Популяционно-генетический анализ экспериментов по выделению высокорекомбинантных форм растений

В настоящее время одной из основных проблем генетики является недостаточная изученность структурной и функциональной организации генетической системы рекомбинации. Из экспериментов, проведенных разными исследователями, абсолютно ясно, что такой сложный процесс, как перестройка генетического материала в мейозе эукариот зависит от эндогенных и экзогенных факторов. Так, гены-модификаторы частоты рекомбинации Сболее современное название гес-гены) известны еще с начала века CGowen, 1919, 1922, Detlefsen, Roberts, 1921, Серебров-ский, 1926). Попытки дать исчерпывающее описание сложных путей и процессов функционирования рекомбинационной системы пока не увенчались успехом.

Предлагаемая работа направлена на поиск методов использования уже полученной информации о генетической детерминации изменчивости этих процессов для повышения уровня мейотической рекомбинации в экспериментальной популяции растений. Достижение этой цели позволит увеличить спектр доступной отбору генотипической изменчивости в полиморфной популяции и ускорить селекционный процесс. Как известно, многие хозяйственно-ценные признаки отрицательно коррелируют между собой и детерминированы блоками сцепленных коадаптированных генов СЖученко, 1980, 1988). При низком общем уровне рекомбинации сложно разорвать такие блоки, чтобы совместить в новом сорте положительные свойства растений популяции. Одним из путей решения этой проблемы является повышение уровня рекомбинации во всем геноме или в отдельном сегменте хромосомы за счет отбора из полиморфной популяции гес± генотипов, увеличивающих этот уровень. Сложность отбора форм с нужными сочетаниями гее-генов заключается в том, что они не имеют самостоятельного фенотипического проявления и традиционные методы генетического анализа для выявления гес±генотипов непригодны.

Для планирования экспериментов по отбору форм растений, имеющих повышенные значения частоты рекомбинации в интересующем селекционера сегменте хромосомы, недостаточно качественных, интуитивных рассуждений. Необходимы количественные оценки эффективности различных схем отбора. В этом могут помочь методы имитационно-аналитического моделирования на ЭВМ.

Математическое описание любой биологической системы является трудной задачей. Сложность заключается в том, что практически невозможно учесть все факторы, оказывающие на нее влияние. Внутри биологической системы под воздействием сложного механизма внутренней организации и внешней среды постоянно протекают динамические процессы, поэтому ее нельзя описать набором константных величин. Биологическая система Склетка, растение, популяция и т. д.) имеет вероятностные характеристики, а любая модель, ее имитирующая, обладает рядом ограничений. При составлении модели необходимо найти оптимум сложности и точности, что достигается правильной и лаконичной формализацией моделируемых процессов.

Исходными данными для составления алгоритмов программ, с помощью которых проведена представляемая работа, стали исследования в области изучения закономерностей изменчивости частоты рекомбинации, проведенные разными авторами.

На основании предварительного имитационного моделирования проведен критический анализ существующих методов и схем экспериментов для отбора форм растений с измененными значениями частоты мейоти-ческой рекомбинации в определенных сегментах хромосом. Генетико-статистическое моделирование позволило разработать новую схему косвенного отбора высокорекомбинантных форм диплоидных растений.

Эта схема впоследствии была проверена на мутантных формах томатов в лаборатории индуцированного рекомбиногенеза МСХА.

Предлагаемая в работе схема накопления высокорекомбинантных форм представляет интерес как для генетики, так и для селекции. Она позволит целенаправленно и за более короткий срок получать оптимальные сочетания признаков в меньших по объему популяциях. Результаты данной работы применимы не только для самоопыляющихся культур. Показано, что при использовании схемы накопления в селекции перекрестноопыляющихся растений эффективно переопыление с частичным инбридингом, например, внутрисемейные скрещивания. Это открывает путь использования схемы для отбора гес±генотипов также и в популяциях животных.

Актуальность проблемы.

