровых и больных людей.

Уровень каталазной активности бактерий регистрировали по утилизации перекиси водорода посредством метода прямой спектрофотометрии раствора Н202, содержащего бактериальные клетки. Определение уровня активности супероксиддисмутазы производилось посредством выявления степени ингибирования процесса аутоокисления адреналина в адренохром бактериальным лизатом.

Для определения способности бактерий индуцировать метаболический взрыв у нейтрофилов нами была использована методика оценки активации полиморфно-ядерных лейкоцитов крови человека по количеству восстановленного до формазана нитросинего тетразолия. В качестве показателя активации кислородзависимых механизмов нейтрофилов вычисляли индекс активации, равный отношению концентраций образованного в ходе фагоцитоза формазана в опыте и контроле. Индекс выживания бактерий оценивали по результатам высева микроорганизмов на плотную питательную среду после контакта с полиморфмно-ядерными лейкоцитами и выражали в процентах от количества внесенных бактериальных клеток.

На первом этапе работы нами были изучены частоты встречаемости и уровни экспрессии каталазы и СОД бактерий, изолированных из различных экониш.

Наименьшие значения каталазной активности наблюдались в выборке золотистых стафилококков, выделенных от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей. Средние значения регистрировались у штаммов от клинически здоровых резидентных бактерионосителей, наибольшие — от транзиторных стафилококковых носителей. Подобное распределение каталазной активности, по нашему мнению, связано с особенностями среды обитания стафилококков, выделенных со слизистой носовых ходов (высокие концентрации кислорода), и может указывать на возможность применения теста на каталазную активность для дифференциации резидентного бактерионосительства.

Супероксиддисмутазная активность Staphylococcus aureus, напротив, нарастала в ряду «транзиторные носители — резидентные носители — больные». Каталазная и супероксиддисмутазная активность E. coli, также как и активность пероксидаз E. faecalis нарастала в ряду «внешняя среда — здоровые — больные люди». Активность супероксиддисмутазы энтерококков при этом была почти одинаково выражена в группах штаммов, изолированных из организма человека, по сравнению с культурами, выделенными из воды открытых водоемов.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что экова-риантная принадлежность бактерий существенно сказывается на уровне активности их антиоксидантных ферментов. Наиболее общей закономерностью распределения культур по уровню данных свойств явились различия по выраженности при сопоставлении в группах «внешняя среда — макроорганизм» и «здоровые — больные люди».

Описанные закономерности согласуются с данными литературы о роли бактериальных каталаз и супероксиддисмутаз в устойчивости к фагоцитозу, а также о взаимосвязи активности этих ферментов с вирулентностью бактериальных патогенов [Mandell G.L., 1975; Degteva G.K., Malakhova Т.А., 1979; Filice G.A., 1983; Kanafani H., Martin S.E., 1985; Wilson C.B., Weaver W.M., 1985; Printzen G. 1996]. В то же время в литературе отсутствуют сведения, позволяющие провести адекватное сравнение различных экои патоваров бактерий по уровню ферментов-антиоксидантов.

Относительно высокие уровни супероксиддисмутазы энтерококков являются скорее компенсаторными и объясняются отсутствием истинной катал азы у данных микроорганизмов. При этом экспрессия катал азной активности энтерококками обеспечивается за счет способности продуцировать псевдокаталазные ферменты (флавинзависимые оксидазы и пероксидазы), осуществляющие нейтрализацию эндогенных и экзогенных перекисей [Do-lin M.I., 1957; Ross R.P., Claiborne А., 1991; Crane E.J., Parsonage D., Poole L.B. and Claiborne A., 1995]. Эти ферменты обычно не учитываются при анализе вирулентных свойств энтерококков. Вместе с тем полученные сведения о патовариантных отличиях энтерококков по каталазной активности позволяют предположить участие псевдокаталазных ферментов в реализации патогенного потенциала данных микроорганизмов.

На следующем этапе исследования изучались взаимосвязи ряда фе-нотипических характеристик бактерий (ферментов-антиоксидантов, антикомплементарной, антилизоцимной и антиинтерцидной активностей) со способностью активировать нейтрофилы крови человека и выживать при фагоцитозе. Исследование проводилось на 23 штаммах S. aureus, 23 штаммах Е. coli и 30 штаммах Е. faecalis. Выбор культур для данной экспериментальной серии основывался на наличии альтернативных вариантов по уровням каталазной/пероксидазной и супероксиддисмутазной активности у све-жевыделенных клинических штаммов.

Первичный анализ полученных данных указывал на наличие положительной, статистически значимой для всех трех видов бактерий взаимосвязи между выживанием нативных и опсонизированных бактерий, что предполагало существенную роль собственного антифагоцитарного потенциала микроорганизмов, не зависящего от феномена опсонизации. При этом опсонизация сама по себе оставалась весомым фактором, усиливающим как активацию, так и бактерицидные свойства нейтрофилов.

Более подробный анализ антифагоцитарного потенциала выявил закономерности, свидетельствующие о том, что: а) феноменом, наиболее подверженным влиянию изученных признаков бактерий, является феномен их выживания (но не активации) при фагоцитозеб) признаками, проявляющими наиболее устойчивое влияние на выживание бактерий, являются катала-за и супероксиддисмутаза, эффекты которых распространяются практически во всех случаях на все три изученных вида бактерийв) антилизоцимная и антикомплементарная активности оказывают положительный эффект на выживание лишь опсонизированных бактерий и в отдельных случаях потенцируют эффекты антиоксидантных свойств бактерийг) изученные признаки слабо влияют на активацию нейтрофилов, за исключением бактериальной супероксиддисмутазы, которая снижала способность кишечных палочек активировать фагоцитирующие клетки.

Представленные результаты второго этапа исследования, по нашему мнению, позволили лишь отчасти приблизиться к решению поставленных задач исследования и предполагали поиск иных подходов к оценке способности бактерий выживать при взаимодействии с кислородзависимыми механизмами бактерицидности фагоцитов. Во-первых, несмотря на выявленную высокую роль ферментов-антиоксидантов в выживании бактерий при фагоцитозе, из литературы известно о возможной роли иных, неферментативных, механизмов защиты от кислородных радикалов (низкомолекулярные антиоксиданты, ловушки кислородных радикалов, толерантность и слабую проницаемость наружного слоя бактериальной клетки) [Ehrt S., Shiloh M.U., Ruan J., 1997; Lundberg B.E., Wolf R.E.Jr., Dinauer M.C., Xu Y., Fang F.C., 1999; Bryk R., Griffin P., Nathan C., 2000; Horsburgh M.J., Ingham E., Foster S.J. 2001]. Во-вторых, из представленных данных следует, что изученные свойства бактерий объясняют от 16% до 60% влияния на выживание бактерий при фагоцитозе. Следовательно, на иные, неучтенные, механизмы защиты бактерий может приходиться значительная доля эффекта.

