Короткие олигопептиды с преобладающей конформацией

Актуальность проблемы.

Загадка сворачивания глобулярных белков существует уже давно. Многие особенности процесса сворачивания белка до сих пор остаются неясными. Конечной стадией этого процесса для многих известных белков является достижение достаточно строго определенной структурной организации — глобулы с высокой плотностью укладки полипептидной цепи. Считается, что сворачивание белков диктуется термодинамическими условиями, и конечная структура тогда является энергетическим минимумом. Время достижения конечного состояния в случае однодоменных белков небольшого размера порядка секунды и меньше, эти значения кажутся весьма малыми (парадокс Левинталя). Более того, для ряда однодоменных глобулярных белков установлено, что переход из денатурированного состояния в нативное и обратно, имеет черты, сходные с фазовым переходом первого рода, и осуществляется по принципу все или ничего. «Парадокс Левинталя», был разрешен A.B. Финкельштейном. В случае большого числа белков при денатурации наблюдается стабильное состояние, отличное от нативного неупорядоченностью боковых групп аминокислотных остатков, но сохраняющее значительную часть вторичной структуры и пространственного хода белковой цепи нативного состояния — расплавленная глобула. Ренатурация из полностью денатурированного состояния в этом случае проходит через подобное состояние, что, кстати, отражается на кинетике их сворачивания.

Значительное влияние на скорости поиска оптимальных для функционирования структур биополимеров мог бы оказать доменный принцип построения последовательностей химических символов в них. Очевидная актуальность тематики, связанной с анализом доменной организации на разных уровнях строения биополимеров, характерна для исследований в области физики белка в течении нескольких десятилетий.

В последнее время изучен новый класс так называемых «нативно неупорядоченных белков». Плотная глобула в них может возникать после взаимодействия с лигандами или образования комплексов с другими биополимерами. Это повысило интерес к проблемам структуроробразования коротких пептидов и олигопептидов в составе белков.

Считается, что в целом структура коротких олигопептидов определяется множеством внешних факторов, с другой стороны, некоторые фрагменты белковых глобул в определенных условиях могут проявлять склонность к конкретной пространственной структуре, о чем, кроме 4 представленных в одной из наших работ данных, свидетельствует большое количество наблюдений и компьютерных симуляций. Нам удалось выявить следующие характеристики коротких тетрапептидов, проявляющих предпочтения к определенным конформационным состояниям: доля таких тетрапептидов во всем' списке комбинаторно возможных тетрапептидов составляет чуть менее 1%- доля общей длины фрагментов, составленных из стабильных олигопептидов, от общей длины аминокислотной последовательности всей выборки, из которой конформационно стабильные олигопептиды получены, — 0,04- предпочтительная конформация обнаруженных в работе стабильных последовательностей — а-спиральаминокислотные последовательности структурно устойчивых пептидов достаточно разнообразны.

Такие фрагменты" белковых последовательностей, иногда даже в изолированном состоянии в растворе принимают ту конформацию, в которой они находятся в составе белковых глобул. Даже небольшие фрагменты, длиной от десяти и меньше аминокислот, нередко воссоздают структуру, свойственную им в составе белка. В' некоторых подходах к предсказанию белковых структур используют конформационные свойства пептидов из РБВ. Можно ли ожидать предпочтения определенных структур у коротких пептидов, насколько распространено это явление, начиная с какой длины и в каких условиях его можно наблюдать, и какую роль (и) оно может играть в складывании и стабильности белка? Показано, что в некоторых случаях структуры олигопептидов, длиной в восемь аминокислот, рассчитанные с помощью методов молекулярной динамики, и их конформационные состояния в нативной белковой глобуле совпадают. В одной из работ, проведенных ранее в нашей лаборатории, предсказание такой структуры как левая спираль типа полипролин II проводилось на основе сбора информации. по всем конформациям, которые принимает конкретный тетрапептид в составе белков во всем банке РБВ. Так образом определяются предпочтения к этой конформации. К сожалению, в-данном методе определение преференций было проведено только для канонических конформаций и конформации с комбинациями углов ф и у, свойственных каноническим.

Предрасположенность большинства коротких фрагментов к каким-либо структурам в составе белковой глобулы, скорее всего, не определяется дальними взаимодействиями, и может быть обусловленной либо особенностями входящих в олигопептид аминокислот, либо некоей предысторией образования белковых глобул. Подобную предпочтительность можно увидеть, сравнивая принимаемые олигопептидом конформации в различных структурах.