Полученная на данный момент информация о структурной и функциональной организации генетической системы контроля за рекомбинацией требует детального анализа и разработки методов ее применения для получения новых сочетаний признаков. Сложность этой проблемы требует нового подхода к ней, с использованием современного математического аппарата, ЭВМ и разработкой новых интеграционных параметров индикации уровня рекомбинации. Генетико-статистические методы в области исследования общих закономерностей изменчивости кроссинго-вера у высших эукариот представлены в работах A.A. Жученко, А. Б. Короля и И. А. Прейгеля. В исследованиях Л. А. Животовского, Ю. Л. Гужова, С. П. Мартынова, В. А. Драгавцева, А. В. Смиряева и других специалистов в области количественной и популяционной генетики ге-нетико-статистические методы применяются для углубленного изучения других селекционно-генетических и эволюционных проблем. Но развитие прикладных проблем использования изменчивости системы рекомбинации требует углубления генетико-математических исследований с применением ЭВМ. Такой подход позволяет планировать будущий эксперимент, заранее отсекая неэффективные методики, намечать перспективные схемы, предвидеть причины искажений интегральных генетических показателей и корректировать их с учетом условий проведения эксперимента.

Цель и задачи исследований.

Целью исследования является поиск наиболее эффективной схемы отбора форм растений, имеющих повышенные значения частоты мейоти-ческой рекомбинации в определенном маркерном сегменте хромосомы Свысокорекомбинантных форм). Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать эффективный метод косвенного отбора гес-генов, повышающих частоту рекомбинации, и соответствующую новую циклическую схему накопления высокорекомбинантных форм диплоидных растений (НЦС).

2. Подобрать параметры для оценки эффективности работы различных схем отбора высокорекомбинантных генотипов.

3. Разработать алгоритмы и ЭВМ-программы моделирования геноти-пической изменчивости частоты рекомбинации и отбора гес-систем.

4. С помощью генетико-статистических методов сопоставить эффективность известных и новой схемы отбора генотипов с повышенной частотой рекомбинации.

5. Оценить влияние факторов, затрудняющих отбор высокорекомбинантных форм растений при использовании НЦС.

6. Оценить эффективность НЦС в ситуациях моногенных и полигенных гес-систем, при различной степени перекрестного опыления, при сцеплении гес-генов между собой и с маркерными генами при разных схемах наследования гес-локусов.

7. Разработать рекомендации по проверке НДС в эксперименте с мутантными формами томата.

Научная новизна.

По результатам генетико-популяционного моделирования на ЭВМ предложена новая циклическая схема накопления высокорекомбинантных форм растений (НДС). Те же методы применены для сравнения эффективности новой и известных схем отбора генотипов с повышенной частотой рекомбинации. При моделировании учитывались различные факторы, изменяющие соотношение рекомбинантных и нерекомбинантных ге-нотипических классов: расстояние на генетической карте между гес-локусами и маркерами, а также между самими маркерными генами, различные схемы наследования гес-генов, моногенность и полигенность гес-системы, способ опыления Ссамоопыление и перекрестное опыление), отбор рекомбинантных гамет и зигот. В исследованиях использованы специально разработанные ЭВМ-программы, основанные на модификации детерминистических генетико-популяционных моделей. Они пригодны для описания структуры искусственной популяции, возникающей при частичном или полном самоопылении, отборе, анализирующих скрещиваниях и т. д. маркерных и гес-генотипов. Эффективность НДС проверена с учетом моделирования факторов, затрудняющих отбор из полиморфной популяции высокорекомбинантных форм. Разработанные рекомендации по использованию НДС впоследствии были проверены на материале мутантной коллекции томатов в лаборатории индуцированного рекомби-ногенеза МСХА и показали эффективность НДС.

— 9 -Апробация работы.