В связи с этим нами разработаны подходы к оценке чувствительности/устойчивости бактерий к спектру активных форм кислорода, идентичных образующимся в ходе респираторного взрыва при фагоцитозе.

Как известно, в ходе фагоцитоза образуются высокоактивные кислородные радикалы, причем важнейшая роль в реализации бактерицидных эффектов принадлежит супероксиданион-радикалу (02), образующемуся в первые минуты после активации фагоцитов [Babior D. М., 1978; Imlay J.А., Fridovich I., 1991, 1992]. При взаимодействии Ог с окисью азота образуется пероксинитрит, один из наиболее токсичных вторичных продуктов респираторного взрыва, который нарабатывается в нейтрофилах спустя некоторое время от начала фагоцитоза [Gryglewski R., Palmer R., Moneada S., 1986; Beckman J., Beckman Т., Chen J., 1990; Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J., 1992]. Кроме того, сами по себе NO-радикалы обладают значительным цитотоксическим действием. [Klebanoff S.J. 1993. Nussler А.К., Billiar T.R.

1993.].

Исходя из этих фактов, в качестве окислителей были выбраны су-пероксиданион-радикал, оксид азота и продукт взаимодействия этих двух окислителей — пероксинитрит. При этом синтез супероксиданиона производился в системе, содержащей рибофлавин и тетраметилэтилендиамин, при дозированном количестве света. В качестве источника оксида азота использовали стандартный донатор N0 — нитропруссид натрия. Для синтеза перок-синитрита применяли смесь из вышеперечисленных систем генераций активных кислородных радикалов.

Принципиальная схема определения спектра устойчивости бактерий к АФК включала в себя: 1) создание условий для синтеза радикалов- 2) инкубацию бактерий с синтезированными АФК- 3) оценку степени бактерицидное&tradeАФК- 4) сопоставление с контролем, в качестве которого использовали буферный раствор с pH, аналогичным опытным пробам.

Предложенная методика определения спектра устойчивости бактерий к АФК, построенная на стандартных приемах синтеза радикалов, ориентирована на исследование резистентности микроорганизмов параллельно к трем АФК, обеспечивающих наибольший вклад в бактерицидность респираторного взрыва при фагоцитозе. Это позволяет в рамках одного исследования получить комплексное представление об устойчивости бактерий к тем или иным АФК (спектр или профиль устойчивости). Такого рода информация отсутствует в доступной нам литературе, а сопоставление результатов, полученных разными исследователями не представляется возможным ввиду многообразия используемых методических приемов [Popov I., Hornig J., v. Baer R., 1985; Violi F., Iuliano L., Alessandri C., Guiselli A., 1985; Corbisier P., Houbion A., Remade J., 1987; Sugawara M., Kita Т., Lee E.D., Takamatsu J., Hagen G.A., Kuma К., Medeiros-Neto G.A., 1988; Oyanagui, Y., 1988 а, бKoc-тюк В.А., Потапович А. И., Ковалева Ж. В., 1990; Hogg N., Darley-Usmar V.M., Wilson M.T., Moneada S., 1992; Nebot С., Moutet M., Huet P., Xu JZ., Yadan JC., Chaudiere J., 1993; Laihia J.K., Jansen C.T., Ahotupa M., 1993].

Апробация разработанных тестов на устойчивость к АФК проведена на 23 штаммах золотистого стафилококка и 23 штаммах кишечной палочки при использовании стандартной модели нейтрофильного фагоцитоза. Интерес при этом представляло исследование связи между выживанием бактерий при контакте с синтезируемыми АФК (in vitro без фагоцитов), уровнем их ферментных антиоксидантных систем (каталаза, супероксиддисмутаза) и выживанием при нейтрофильном фагоцитозе (клеточная модель). Результаты свидетельствуют о том, что контакт АФК с бактериями приводил к гибели последних. При этом чувствительность к бактерицидному действию различных АФК проявляла как межвидовые, так и внутривидовые отличия. Для S. aureus наименьший бактерицидный эффект оказывал оксид азота, наиболее токсичным продуктом оказался пероксинитрит. Для кишечной палочки пероксинитрит, напротив, оказался менее опасным агентом, в то время как токсический эффект N0 и 02 был существенно выше. Кроме того, показано, что выявленные спектры устойчивости к АФК связаны с экспрессией ферментов-антиокидантов бактерий. В частности, наиболее значимая связь показана для супероксиддисмутазы бактерий и их устойчивостью к супероксид-радикалу.

Характеристики спектра устойчивости к АФК, как выяснилось, связаны с активацией нейтрофилов и, в особенности, с выживанием бактерий при фагоцитозе. Наиболее выраженная связь с индексом выживания отмечена для показателя устойчивости стафилококков и кишечных палочек к пероксинитриту. В наименьшей степени с изучаемыми феноменами был связан показатель устойчивости к окиси азота. В целом данные результаты соотносятся с данными литературы о роли первого и последнего из указанных радикалов в бактерицидности фагоцитов [Gryglewski R., Palmer R., Moneada S., 1986; Beckman J., Beckman Т., Chen J., 1990; Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J., 1992; Klebanoff S.J., 1993; Nussler A.K., Billiar T.R., 1993].

Таким образом, разработанный нами набор тестов для определения спектра устойчивости бактерий к активным кислородным радикалам позволяет относительно просто оценить их резистентность к ключевым компонентам респираторного взрыва (профиль устойчивости к АФК). При этом, несмотря на то, что изучение устойчивости бактерий к АФК достаточно популярно в последнее десятилетие, прямых аналогов предложенному нами набору тестов в доступной литературе не встретилось. Наиболее близкими по направленности и используемым приемам, однако отличающимися по целям можно назвать работы, связанные с выявлением роли и вовлеченности различных систем генерации АФК при фагоцитозе S. aureus [Hampton М.В., Kettle A.J., Witerborn C.C., 1996], H. pylori [Davies G.R., Simmonds N.J., Stevens T.R.J., 1994; Sedghi S., Keshavarzian A., Klamut M. 1994; Mori M., Suzuki H., Suzuki M. et al., 1997], S. typhymurium и H. pylori [Bryk R., Griffin P., Nathan C., 2000].

На заключительном этапе исследования производилось изучение роли факторов антиоксидантной защиты бактерий на моделях in vivo и в кли-нико-микробиологическом исследовании.

В данном разделе работы на лабораторных животных проведено экспериментальное моделирование транслокации кишечных палочек из толстого кишечника во внутренние органы. При этом показано, что клоны инфицирующего штамма, изолированные из внутренних органов мышей, на начальных этапах инфекции обладали существенно большей каталазной активности, по сравнению со штаммами, не подвергшимися транслокации (9,8 ед. и 6,2 ед. соответственно). При дальнейшем наблюдении эти различия исчезали за счет увеличения каталазной активности штаммов, колонизировавших кишечник (14,6 ед. против 14,7 ед.).

