Полиморфизм и особенности экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета у пациентов с тяжелой термической травмой

По данным ВОЗ, ожоги занимают третье, а в некоторых странах (Япония) — второе место по частоте среди прочих травм, уступая лишь транспортной травме. В последние годы распространенность ожогов в России вновь стала нарастать и составила 294,2 случая на 10 тысяч населения. Среди госпитализированных в 2002 году в России 58,3% было взрослых и 41,7% детей. Отмечается тенденция к увеличению числа больных с обширными ожогами. Летальность при термических поражениях в России достигает 2,1—3,3%. При глубоких ожогах процент летальности значительно выше [3].

Считается, что летальность пациентов с ожоговой травмой может зависеть от трех основных причин (это клинические синдромы, которые по сути составляют структуру ожоговой болезни): ожоговый шок, возникающий в течение нескольких первых часов после травмыреспираторные осложненияи септические осложнения, способные развиться в течение нескольких недель после травмы. Наиболее частой причиной смерти обожженных являются инфекционные осложнения ожоговой болезни [1, 2, 13,33, 126].

Важность проблемы сепсиса подчеркивает возникшее в 2002 году международное движение специалистов «Переживем сепсис», поставившее перед собой задачу 25% снижения летальности в течение ближайших пяти лет [25]. Несмотря на всю серьезность этой проблемы [22, 23, 26], до сих пор не существует общепринятой классификации и четкого определения такого понятия как ожоговый сепсис. Данное положение вещей значительно усложняет диагностику и прогноз, а также подходы к профилактике и лечению септических состояний у ожоговых больных [8]. Кроме того до сих пор не достаточно ясной является картина иммунологических особенностей сепсиса, возникающего на фоне ожогов.

В 2001 году группой авторов (Levy М.М., Fink М.Р., Marshall J.C. et al.) была предложена классификационная схема развития сепсиса PIRO: синдром системного воспалительного ответа (ССВО), сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. В ее основе положена характеристика определенных персональных свойств больного, а именно: конституционные особенности больного, особенности и локализация повреждающего фактора, системная реакция организма хозяина, выраженность сопутствующей органной дисфункции [86, 87, 150]. Использование PIRO системы позволяет придти к заключению, что различные генетические составляющие индивидуума являются детерминирующими признаками риска развития осложнений и преждевременной смерти, связанной с сепсисом.

И действительно современная концепция патогенеза инфекционных заболеваний основана на изучении генетических ассоциаций специфических кандидатных генов, вовлеченных в регуляцию иммунного ответа. Согласно этой концепции, генетические факторы человека играют главную роль в исходе инфекционных заболеваний [37, 75, 148].

Таким образом, на сегодняшний день одной из задач исследователей при рассмотрении проблемы сепсиса является поиск генов-кандидатов предрасположенности/устойчивости к данному заболеванию [129, 134, 135]. Помимо этого еще одним приоритетным направлением является индикация специфических маркеров, чётко отражающих степень тяжести заболевания и результативность лечения и позволяющих вовремя диагностировать и делать прогноз развития ожогового сепсиса. Одним из достоверных показателей происходящих в организме изменений является экспрессия иммунокомпетентных генов. Считается, что, уловив изменения в экспрессии генов, продукты которых участвуют в иммунопатогенезе сепсиса, станет доступным четкая своевременная оценка состояния больного и прогноз дальнейшего развития и исхода заболевания.

Исходя из вышесказанного, данная работа посвящена исследованию полиморфизма генов цитокинов и рецепторов врожденного иммунитета у ожоговых больных, а так же оценке уровней экспрессии данных генов.

Цель исследования.

Провести сравнительный анализ особенностей распределения аллелей/генотипов иммунокомпетентных генов и уровней их экспрессии у лиц, проживающих в Челябинской области: здоровых и пациентов с тяжелой термической травмой, для выделения генетических маркеров предрасположенности/устойчивости развития сепсиса, прогноза его течения и исхода, которые могут использоваться при дополнительном мониторировании течения ожоговой болезни.

Задачи исследования.

1. Выявить общие закономерности в распределении аллельных вариантов генов IL-10, TLR2 и TLR4 среди европеоидов Челябинской области и оценить уровни экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, CIITA, цитокинов IL-lp, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых лиц различных популяционных групп, проживающих в Челябинской области, для создания групп контроля.