Возможная и, как мы видим, весьма вероятная предпочтительность определенных выраженных конформационных вариантов для некоторых аминокислотных последовательностей в структурах 5 белковых глобул, являясь структурным инвариантом, может играть важную роль в складывании белковой глобулы и, быть может, в поддержании её структуры. А в таком случае указанная предпочтительность становится важным моментом в разрешении давно поставленной задачи, которую называют кратко — проблема белка.

Так или иначе, но поиск и изучение коротких олигопептидов является крайне важным моментом в изучении природы белка, даже если и не полагать ключевой их роль в процессе создания и определения верной укладки нативной молекулы. Во-первых, интересным является вопрос о наличии структурно самостоятельных элементов глобулы. Во-вторых, возможно, подобные фрагменты могут нести информацию о начальных этапах организации глобулы белка, экспериментальные методы изучения которых весьма и весьма ограничены. В-третьих, короткие фрагменты по причине небольшого количества включенных элементов достаточно легко моделируются с помощью численных компьютерных методов, и информация о структурной определенности в этом плане может иметь ценность сама по себе.

Цели и задачи исследования.

— Разработка метода выявления стабильных олигопептидов и создания списка (каталога) таких фрагментов для последующего исследования.

Структурную стабильность короткого аминокислотного фрагмента можно понимать как энергетическую выгодность определенной конформации для выбранного пептида (основной проблемой этого способа является выбор приемлемого метода обсчета энергетики), или как статистически наблюдаемое предпочтение определенной организации в структурах достаточно широкого набора белков (главный недостаток — статистический (вероятностный) смысл результата и сложность его интерпретации). В данной работе применяется второй вариант, поскольку она является продолжением серии работ, основанных на таком подходе. Если предрасположенность к каким-либо структурам в составе белковой глобулы, объясняется! именно локальными взаимодействиями, и может быть обусловленной, по большей части, особенностями входящих в олигопептид аминокислот. Это значит, что преференции к включению в различные структуры можно увидеть, сравнивая принимаемые данной короткой последовательностью конформации. Первый этап данной работы состоит в определении олигопептидов, находящихся в большинстве белков в одной и той же структуре с последующим изучением основных типов предпочтительных конформационных состояний олигопептидов. Хотя сам факт наличия коротких фрагментов, проявляющих постоянство структурных свойств, интересен, однако, настоящую ценность может иметь только исследование особенностей их включения в белковые структуры, для полноценного 6 и систематичного исследования коих необходимо создать удобную для последующих исследований базу данных, содержащую пространственные и статистические характеристики каждого из определенных как стабильные олигопептидов.

— Исследования характерных структурных и аминокислотных свойств всего набора выбранных последовательностей.

Отметим, что получение стабильных олигопептидов есть не столько результат, сколько получение материала для исследования. Важной промежуточной задачей проведённой работы было изучение конформационных свойств как последовательностей, аннотированных стабильными, в целом, так и аминокислотных остатков, составляющих такие полипептидные цепи белков. Первое важно для общего понимания используемых стабильных геометрий, и разделения их на независимые группы. Второе важно в решении задачи выявления закономерностей в аминокислотных последовательностях стабильных олигопептидов в составе белковых глобул. Наиболее приемлемый способ решения этой задачи — частотный анализ.

— Изучение некоторых частных случаев включения стабильных олигопептидов в отдельные белковые структуры.

В этом плане интересны случаи включения этих фрагментов в белки, по отношению к которым возможна дополнительная интерпретация факта наличия и расположения таких статистически стабильных элементов (таких как проколлаген). Исследование таких частных случаев заключается в простой разметке стабильных фрагментов с последующим изучением расположения таких фрагментов в белковой последовательности и, если возможно, в наблюдаемой пространственной структуре.

— Сопоставление разметки стабильных фрагментов в белковых последовательностях и полоэ/сений экспериментально определенных ядер сворачивания.

Важными моментами исследования так же является наложение положения стабильных олигопептидов в белковой последовательности на значения величины Ф по которой определяются положения ядер сворачивания. Такие заключения правильнее делать на основе корреляционного анализа.

— Изучение распределения стабильных участков по глобулярным структурам. Оценка расположения и ориентации между соседствующими в пространстве последовательностями с преобладающей конформацией.