Кроме того, на модели длительной септической стафилококковой инфекции показана нарастающая динамика каталазы и супероксиддисмута-зы при переходе инфекционного процесс, а из стадии альтерации в стадию персистенции. Данные изменения наблюдались на фоне убывания экспрессии вирулентных признаков стафилококков (гемолизины, фибринолизин, протеазы) и усиления выраженности других факторов персистенции (клам-пинг-фактора, продукции протеина А, антилизоцимной и антикомплементарной активностей).

Таким образом, при экспериментальном моделировании инфекционных процессов на животных выявлена положительная связь каталазы кишечных палочек с феноменом транслокации, а также связь каталазы и су-пероксиддисмутазы золотистых стафилококков с феноменом персистенции. Полученные факты расширяют наши представления о роли биологических свойств бактерий в их выживании при смене эпитопа паразитированиятранслокации [Berg R.D., 1993; Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю., Лиходед Н. В. и др., 1998; Гриценко В. А., 2000] и/или при длительном паразитировании в макроорганизме — персистенции [Бухарин О.В., 1994, 1999].

В клинико-микробиологическом исследовании при изучении бактерий, выделяемых из гнойных ран ожоговых больных, нами показана связь фенотипических характеристик золотистых стафилококков с характером течения раневого инфекционного процесса. Показана прогностическая значимость устойчивости к пероксинитриту и активности супероксиддисмутазы золотистых стафилококков в отношении неблагоприятного течения гнойно-воспалительного процесса. Так, золотистые стафилококки, доминировавшие в структуре раневого биоценоза у ожоговых больных при неблагоприятном (затяжном и/или рецидивирующем) течении инфекции обладали существенно большей степенью устойчивости к пероксинитриту и более высокой активностью супероксиддисмутазы по сравнению с культурами, выделенными от больных с неосложненным характером раневой инфекции.

При анализе антиоксидантных свойств уропатогенных штаммов энтерококков показана взаимосвязь активности бактериальной супероксиддисмутазы с вероятностью пиелонефрита. Так, энтерококки, выделенные при пиелонефрите характеризовались значительно большим (15,24±2,04) уровнем активности супероксиддисмутазы, по сравнению со штаммами, выделенными при прочих инфекциях мочевых путей (9,82±1,26). В целом, для уроштаммов энтерококков увеличение уровня супероксиддисмутазы означало больший уровень обсемененности мочи и большую вероятность пиелонефрита. Это позволило оценить этот параметр в качестве критерия распознавания транзиторных уроизолятов энтерококков от культур, этиологически значимых в развитии пиелонефрита. При этом информативность мера Кульбака) супероксиддисмутазы энтерококков незначительно (4,40 против 5,65) уступала информативности антикомплементарной активности — доказанного маркера уропатогенности энтеробактерий [Вялкова A.A., Бухарин О. В., Гриценко В. А. и др., 1996; Гриценко В. А., Ляшенко И. Э., Гор-диенко Л.М. и др., 1996].

Таким образом, в целом по результатам исследования, можно выделить следующие три наиболее важных момента: а) активность ферментных антиоксидантных механизмов бактерий в целом связана с эпитопом их обитания и имеет ключевое значение в выживании микроорганизмов при фагоцитозеб) антиоксидантный потенциал бактерий может быть реализован патогенами на этапах транслокации и/или персистенции в макроорганизмев) показатели спектра устойчивости бактерий к АФК, обусловленные ферментными и неферментными факторами бактерий, отражают характер течения гнойно-воспалительных заболеваний и могут быть использованы для повышения информативности бактериологических методов диагностики.