2. Определить особенности распределения генотипов и аллелей генов цитокинов IL-IRa, IL-lp, TNFa, IL-10 и рецепторов врожденного иммунного ответа TLR2, TLR4 у лиц русской популяции, проживающих в Челябинской области: здоровых и больных с тяжелыми ожогами.

3. Изучить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-IRa, IL-ip, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4 при различных клинических вариантах и исходах септического процесса у ожоговых больных.

4. Определить особенности экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у ожоговых больных по сравнению со здоровыми лицами.

5. Изучить различия в экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, CIITA, цитокинов IL-1|3, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 на различных клинических стадиях септического процесса с учетом исхода у ожоговых больных.

6. Оценить возможную связь особенностей экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 с наличием полиморфизмов генов IL-IRa, IL-ip, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4.

Научная новизна.

Впервые установлены распределения частот аллельных вариантов и генотипов генов TLR2, TLR4, IL-10 у.е.вропеоидов Челябинской области.

Определены полиморфные варианты генов цитокинов и TLR, отвечающих за предрасположенность/устойчивость к развитию сепсиса и его осложнений у пациентов с ожоговой травмой.

Впервые получены данные об уровнях экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 среди здоровых индивидов Челябинской области.

Показаны особенности экспрессии генов основных цитокинов, рецепторов врожденного иммунитета и генов адаптивного иммунного ответа, отвечающих за презентацию антигена у пострадавших на различных стадиях ожоговой болезни, и представлены предиктовые иммуногенетические маркеры развития сепсиса с синдромом ПОН и его неблагоприятного исхода.

Впервые проведен поиск связи между особенностями экспрессии генов и их полиморфизмом у лиц, проживающих в Челябинской области.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предрасположенность и устойчивость к развитию сепсиса у больных с тяжелой термической травмой может определяться особенностями иммуногенетического статуса пострадавших: повышенная частота встречаемости генотипов 2г/2г и 4г/5г гена IL-IRa, аллеля 753*А и генотипа G/A гена TLR2 у ожоговых больных по сравнению с донорами может свидетельствовать о предрасположенности лиц с наличием данных генотипов к развитию сепсиса при ожоговой болезни, а наличие генотипа 2г/4г гена IL-lRa, аллеля 753*G и генотипа G/G гена TLR2 может обеспечить протекторный эффект. Более того, развитие сепсиса с синдромом ПОН (полиорганная недостаточность) четко ассоциировано с гетерозиготностью гена IL-10 в точке -819 и наличием гаплотипа GTA гена IL-10 -1082/-819/-592.

2. У пациентов с тяжелой термической травмой по сравнению со здоровыми индивидами наблюдаются одновременные изменения в экспрессии генов прои противовоспалительных цитокинов: снижение уровней экспрессии IL-6, IFNy, повышение экспрессии IL-1(3, TNFa, IL-10, и повышение экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 на фоне снижения экспрессии генов адаптивного иммунитета HLA-DRA, — DMA, СИТА и TREM-1. Установленные закономерности позволяют прогнозировать развитие сепсиса, сепсиса с синдромом полиорганной недостаточности и его исход на ранних сроках течения ожоговой болезни.

Практическая значимость.

Данная работа носит фундаментальный характер. Нами установлены общие закономерности распределения частот полиморфных вариантов генов IL-10, TLR2, TLR4 у здоровых представителей русской популяции.

Челябинской области. Установлены общие закономерности экспрессии генов основных цитокинов IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, СИТА, TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 у здоровых представителей населения Челябинской области. Полученные данные могут быть использованы в качестве контроля при решении ряда задач по направлению «иммуногенетика» и «HLA и болезни», а именно: при изучении ассоциации иммуногенетического статуса с предрасположенностью/устойчивостью индивидов к различным заболеваниям, оценки прогноза тяжести течения и их исхода, выбора адекватных методов медикаментозной терапии, мониторинга и разработки современных биотехнологических процессов, в плане создания препаратов группы предиктовой медицины и персонифицированной терапии.