Пытаясь перейти от локального порядка к правильной укладке белковой цепи, от малых структурных инвариантов к контролю архитектуры белковой глобулы, следует ожидать, что такие структурноопределённые позиции по некоторому общему принципу влияют на остальные элементы переходного состояния. Кроме того, допустимо, и если это действительно так то, стало быть, значимо взаимодействие между такими, быть может, инициирующими мотивами и их 7 взаимное действие на перестраиваемое окружение. В таком случае, изучение распределения стабильных олигопептидов в аминокислотных последовательностях и в структуре глобулы, их взаимное расположение и ориентация может дать интересные результаты, позволяющее подойти ближе к исследованию роли таких элементов в определении структурных мотивов и физических или иных причин наблюдаемой стабильности. Метод исследования взаимного расположения в данной работе основывается на изучении диаграмм взаимных минимальных расстояний (средних для исследования взаимной ориентации) • между стабильными олигопептидами и сравнения результатов с соответствующими расстояниями между случайными участками, усредненными с помощью метода Монте-Карло.

— Изучение сходства и различий в картинах расположения стабильных олигопептидов по структурам белков с близкими архитектурами, но с различной аминокислотной последовательностью.

Качественную оценку соответствия картины расположения стабильных олигопептидовпо глобулы и самой этой белковой структуры можно провести на примере некоторого набора белков одного семейства с близкими структурами на основе различных аминокислотных последовательностей (к примеру, из семейства глобинов).

Научная новизна.

Научная новизна работы связана с оригинальностью постановки задачи, заключающейся в разработке критерия выделения конформационно-стабильных участков, метода, реализующего использования этого критерия и, наконец, результатов сканирования полного банка данных белковых структур, обобщенных в Списки конкретных конформационно-стабильных пептидов. Подобного рода информация получена впервые и ранее не содержалась в работах других авторов .

Впервые показана высокая плотность расположения конформационно-стабильных участков, в пространстве глобулы, что означает важность определенных конформационно-стабильных участков для дальнейшего прогресса в понимании закономерностей процесса сворачивания глобулы.

Практическое значение работы.

Набор коротких фрагментов, обладающих особенно ярко выраженной конформационной стабильностью, можно использовать в задачах предсказания вторичной структуры белковых молекул. Фрагменты, характеризующиеся высокой конформационной стабильностью, 8 перспективно использовать для дизайна белков в качестве фиксированных «строительных блоков». Список олигопептидов, обладающих предпочтительными структурами представляет интерес не только в фундаментальном, но и в практическом плане, в частности, может быть использован при констру ировании биологически активных соединений пептидной природы.

Основные положения, выносимые на защиту.

— Наличие коротких пептидных фрагментов демонстрирующих высокую предпочтительность к определенным конформационным состояниям.

Обнаружено, что у полуторы тысячи тетрапептидов из 160 000 комбинаторно возможных в белках проявляются предпочтения к определенным конформационным состояниям. Особенностями полученного списка коротких последовательностей заключается в том, что подавляющее число конформационно стабильных тетрапептидов находится в а-спиральной форме.

— Особенности аминокислотного состава конформационно стабильных олигопептидов. Отметим, что в стабильных а-спиральных олигопептидах, по сравнению с суммарной частью белковых последовательностей, находящихся в конформации а-спирали, повышено содержание остатков таких аминокислот, как аланин, аргинин, глутаминовая кислота, лейцин, изолейцин, валин. А так же наблюдается пониженное содержание таких аминокислот, как триптофан, тирозин, валин, гистидин, глицин, аспарагин, т. е. всех а-спираль дестабилизирующих боковых радикалов. Т. е. короткие а-спиральные пептиды с предпочтительными конформациями стабилизируются массивными боковыми радикалами, как и остальные а-спиральные фрагменты белков, но более строго.

— Стабильные олигопептиды в пространственной структуре располагаются близко друг к другу. Найдено большое количество соседствующих конформационно-стабильных олигопептидов. Так более 60% стабильных фрагментов находятся на расстоянии не превышающем 5А от других стабильных олигопептидов. Этот факт, по видимому, обусловлен числом таких фрагментов в составе белковых последовательностей и геометрией белков, в которые они включены.

— Параметры. характеризующие статистику расположения и ориентации стабильных олигопептидов в составе глобулы сходны с соответствующими параметрами статистики располоэ/сения случайно выбранных фрагментов такой же длины.

Сходные значения характеристик полученных распределений свидетельствуют об их близости. В представленной работе различия между статистическими характеристиками взаимного расположения конформационно-стабильных олигопептидов и статистики случайно выбранных участков (метод усреднения по своему принципу является методом Монте-Карла), рассчитанных по наборам белков, содержащих в первом случае более 700 структур, во втором — порядка 500, 9 невелики и могут быть отнесены на счет неточностей схемы, лежащей в основе метода генерации случайных позиций, и недостаточности данных, а потому взаимное расположение стабильных олигопептидов в некотором приближении можно считать случайным, по крайней мере, сильных тенденций к сближению между конформационно-стабильными участками нет. — В случае набора специально отобранных белковых структур, различия используемых характеристик статистики взаимного расположения стабильных и случайных олигопептидов заметно возрастает.