Показать весь текст

Список литературы

  1. К.Х., Горская Е. М., Бондаренко В.М.//Журн. микро-биол.- 1991.-№ 7, — С.74−79.
  2. С.Д., Балаховский И. С. Методы химического анализа крови. М. Медицина, 1953. С 592−594.
  3. В.В., Закарян JI.M. Изучение изменений клональной структуры популяции стафилококков на модели почечной инфекции у мышей// Журн. микробиол. 1989. — № 3. — С. 16−20.
  4. М. В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989.- 368с.
  5. М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования// 3-е изд., перераб. И доп.- М.: Медицина, 1982.-464с.
  6. Ю.А. Антикомплементарная активность бактерий// В кн.: Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, — 1990.- С. 100−107.
  7. О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий// ЖМЭИ. 1994. — Приложение. — С.4−13.
  8. О.В. Персистенция патогенных бактерий— М.: Медицина- Екатеринбург: УрО РАН, — 1999, — 366с.
  9. О.В., Соколов В. Ю. Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов. A.c. СССР № 1 564 191// Открытия.- 1990.-№ 18.
  10. О.В., Усвяцов Б. Я., Малышкин А. П., Немцева Н. В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов// ЖМЭИ.-1984.-№ 2.- С.27−29.
  11. A.A., Бухарин О. В., Гриценко В. А. и др. Микробиологические критерии бактериурии у детей с латентным пиелонефритом// Рос. вестн. перинатологии и педиатрии.- 1996.- Т.41.- № 6.- С.54−58.
  12. Л.П., Молчанов A.B., Ельчанинова С. А., Варшавский Б. Я. Состояние перекисного окисления у больных с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки// Лаб. дело. 1998. № 6. С. 10−15.
  13. В.А., Ляшенко И. Э., Гордиенко Л. М. и др. Информативность маркеров персистенции Escherichia coli при бактериологической диагностике хронического пиелонефрита у детей// Журн. микробиол.-1996.- № 3, — С.80−83.
  14. В.А., Ю.А.Брудастов, О. С. Журлов, К. Л. Чертков.//Журн. мик-робиол.- 2000.- № 1.- С37−41.
  15. Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000: 240 с.
  16. И.И., Бухарин О. В. Нейтрофилы и гомеостаз. Екатеринбург: УрО РАН, 2001.
  17. Дубинина Е.К.//Лаб. дело. 1988. № 8. С. 16.
  18. А. И. Биохемилюминесценция. М.: Наука, 1983.
  19. В.Г., Закревский В. И. Методологические аспекты исследований свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы орга-низма//Вестник Волгоградской медицинской академии. Вып. 4. Волгоград 1998. С. 49−53.
  20. Н.К., Меныцикова Е.Б.//Успехи соврем, биологии. 1993. Т.113. № 3. С. 286.
  21. М.А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности каталазы// Лаб. дело. -1988. -№ 1. С. 16−18.
  22. В.А., Потапович А. И., Ковалева Ж. В. 1990. Вопр. мед. хим.-вып.36.- № 2.- С. 88−91.
  23. М.И., Колкер И. И., Костюченок Б. М. Бактериологическая диагностика раневой инфекции. Методические рекомендации, М., 1984, 22с.
  24. М.И., Колкер И. И., Костюченок Б. М. Бактериологическая диагностика раневой инфекции. Методические рекомендации, М., 1984, 22с.
  25. В. И., Колесниченко Л.С.// Успехи соврем, биологии. 1989. Т. 107. № 2. С. 179.
  26. Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Мир, 1968.-С. 140−246.
  27. Г. Ф. Биометрия,— М.: Высш. Шк., 1990.- 352с.
  28. В.Г., Яковлев М. Ю., Лиходед Н. В. и др.//Журн. микробиол.-1998.- № 4.- С.14−16.
  29. А.Н., Маянский Д. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. -Новосибирск: Наука, 1989.- 344с.
  30. Методы общей бактериологии: Пер. с англ.//Под ред. Ф. Герхарда и др. М.:Мир, 1983.- С.482−485.
  31. Е.Б., Зенков Н.К.// Успехи соврем, биологии.- 1993.-Т.113.- С. 442.
  32. А.Н., Якутова Э. Ш., Владимиров Ю. А. Образование гидро-ксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа// Биофизика.- 1993.- Т. 38.- № 3.- С. 390−396.
  33. .А., Порембский Я. О., Яблонский В. Г. Ожоги: Руководство для врачей.- СПб.: Спецлит.- 2000, — 480 с.
  34. C.B. Общая хирургия.-СПб.: Изд-во «Лань», — 1999.- 672 с.
  35. Ю.А., Гуткин Д.В.// Патол. физиология и эксперим. терапия.-1986.-№ 5, — С. 85.
  36. В.Г., Марко О. П. Микрофлора человека в норме и патологии,-М.- 1976, — 232 с.
  37. Ю.М., Маханева Л. Г., Шапиро A.B. Количественное определение бактерий в клинических материалах.//Лаб. Дело.- 1984, — № 10.-С.616−619.
  38. И. Свободные радикалы в биологии. М.: Мир, 1979.
  39. .П., Чурилова И.В.//Биохимия, — 1992, — Т.57, — № 5.- С. 719.
  40. В.В. Лечение ожогов и их последствий: Атлас.- М.: Медицина, — 1980, — 192 с.
  41. Adachi Т. л Hirano К., Hayashi К., Muto Y., Okuno F. A one-step enzyme immunoassay for human manganese superoxide dismutase with monoclonal antibodies// Free. Radie. Biol. Med.- 1990, — V.8.- P.25−31.
  42. Albina J.E. On the expression of nitric oxide synthase by human macrophages. Why no NO?// J. Leukocyte Biol.- 1995.- V.58.- P.643.
  43. Allen R. C., Stjernholm R. L., Steele R. H. Evidence for the generation of an electronic excitation state (s) in human polymorphonuclear leukocytes and its patricipation in bactericidal activity// Biochem. Biophis. Res. Commun.-1972, — V.47.- P.679−684.
  44. Babenko G.A., Goinatskii M.N. Determination of catalase activity in the erythr Superoxide dismutase ocytes and blood serum by the iodometric method// Lab. Delo.- 1976, — V.3.- P.157−158.
  45. Babior B. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (first of two parts)//N. Engl. J. Med.- 1978.- V.298(12).- P.659−668.
  46. Babior B. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (second of two parts)//N. Engl. J. Med.- 1978.- V.298(13).- P.721−725.
  47. Bassoe C.F., Smith I., Sornes S., Halstensen A., Lehmann A.K. Concurrent measurement of antigen- and antibody-dependent oxidative burst and phagocytosis in monocytes and neutrophils// Methods.- 2000.- V.21(3).- P.203−220.
  48. Beauchamp C., Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels// Anal.Biochem.- 1971.- V.44.- P.276−287.
  49. Beckman J., Beckman T., Chen J. et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide// Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1990.- V.87.- P. 1620−1622.
  50. Beers I.F., Sizer W.I. A spectrophotometric assay for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase// J. Biol. Chem.- 1952.- V.196.-P.133−140.
  51. Berg R.D.//Медицинские аспекты микробной экологии.- М., 1993/1994.-Т. 7/8.- С. 53−69.
  52. Bishai W.R., Howard N.S., Winkelstein J.A., Smith H.O. Characterization and virulence analysis of catalase mutants of Haemophilus influenzae// Infect. Immun.- 1994, — V.62(l 1) — P.4855−4860.