Основные положения диссертации докладывались на научных студенческих конференциях МСХА 1992;1993 г. г., на совместных заседаниях кафедры генетики и лаборатории индуцированного рекомбиногенеза МСХА 1993;1998 г. г., ежегодных научных конференциях Тимирязевской сельскохозяйственной академии 1993, 1995, 1996, 1998 г. г. Сг. Москва), на I съезде Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров (Саратов, 20−25 декабря 1994 г.).

По основным разделам диссертации опубликованы 5 научных работ, представленных в списке литературы.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, включая рисунки. Она состоит из введения, аналитического обзора литературы, собственных теоретических и экспериментальных исследований, заключения, выводов и рекомендаций, приложения. Библиография содержит 139 наименований отечественных источников и 130 зарубежных. Работа содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

— Ill -8. ВЫВОДЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ.

Несмотря на упрощенные варианты предположений о характеристиках популяций, принятых в имитационных моделях, можно сформулировать некоторые обобщенные выводы и рекомендации для изучения закономерностей влияния гес-системы у перекрестноопыляемой или самоопыляемой культуры.

1. Предварительное генетико-математическое моделирование позволяет отбросить схемы с недостаточной надежностью, наметить до проведения эксперимента пути выделения высокорекомбинантных форм, а также, в отдельных случаях, указать способы идентификации механизмов регуляции частоты рекомбинации.

2. Предложенная новая циклическая схема накопления высокорекомбинантных форм эффективна в ситуациях достаточно тесного сцепления маркерных локусов СЮ — 35сМ), если повышенная частота рекомбинации связана с какими-либо гомозиготными гес-генотипами. При более тесном сцеплении применимы методы прямой идентификации высокорекомбинантных генотипов либо схема Парсонса CParsons, 1958).

3. При использовании предложенной новой схемы накопления для перекрестноопыляемых растений желательно применять схемы переопыления с частичным инбридингом Снапример, внутрисемейное скрещивание), что существенно ускоряет отбор высокорекомбинантных форм.

4. Существуют ситуации, при которых с помощью предложенной циклической схемы невозможно установить, какова причина увеличения частоты рекомбинации при реализации схемы: отбор форм с повышенной частотой кроссинговера или другая, например, отбор форм с пониженной степенью жизнеспособности рекомбинантных маркерных гамет Сзигот) .

5. При тесном сцеплении нескольких гес-локусов между собой.

— 112.

1−10сМ) многолокусная гес-система ведет себя как моноген и динамика накопления в популяции высокорекомбинантных генотипов не отличается от однолокусной схемы. При 30−40сМ рекомбинация между гес-генами приводит к образованию новых «выгодных» их сочетаний, и в процессе реализации циклической схемы накопления частота рекомбинации между маркерными локусами повышается быстрее.

6. В большинстве случаев эффективность предложенной новой схемы накопления мало зависит от степени сцепления между гес-генами. Влияние сцепления между маркерным и гес-генами на эффективность НЦС уменьшается по мере снижения неравновесия по сцеплению между этими генами.

7. Имитационное моделирование позволяет существенно повысить степень конкретности рекомендаций по продолжительности, объемам и схемам реальных экспериментов с гее-системами, если есть дополнительная информация об экспериментальном материале (степень сцепления маркерных локусов и гомозиготности исходных форм, различия по гГ у высокои низкорекомбинантных форм, оценки влияния модификаци-онной, стохастической изменчивости и т. д.).

— из.

— 108 -7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Имитационное и аналитическое моделирование изменчивости рекомбинации не может охватить все ситуации, возникающие в реальных селекционно-генетических опытах с высшими растениями. Рассматривались лишь основные схемы наследования, ограниченное число несходных соотношений частоты кроссинговера и исходных структур популяции по гесили по Wлокусам, коэффициентов отбора и т. д. Однако, сходство качественных выводов о зависимости динамики частот рекомбинации и генов, влияющих на отбор, дает возможность обобщить результаты применения схемы отбора высокорекомбинантных форм на более сложные комплексные ситуации, выделить «типичные» и «особые» случаи.