Нами была рассмотрена подвыборка белков, структуры которых удовлетворяли специальным требованиям. Были выбраны лишь крупные белки, чья структура была исключительно а-спиральной, с большим числом отдельных сегментов соседствующих с незначительной частью остальной глобулы. В этом случая) можно полагать, что в процессе образования нативной структуры, произойдет меньше нарушений локального порядка (поскольку образуется меньшее число контактов). При генерации случайных позиций фрагментов, количество соседствующих участков из-за геометрии структуры понижено. Результаты демонстрируют большое число соседствующих фрагментов, заметно превосходящее число соседствующих фрагментов со случайным распределением по глобуле.

Апробация работы и публикации.

Выводы.

1. На полном массиве информации о структурах белков уточнены частоты встречаемости характерных конформаций остатков в полипептидной цепи. На карте Рамачандрана локализованы области, характерные для различных типов вторичной структуры. В отличие от принятого выделения двух основных типов вторичной структуры: ос-спирали (ср ~ -65° ~ -45°) и р-структуры (ф —120° ц/ ~ +110°) показано, что имеется и плотно заполненная область левой спирали типа полипролин II (ф -60° [/ —И 50°). Установлено, что частоты встречаемости остатков в области левой спирали типа полипролин II и в р-структуре примерно равны. Это опровергает звучащие утверждения о несущественном наличии левоспиральной конформации в белках и демонстрирует обоснованность введения классификации конформаций по трём основным типам: а-спирали, р-структуры, левой спирали типа полипролин II.

2 Подавляющее число конформационно-стабильных тетрапептидов находится в а-спиральной форме. В конформационно-стабильных а-спиральных олигопептидах наблюдаются особенности аминокислотного состава характерные для этого типа вторичной структуры, но существенно более сильно выраженные.

3. Установлены конформационные особенности олигопептидных фрагментов. Для всех возможных 160 000 тетрапептидов построены таблицы конформаций составляющих их остатков. Получены частоты появления каждого остатка (с 1-го по 4-ый) тетрапептидов в каждой из трёх основных областей конформационной карты: а-спирали, ß—структуры и левых спиралей типа полипролин II. Для каждой из трёх основных вторичных структур сформированы Списки «предпочитающих» их тетрапептидов.

4. Охарактеризовано взаимное расположение конформационно-стабильных олигопептидов в белковой глобуле. Показано, что в структуре глобулы конформационно стабильные олигопептиды располагаются на близких расстояниях, что может являться ключевым моментом в складывании и стабильности белковой глобулы.

5. Наблюдается сходство в параметрах, характеризующих статистику расположения и ориентации стабильных олигопептидов в составе глобулы с соответствующими параметрами статистики расположения случайно выбранных фрагментов такой же длины. Большое количество случаев близкого взаимного расположения случайных олигопептидов свидетельствует о том, что значительная часть последовательности белка в глобулярной структуре находится недалеко от фрагментов с преобладающей конформацией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Батяновский A.B., Власов П. К. Короткие фрагменты белковой глобулы с преобладающей конформацией. Биофизика, 2008, т. 53, с. 556−561.

2. Батяновский A.B., Есипова Н. Г., Шноль С. Э. О взаимном расположении коротких конформационно стабильных олигопептидов в структуре глобулярных белков. Биофизика, 2009, т. 54, с. 1137−1143.

Заключение

.

Научная новизна.

Несмотря на обширные исследования конформаций полипептидных цепей в белках и конформаций боковых радикалов аминокислотных остатков, ранее не предпринимались попытки, провести подобный анализ на всём многообразии представленных в публичном доступе структур белков и их комплексов и использовать полученные олигопептиды для исследования структурных особенностей белковых глобул, связанньрс с ними. Поэтому, ранее полученные данные о конформационных свойствах аминокислотных остатков, олигопептидов и целых белковых цепей зачастую отражали свойства небольшой группы белков, служивших объектом исследования. В данном случае собрана обобщающая статистика конформаций для всех остатков, составляющих все белковые цепи из банка данных РБВ, в котором воедино собрана вся информация о структурах, полученная мировым сообществом за все года исследования биополимеров. ¦