  53. Bolann B.J., Tangeras A., Ulvik R.J. Determination of manganese superoxide dismutase activity by direct spectrophotometry// Free. Radic. Res.-1996.- V.25(6).- P.541−546.
  54. Bolann B.J., Ulvik R.J. Improvement of a direct spectrophotometric assay for routine determination of superoxide dismutase activity// Clin. Chem.-1991.- V.37(11).- P.1993−1999.
  55. Bolann B.J., Ulvik R.J. How do antioxidants work?// Tidsskr. Nor. Laege-foren.- 1997.- № 20, — V. 117(13).- P. 1928−1932.
  56. Britigan B.E., Ratcliffe H.R., Buettnern G.R., Rosen G.M. Binding of myeloperoxidase to bacteria: effect on hydroxyl radical formation and susceptibility to oxidant-mediated killing// Biochim Biophys Acta.- 1996.-V.1290(3).- P.231−240.
  57. Brunk U., Cadenas E. The potential intermediate role of lysosomes in oxygen free radical pathology. Review article// APMIS.- 1988.- V.96 (1).- P.3−13.
  58. Bryk R., Griffin P., Nathan C. Peroxynitrite reductase activity of bacterial peroxiredoxins// Nature.- 2000, — V.407(6801).- P.211−215.
  59. Burger A.R., Lippard S.J., Pantoliano M.W., Valentine J.S. Nuclear magnetic resonance study of the exchangeable histidine protons in bovine and wheat germ superoxide dismutases// Biochemistry.- 1980.- V.19(18).-P.4139−4143.
  60. B.D., Curnette J. Т., Babior В. M. The oxidative killing mechanisms of the neutrophil// Prog. Clin. Immunol.- 1977.- V.3.- P. 1−65.
  61. Clark R., Klebanoff S. Role of the classical and alternative complement pathways in chemotaxis and opsonization: studies of human serum deficient in C4//J. Immunol.- 1978.-V.120(4).- P. l 102−1108.
  62. Clark R. A, Szot S. The myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide system as effector of neutrophil-mediated tumor cell cytotoxicity// J. Immunol.-1981.-V.126.- P.1295−1301.
  63. Clements M.O., Watson S.P., Foster S.J. Characterization of the major superoxide dismutase of Staphylococcus aureus and its role in starvation survival, stress resistance, and pathogenicity//J.Bacteriol.- 1999.- V.181.-P.3898−3903.
  64. Corbisier P., Houbion A., Remacle J. A new technique for highly sensitive detection of superoxide dismutase activity by chemiluminescence// Anal. Biochem.- 1987.- V. 164(1).- P.240−247.
  65. Davies G.R., Simmonds N.J., Stevens T.R.J. Oxygen toxicity//Gut.- 1994.-V.35.- P.179−185.
  66. Degteva G.K., Malakhova T.A., Quantitative indices of the activity and the electrophoretic characteristics of staphylococcal catalase// Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol.- 1979, — V.6.- P.31−34.
  67. Demple B., Amabile-Cuevas C.F. Redox redux: the control of oxidative stress responses// Cell.- 1991, — V.67(5).- P.837−839.
  68. Desrochers P.E., Jeffrey J.J., Weiss S.J. Interstitial collagenase (matrix met-alloproteinase-1) expresses serpinase activity// J. Clin. Invest.- 1991.-V.87(6).- P.2258−2265.
  69. Duncker D., Ullmann U. Influence of various antimicrobial agents on the chemiluminescence of phagocytosing human granulocytes// Chemotherapy.-1986.-V.32.-P.18.
  70. Ehrt S., Shiloh M.U., Ruan J., Choi M., Gunzburg S., Nathan C., Xie Q., Riley L.W. A novel antioxidant gene from Mycobacterium tuberculosis// J. Exp. Med.- 1997.- V.186(ll).- P.1885.
  71. Falck P. Determination of superoxide dismutase in immune cells by luci-genin-mediated chemiluminescence// Allerg. Immunol.- 1986.- V.32.-P. 199−204.
  72. Filice G.A., Resistance of Nocardia asteroides to oxygen-dependent killing by neutrophils// J. Infect. Dis.- 1983, — V. 148(5).- P.861−867.
  73. Fliss H., Menard M. Hypochlorous acid-induced mobilization of zinc from metalloproteins// Arch. Biochem. Biophys.- 1991.- V.287(l).- P.175−179.
  74. Fliss H., Menard M. Oxidant-induced mobilization of zinc from metal-lothionein//Arch Biochem. Biophys.- 1992, — V.293(l).- P.195−199.
  75. Fliss H., Menard M., Desal M. Hypochlorous acid mobilizes cellular zinc// Canad. J. Physiol. Pharmacol.-V.69(l 1).- P.1686−1691.
  76. Freeman B. Free radical chemistry of nitric oxide. Looking at the dark side// Chest.- 1994, — V.105.- P.87S-84S.
  77. Fridovich I. Editorial: Superoxide radical and the bactericidal action of phagocytes// N. Engl. J. Med.- 1974.- V.290(ll).- P.624−625.
  78. Fridovich I. Oxygen: boon and bane// Am. Sci.- 1975.- V.63(l).- P.54−59.
  79. Fridovich I. Superoxide and evolution// Horiz. Biochem. Biophys.- 1974.-V.I.- P.1−37.
  80. Fridovich I. Superoxide dismutases. An adaptation to a paramagnetic gas// Biol.Chem.- 1989.- V.264(14).- P.7761−7764.
  81. Fridovich I. Superoxide dismutases// Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol.- 1974.- V.41(0).- P.35−97.
  82. Fridovich I. Superoxide dismutases// Annu. Rev. Biochem.-1975.-V.44.-P.147−159.
  83. Gargon M., Charbonneau R., Therrien J., Baril M. Oxygen toxicity and the superoxide dismutase// Rev. Canad. Biol. 1976. — V.35. — V.177−180.
  84. Goldstein I.M., Cerquerira M., Lind S., Kaplan H.B. Evidense that the sy-peroxide-generating system of human leukocytes in associated with the cell surfase//J. Clon. Invest.- 1976, — V.59.- P.249−254.
  85. Goscin S., Fridovich I. The purification and properties of superoxide dis-mutase from Saccharomyces cerevisiae// Biochim. Biophys. Acta.- 1972,-V.289(2).- P.276−283.
  86. Goscin S.A., Fridovich I. Letter: Superoxide dismutase and the oxygen effect//Radiat. Res.- 1973, — V.56(3).- P.565−569.
  87. Goth L., Meszaros I., Nemeth H. Serum catalase enzyme activity in acute pancreatitis// Clin. Chem. 1982. — V.28. — P. 1999−2000.
  88. Goth L., Nemeth H., Meszaros I. Serum catalase activity for detection of hemolytic diseases// Clin. Chem. 1983. — V. 29. — P. 741−743.
  89. Gregory E.M., Fridovich I. Induction of superoxide dismutase by molecular oxygen//J. Bacteriol.- 1973,-V. 114(2).- P.543−548.
  90. Gregory E.M., Fridovich I. Oxygen metabolism in Lactobacillus plantarum// J. Bacteriol.- 1974.- V. l 17.- P. 166.
  91. Gregory E.M., Fridovich I. Oxygen toxicity and the superoxide dismutase// J. Bacteriol.- 1973,-V.l 14(3).-P.l 193−1197.
  92. Gregroy E.M., Yost F.J. Jr., Fridovich I. Superoxide dismutases of Escherichia coli: intracellular localization and functions// J. Bacteriol.- 1973.-V.115(3).-P. 987−991.