В частности ясно, что схема рис. 1 позволяет выделять высоко-рекомбинантные формы в ситуациях, когда повышенная частота кроссинговера обусловлена гомозиготными гес±генотипами даже при полигенном наследовании. В последнем случае схема обеспечивает рекомбинацию гес-генов и выделение возможных трансгрессивных по частоте кроссинговера гомозигот. Если же повышенная частота связана с гете-розиготами по гес-локусам, то, по мере приближения популяции к равновесию по этим генам, эффективность отбора по схеме рис. 1 снижается. Если пониженная частота связана с гетерозиготами, а сходная повышенная — с гомозиготами, то, вследствие неустойчивости равновесия любой подобной схемы, будет наблюдаться постепенное увеличение частоты кроссинговера — схема также работоспособна. Если исходная маркерная дигетерозигота — популяция по гес-генам, то максимальное увеличение долей гес±аллелей, обычно, наблюдается после первого переопыления. Особый случай, когда маркерная дигетерозигота также гетерозиготна по всем гес-локусам (упрощенно: f = 0, f = 1, f = 0). Тогда, независимо от числа локусов, желательно провести минимум два.

— 109 переопыления перед выделением двойных рекомбинантов. Иначе первый этап схемы рис. 1 будет иметь низкую эффективность, хотя схема по-прежнему работоспособна.

В пункте 5.3 были указаны ситуации, при которых за два этапа схемы рис. 1 можно отличить действие отбора против рекомбинантных гамет или зигот от влияния гес-локусов на частоту кроссинговера. Но в действительности возможно одновременное действие этих двух факторов, частичное Са не полное) восстановление или даже небольшое снижение жизнеспособности гамет или зигот при «обратной» рекомбинации, снижение по этапам жесткости (8) их отбора и т. д. Динамика наблюдаемой в эксперименте частоты гГ будет зависеть от соотношения влияний таких факторов. При частичном восстановлении жизнеспособности, например, характерные колебания гГ «вверх-вниз» (рис. 14) на первом — втором этапах все же будет наблюдаться. Если дополнительно действует эффективный отбор «в пользу» рецессивных гомозигот по гес-локусу, повышающих частоту кроссинговера, то после первого этапа гГ может подняться даже выше 0,5, а на втором — резко снизится. Тот же эффект СгГ > 0,5) может проявиться при восстановлении жизнеспособности, если исходная частота кроссинговера велика СгГо> 0,3).

В принципе возможны ситуации, при которых рекомбинантные гаметы или зиготы имеют повышенную, а не пониженную жизнеспособность по сравнению с нерекомбинантными. Результаты проведенного моделирования (пункт 5.3) позволяют предсказать динамику г Г и в этих ситуациях: она будет «зеркальным отражением» динамики при снижении жизнеспособности рекомбинантов. А именно, если жизнеспособность гамет (зигот) при обратной рекомбинации восстанавливается, то перед первым этапом схемы рис. 1 гГ выше частоты кроссинговера, а после первого — ниже. После второго — снова выше. Если жизнеспособность рекомбинантов на каждом этапе выше, чем нерекомбинантных генотипов,.

— 110 то перед первым этапом гГ снова выше частоты кроссинговера, а после первого — несколько снижается, но все равно выше. То же — в последующих этапах: гГ постепенно приближается «сверху» к частоте кроссинговера. Динамика частоты аллеля ад так же «зеркально» изменяется по сравнению с установленной в пункте 5.3.

Генетическая рекомбинация играет большую роль в микроэволюционных процессах: способствует элиминации вредных мутаций, участвует в преобразовании генетического материала популяции. Индуцированный рекомбиногенез имеет высокое селекционное значение. Его использование позволяет быстро создавать генетическое разнообразие в экспериментальной популяции с целью получения родительских форм с заданными свойствами. Применение предлагаемой в работе новой схемы выделения высокорекомбинантных форм позволит повысить эффективность селекции высших диплоидных растений.