  93. Goren M.B., D Arcy Hart P., Young M.R., Armstrong J.A. Prevention of phagosome-lysosome fusion in cultured makrophages by sulfatides of Mycobacterium tuberculosis// Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 1976.- V.73.-P.2510−2514.
  94. Gross J., Hartwig A., Golding A. An improved screening test for the determination of catalase in blood// Z. Med. Labortechn. 1975. — V. l 6. — P.336−339.
  95. Grunow M., Schopp W. Determination of the activity of superoxide dismutase in terms of rea substrate conversion// Biomed. Biochim. Acta.- 1989.-V.40.- P.185−199.
  96. Gryglewski R., Palmer R., Moncada S. Superoxide anion is involved in the breakdown of endothelial-derived vascular relaxing factor// Nature.- 1986.-V.320.- P.454−457.
  97. Gutteridge J.M. Iron promoters of the Fenton reaction and lipid peroxidation can be released from haemoglobin by peroxides// FEBS Lett.- 1986.-V.201(2).- P.291−295.
  98. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen- dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils. Infect. Immun. 1996, V.64.- P.3512−3517.
  99. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts// Arch. Biochem. Bio-phys.- 1986.- V.246(2).- P.501−506.
  100. Halliwell B. Catalase and superoxide dismutase//Biochem J.- 1977, — V.163.-P.441.
  101. Harel S., Kanner J. Haemoglobin and myoglobin as inhibitors of hydroxyl radical generation in a model system of «iron redox» cycle//Free Radical Res. Commun. 1989. — V.6. — P.1−10.
  102. Harris L.R., Cake M.H., Macey D.J. Iron release from ferritin and its sensitivity to superoxide ions differs among vertebrates// Biochem. J.- 1994.-V.301.-P.385.
  103. Haseloff R.F., Gruner S., Wischnewsky G.G. Reactions of copper complexes with oxygen radicals generated by human neutrophils// J. Biolumin. Chemi-lumin.- 1992, — V.7(3).- P.171−175.
  104. Hassan H.M., Frdovich I. Enzymatic defenses against the toxicity of oxygen and of streptonigrin in Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1977.- V. 129(3).-P.574−583.
  105. Hassan H.M., Frdovich I. Superoxide, hydrogen peroxide, and oxygen tolerance of oxygen-sensitive mutants of Escherichia coli// Rev. Infect. Dis.-1979, — V. l (2).- P.357−369.
  106. Hassan H.M., Fridovich I. Chemistry and biochemistry of superoxide dis-mutases//Eur. J. Rheumatol. Inflamm.- 1981.-V.4(2).- P.160−172.
  107. Hatchikian C.E., Le Gall J., Bell G.R. Superoxide and superoxide dismu-tases// L. Acad. Press.- 1977, — P. 159.
  108. Hatchikian E.C., Henry Y.A. An iron-containing superoxide dismutase from the strict anaerobe Desulfovibrio desulfuricans (Norway 4)// Biochimie.-1977.- V.59(2).- P.153−161.
  109. Hughes M.N. Relationships between nitric oxide, nitroxyl ion, nitrosonium cation and peroxynitrite//Biochim. Biophys. Acta.- 1999.- № 5.-V.1411(2−3).- P.263−272.
  110. Hampton M.B., Kettle A .J., Witerborn C.C. Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils//Infect. Immun.- 1996, — V.64(9).- P.3512.
  111. Heikkila R.E., Cabbat F. Superoxide dismutase//Anal. Biochem.- 1976.-V.75.-P.356.
  112. Hiramatsu K., Arimori S. Increased superoxide production by mononuclear cells of patients with hypertriglyceridemia and diabetes// Diabetes.- 1988.-V.37(6).- P.832−837.
  113. Hogg N., Darley-Usmar V.M., Wilson M.T., Moncada S. Production of hy-droxyl radicals from the simultaneous generation of superoxide and nitric oxide// Biochem. J.- 1992.- V.281(Pt.2).- P. 419−424.
  114. Hyland K., Voisin E., Banoun M., Auclair C. Superoxide dismutase assay using alkaline dimethylsulfoxide as superoxide anion-generating system// Anal. Biochem.- 1983, — V.135.- P.280−287.
  115. Imlay J.A., Fridovich I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli// J. Biol. Chem.- 1991, — V. 266(11).- P.6957−6965.
  116. Imlay J.A., Fridovich I. Suppression of oxidative envelope damage by pseu-doreversion of a superoxide dismutase-deficient mutant of Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1992, — V. 174(3).- P.953−961.
  117. Imlay J.A., Fridovich I. Suppression of oxidative envelope damage by pseu-doreversion of a superoxide dismutase-deficient mutant of Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1992.-V.174(3).-P.953−961.
  118. Imlay J.A., Linn S. DNA damage and oxygen radical toxicity// Science.-1988,-V 240,-P.1302.
  119. Ischiropoulos H., Zhu L., Beckman J. Peroxynitrite formation from macro-phage-derived nitric oxide// Arch. Biochem. Biophys.- 1992, — V.298.-P.446−451.
  120. Kanafani H., Martin S.E. Catalase and superoxide dismutase activities in virulent and nonvirulent Staphylococcus aureus isolates// J. Clin. Microbiol.-1985.-V.21(4).- P.607−610.
  121. Kasai K., Hattori Y., Nakanishi N., Manaka K., Banda N., Motohashi S., Shimoda S.I. Regulation of inducible nitric oxide production by cytokines in human thyrocytes in culture// Endocrinology.- 1995, — V.136(10).- P.4261−4270.
  122. Keele B.B., McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase from escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme//J. Biol. Chem.- 1970.-V.245(22).- P.6176−6181.
  123. Khelef N., DeShazer D., Friedman R.L., Guiso N. In vivo and in vitro analysis of Bordetella pertussis catalase and Fe-superoxide dismutase mutants// FEMS Microbiol. Lett.- 1996, — V.142(2−3).- P.231−235.
  124. Klebanoff S.J. Bactericidal effect of Fe2+, ceruloplasmin, and phosphate// Arch. Biochem. Biophys.- 1992.- V.295(2).- P.302−308.
  125. Klebanoff S.J.Reactive nitrogen intermediates and antimicrobial activity: role of nitrite// Free. Radical. Biol, and Med.- 1993, — V.14(4).- P.351−360.
  126. Klug D., Rabani D., Fridovich I. A direct demonstration of the catalytic action of superoxide dismutase through the issue of pulse radiolysis// J. Biol. Chem.- 1972.- V.247.- P.4839−4832.
  127. Kuthan H., Haussmann M.J., Werringloer J. A spectrophotometric assay for superoxide dismutase activities in crude tissue fractions// Biochem. J.-1986.- V.237.- P.175−180.
  128. Laihia J.K., Jansen C.T., Ahotupa M. Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity// Free. Radic. Biol. Med.- 1993.- V.14(5).- P.457−461.
  129. Lissi E., Pascual C., del Castillo M.D. On the use of the quenching of lumi-nol luminescence to evaluate SOD activity// Free. Radic. Biol. Med.- 1994,-V.16(6).- P.833−837.
  130. Luis D., Ortega M.G., Lopez A.L., Gorge J.L. Catalase and superoxide dismutase// Analyt. Biochem. 1977. — V. 80. — P. 409−415.
  131. Lundberg B.E., Wolf R.E.Jr., Dinauer M.C., Xu Y., Fang F.C., Glucose 6-phosphate dehydrogenase is required for Salmonella typhimurium virulence and resistance to reactive oxygen and nitrogen intermediates// Infect. Immun.- 1999.- V.67(l).- P.436−438.
  132. Mandell G.L. Catalase, superoxide dismutase, and virulense of Staphylococcus aureus. In vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal -leukocyte interaction// J. Clin. Invest.- 1975, — P. 55, — V.561−566.
  133. Marklund S. Distribution of CuZn superoxide dismutase and Mn superoxide dismutase in human tissues and extracellular fluids// Acta Physiol. Scand. Suppl.- 1980.- V.492.- P.19−23.
  134. Marklund S. Spectrophotometric study of spontaneous disproportionation of superoxide anion radical and sensitive direct assay for superoxide dismutase// J. Biol. Chem.- 1976.- V. 251.- P.7504−7507.
  135. McCord J.M. Superoxide radical: controversies, contradictions, and paradoxes//Proc. Soc. Exptl. Biol, and Med.- 1995, — V.209(2).- P.112−117.
  136. McCord J.M., Crapo J.D., Fridovich I. In: Superoxide and superoxide dis-mutases. L.: Acad. Press.- 1977.- P.ll.
  137. McCord J.M., Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein)//Biol.Chem.- 1969, — V.244.- P.6049.
  138. McCord J.M., Fridovich I. The utility of superoxide dismutase in studying free radical reactions. I. Radicals generated by the interaction of sulfite, dimethyl sulfoxide, and oxygen// J. Biol. Chem.- 1969, — V.244(22).- P.6056−6063.
  139. McCord J.M., Keele B.B., Fridovich I. An enzyme-based theory of obligate anaerobiosis: the physiological function of superoxide dismutase//Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.- 1971, — V.68.- P.1024.
  140. McKenna S.M., Davies K.J. The inhibition of bacterial growth by hypo-chlorous acid. Possible role in the bactericidal activity of phagocytes// Bio-chem. J.- 1988, — V.254(3).- P.685−692.
  141. Meerhof L.J., Roos D. An easy, specific and sensitive assay for the determination of the catalase activity of human blood cells// J. Reticuloendothel. Soc. 1980. — V. 28. — P. 419−425.
  142. Misra H.P., Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase// J. Biol. Chem.-1972.-V.247.-P.3170−3175.
  143. Misra H.P., Fridovich I. Superoxide dismutase//J. Biol. Chem.- 1977,-V.252.- P.6421.
  144. Moore L.L., Humbert J.R., Neutrophil bactericidal dysfunction towards oxidant radical-sensitive microorganisms during experimental iron deficiency// Pediatr. Res.- 1984.- V.18(8).- P.789−794.
  145. Moreno J. J., Pryor W.A. Inactivation of alpha 1-proteinase inhibitor by per-oxynitrite// Chem. Res. Toxicol.- 1992, — V.5.- P.425.
  146. Mori M., Suzuki H., Suzuki M., Kai A., Miura S., Ishii H. Catalase and superoxide dismutase secreted from Helicobacter pylori// Helicobacter.- 1997.-V.2(2).- P.100−105.
  147. Nauseef W.M. The NADPH-dependent oxidase of phagocytes// Proc. Assoc. Am. Physicians.- 1999, — V. l 11(5).- P.373−382.
  148. Nebot C., Moutet M., Huet P., Xu JZ., Yadan JC., Chaudiere J. Spectrophotometry assay of superoxide dismutase activity based on the activated autoxidation of a tetracyclic catechol// Anal. Biochem.- 1993, — V.214.-P.442−451.
  149. Nishikimi M. Oxidation of ascorbic acid with superoxide anion generated by the xanthine-xanthine oxidase system// Biochem. Biophys. Res. Commun.-1975.- V.63.-P.463−468.
  150. Noack H., Possel H., Rethfeldt C., Keilhoff G, Wolf G. Peroxynitrite mediated damage and lowered superoxide tolerance in primary cortical glial cultures after induction of the inducible isoform of NOS// Glia.- 1999.-V.28(l).-P.13−24.
  151. Nussler A.K., Billiar T.R. Inflammation, immunoregulation, and inducible nitric oxide synthase// J. Leukocyte Biol.- 1993, — V.54(2).- P.171−178.
  152. Oyanagui, Y. Assay methods for superoxide dismutase// Tanpakushitsu Ka-kusan. Koso.- 1988, — V. 33(16).- P. 2906−2913.
  153. Oyanagui, Y. Reactive oxygen species and methods of measuring radical scavenger enzymes//Nippon. Rinsho.- 1988, — V. 46(10).- P. 2142−2148.
  154. Oyanagui, Y. Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity// Anal. Biochem.-1984.- V. 142.- P. 290−296.
  155. Paoletti F., Aldimucci D., Mocali A., Capparini A. A sensitive spectropho-tometric method for the determination of superoxide dismutase activity in tissue extracts//Anal. Biochem.- 1986.- V. 154, — P. 536−541.
  156. Peskin A.V. Cu, Zn-superoxide dismutase gene dosage and cell resistance to oxidative stress: a review// Biosci. Rep.- 1997, — V.17.- P.85.
  157. Popov I., Hornig J., v. Baer R. Photochemoluminescence method for the determination of superoxide dismutase activity// Z. med. Lab. diagn.- 1985.-V. 26.- P.417−421.
  158. Popov I., Lewin G., v. Baer R. Photochemiluminescent detection of antiradical activity. I. Assay of superoxide dismutase// Biomed. Biochem. Acta-1987,-V. 46,-P. 775−779.
  159. Pou S., Conen M.S., Brigan B.E. et al. Soin trapping and human neutrophils. Limits of defection of hydroxyl radical// J. Biol. Chem.- 1989.- V.264.-P.12 299−12 302.
  160. Printzen G. Relevance, pathogenicity and virulence of microorganisms in implant related infections// Injury.- 1996.- V. 27.- Suppl. 3.- P. SC9-SC15.
  161. Puget K., Michelson A.M. Isolation of a new copper-containing superoxide dismutase bacteriocuprein// Biochem. and Biophys. Res. Communs.- 1974.-V. 58(3).-P. 830−838.
  162. Quie P. Cates K.L. Clinical conditions associated with defective polymorphonuclear leukocyte chemotaxis// Am. J. Pathol.- 1977.- V. 88(3).- P. 711 725.
  163. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide// Arch. Biochem. and Biophys.- 1991.- V.288(2).- P.481−487.
  164. Rakita R.M., Michel B.R., Rosen H. Myeloperoxidase-mediated inhibition of microbial respiration: damage to Escherichia coli ubiquinol oxidase// Biochemistry.- 1989, — V. 28.- P. 3031.
  165. Ramasarma T. Generation of H20 in biomembranes// Biochimia et Bio-physica Acta- 1982, — V. 694(1).- P. 69−93.
  166. Rapp U., Adams W.S., Miller R.W. Purification of superoxide dismutase from fungi and characterization of the reaction of the enzyme with catechols by electron spin resonance spectroscopy// Canad. J. Biochem.- 1973.- V. 51(2).- P. 158−171.
  167. Richards D.M.C., Dean R.T., Jessup W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis// Biochim. et biophys. Acta.- 1988.-V. 946 (2).-P. 281−288.
  168. Rigo A., Tomat R., Rotilio G. Superoxide radicals and superoxide dismutase// J. Electroanal. Chem.- 1974, — V. 57.- P. 291.
  169. Root R. K., Metcalf J., Oshino M.N., Chance B. H202 release from human granulocytes during phagocytosis. I. Documentation quantation and some regulating factors// J. Clin. Infect.- 1976.- V. 58, — P. 50−60.
  170. Rosen G.M., Rou S., Ramos G.L., Cohen M.S., Britigan B.E. Free radicals and phagocytic cells// FASEB J.- 1995, — V. 9, — P. 200.
  171. Rush J., Koppenol W. Reactive intermediates formed by the interaction of hydrogen peroxide and ferrous complexes// In: Beaumont, P. et al., (eds) Free radicals, metal ions and biopolimers. Richelieu. London.- 1989.- P. 3344.
  172. Sahnoun Z., Jamoussi K., Zeghal K.M. Free radicals and antioxidants: human physiology, pathology and therapeutic aspects// Therapie.- 1997.- V. 52(4).- P. 251−270.
  173. Saltzman H.A., Fridovich I. Editorial: Oxygen toxicity. Introduction to a protective enzyme: superoxide dismutase// Circulation.- 1973.- V. 48(5).- P. 921−923.
  174. Samokyszyn V.M., Thomas C.E., Reif D.W., Saito M., Aust S.D. Release of iron from ferritin and its role in oxygen radical toxicities// Drug. Metab. Rev.- 1988,-V. 19,-P. 283.
  175. Sbarra A.J., Karnovsky M.L. The biochemical basis of phagocytosis. I. Metabolic changes during the ingestion of particles by polymorphonuclear leukocytes// J. Biol. Chem.- 1959, — V. 234, — P. 1355−1362.
  176. Scarpa M., Viglino P., Momo F., Bracco F., Battistin L., Rigo A. NMR method for superoxide dismutase assay in brain and liver homogenates// J. Biochem. Biophys. Methods.- 1991.- V. 22 (2).- P.135−144.
  177. Schaper U., Kampf A., Scheuch D.W. Determination of superoxide dismutase (EC 1.15.1.1.) in blood and other tissues// Z. med. Lab. diagn.- 1986.-V. 27(2).- P. 105−108.
  178. Sedghi S., Keshavarzian A., Klamut M. Superoxide dismutase. Introduction to a protective enzyme// Am. J. Gastroenterol.- 1994.- V. 89.- P. 2217−2221.
  179. Seres T., Knickelbein R.G., Warshaw J.B., Johnston R.B.Jr. The phagocytosis-associated respiratory burst in human monocytes is associated with increased uptake of glutathione// J. Immunol.- 2000.- № 15.- V. 165(6).-P.3333−3340.
  180. Sies H. Oxidative stress: from basic research to clinical application// Amer. J. Med.- 1991.-V.91.-P.31S.
  181. Storz G., Tartaglia L. A., Ames B. N. Transcriptional regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation// Sience.- 1990.- V. 248.-P. 189.
  182. Storz G., Tartaglia L.A., Farr S.B., Ames B.N. Bacterial defenses against oxidative stress. Involvement of reactive oxygen species in post-ischaemic flap necrosis and its prevention by antioxidants// Trends Genet.- 1990.- V. 6(11).-P. 363−368.
  183. Sugawara M., Kita T., Lee E.D., Takamatsu J., Hagen G.A., Kuma K., Medeiros-Neto G.A. Deficiency of superoxide dismutase in endemic goiter tissue//J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1988.- V. 67.- P. 1156−1161.
  184. Suzuki S., Yoshioka N., Isshiki N., Hamanaka H., Miyachi Y. Involvement of reactive oxygen species in post-ischaemic flap necrosis and its prevention by antioxidants// Brit. J. Plastic Surg.- 1991.- V. 44, — P. 130−134.
  185. Suzuki H., Mori M., Seto K., Kai A., Kawaguchi C., Suzuki M., Suematsu M., Yoneta T., Miura S., Ishii H. Helicobacter pylori-associated gastric pro-and antioxidant formation in Mongolian gerbils// Free. Radic. Biol. Med.-1999.- V.26(5−6).- P.679−684.
  186. Szado C., Salzman A.L. Endogenous peroxynitrite is involved in the inhibition of mitochondrial respiration in immuno-stimulated J774.2 macrophages// Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1995.- V. 209(2).- P. 739−743.
  187. Tatsumi T., Fliss H. Hypochlorous acid and chloramines increase endothelial permeability: possible involvement of cellular zinc//Am. J. Physiol.- 1994.-V. 267.-P.H1597.
  188. Tenner A.J., Cooper N.R. Stimylation of a human polymorphonuclear leukocyte oxidative response by the Clq subunit of the first complement component// J. Immunol.- 1982.- V.128.- P.2547−2552.
  189. Vance P. G., Keele B.B., Raiagopalan K.V. Superoxide dismutase from Streptococcus mutans. Isolation and characterization of two forms of the enzyme// J. Biol. Chem.- 1972, — V. 247.- P. 4782.
  190. Varvashevich T.N., Nikiforova L.S., Bogomazova T.V. A method of determining the catalase activity of bacteria// Lab. Delo.- 1989.- V.2.- P. 61−63.
  191. Violi F., Iuliano L., Alessandri C., Guiselli A. A simple method for evaluating platelet superoxide dismutase// Scand. J. Lab. Invest.- 1985.- V. 45(8).-P. 713−716.
  192. Vollebregt M., Hampton M.B., Winterbourn C.C. Activation of NF-kappaB in human neutrophils during phagocytosis of bacteria independently of oxidant generation// FEBS. Lett.- 1998, — №.31.- V.432(l-2).- P.40−44.
  193. Ward P.A. Mechanisms of endothelial cell injury// J. Lab. and Clin. Med.-1991.-V. 118.-P. 421.
  194. Wendel A. Enzymes: tools and targets// Basel: Karger.- 1988.- P. 161.
  195. Wilson C.B., Weaver W.M., Comparative susceptibility of group B streptococci and Staphylococcus aureus to killing by oxygen metabolites// J. Infect. Dis.- 1985.- V.152(2).- P. 323−329.
  196. Wu J., Weiss B. Two divergently transcribed genes, soxR and soxS, control a superoxide response regulon of Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1991.- V. 173(9).- P.2864−2871.
  197. Wu J., Weiss B. Two-stage induction of the soxRS (superoxide response) regulon of Escherichia coli// J. Bacteriol.- 1992.- V.174(12).- P. 3915−3920.
  198. Yost F. G., Fridovich I. An iron-containing superoxide dismutase from Escherichia coli// J. Biol.Chem.- 1973, — V. 248, — P. 4905.
  199. Yost F. G., Fridovich I. Superoxide radicals and phagocytosis// Arch. Bio-chem. Biophys.- 1974.- V. 161(2).- P. 395−401.
  200. Zanma A., Matsumoto Y., Masuho Y. Conjugates of superoxide dismutase with the Fc fragment of immunoglobulin G// J. Biochem.- 1991.- V. 110(6).- P. 868−872.
  201. Zhu L., Gunn C., Beckman J.S. Bactericidal activity of peroxynitrite// Arch. Biochem. and Biophys.- 1992, — V. 298(2).- P. 452−457.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?