Полученные результаты позволили установить у ожоговых больных наличие генов предрасположенности/устойчивости, определяющих течение ожоговой болезни — развитие сепсиса, осложненного сепсиса и его исход. Следовательно, изучение иммуногенетического статуса индивидов дает возможность своевременно определить риск развития осложнений и индивидуальную тактику лечения при возникновении критических состояний, вот числе таких, как тяжелая ожоговая травма.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследовательской работы внедрены в учебный процесс: включены в список обязательной литературы для студентов и в лекционный курс дисциплины «Иммунный гомеостаз в норме и патологии» магистерской программы «Медико-биологические науки» на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждались в виде научных докладов на конференциях: конференция зональной лаборатории иммунологического типирования тканей «Фундаментальное и прикладное значение оценки генов иммунного ответа» (г. Челябинск, 2008), XIII Всероссийский форум с международным участием им. Академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2009), «VIII конференция Иммунологов Урала» (г. Сыктывкар, 2010), научно-практическая конференция «Инфекции кровяного русла» (г. Челябинск, 2011), «IX конференция Иммунологов Урала» (г. Челябинск, 2011), VI международная западно-восточная конференция по иммуногенетике EWIC (Чехия, 2012).

По материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. и.

ВЫВОДЫ.

1. В группе ожоговых больных предрасположенность/устойчивость к развитию сепсиса определяется полиморфными вариантами генов IL-IRa и TLR2. Маркерами предрасположенности являются: повышенная частота генотипов 2г/2г и 4г/5г гена IL-IRaповышенная частота аллеля *753А и генотипа G/A гена TLR2. Протекторный эффект на развитие сепсиса оказывают: повышенные частота генотипа 2г/4г гена IL-IRa, аллеля *753G и генотипа G/G гена TLR2.

2. Выявлены общие закономерности в частотах встречаемости генов IL-10, TLR2, TLR4 у здоровых представителей русской популяции Челябинской области, которые укладывается в рамки европейских популяций. Установлены общие особенности экспрессии генов основных цитокинов и рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета среди здоровых людей, проживающих в Челябинской области.

3. Маркерами предрасположенности развития осложненного течения сепсиса у ожоговых больных являются гетерозиготность гена IL-10 в точке -819 и гаплотип GTA гена IL-10 -1082/-819/-592.

4. При тяжелой термической травме происходят изменения в экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов: снижение экспрессии генов цитокинов IL-6, IFNy и одновременное повышение экспрессии генов цитокинов IL-1Э, TNFa, IL-10. Кроме того, у больных с тяжелыми термическими травмами повышена экспрессия генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и одновременно снижена экспрессия генов адаптивного иммунитета HLA-DRA, -DMA, СИТА и TREM-1 по сравнению со здоровыми индивидами.

5. Предиктовыми показателями развития сепсиса с синдромом ПОН и неблагоприятного исхода у ожоговых больных на 10−17 сутки можно считать пониженную экспрессию генов HLA-DRA, -DMA, IFNy и повышенную экспрессию генов TNFa, TLR2, TLR4 и TREM-2.

6. Полиморфизм генов IL-IRa, TLR2, IL-10 не оказывает влияния на уровни их экспрессии.

Список используемых сокращений.

ОТ Обратная транскрипция.

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов.

ПЦР Полимеразная цепная реакция.

ПОН Полиорганная недостаточность.

HLA Human leukocyte antigen / человеческий лейкоцитарный антиген.

МНС Major histocompatibility complex / главный комплекс гистосовместимости IFN Интерферон.

IL Интерлейкин.

IL-IRa Рецептор-антагонист интерлейкина-1.

PAMPs Pathogen-associated molecular pattern / Паттерн патогенассоциированных молекул PIRO Факторы предрасположенности (Predisposing factors — Р), особенности этиологии и локализации первичного очага (Infection — I), системная реакция организма (Response — R), выраженность органной дисфункции (Organ disfunctionО).

SNP Single Nucleotide Polymorphism, полиморфизм по одному нуклеотиду.

SIRS/CCBO Systemic inflammatory response syndrome / Синдром системного воспалительного ответа Th Т-хелперы.

TNFa Фактор некроза опухолей a.

TREM Триггерный рецептор на миелоидных клетках.

TLR Toll-like receptors / Толл-подобные рецепторы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Данное исследование имеет два основных направления и посвящено, во-первых, анализу вклада аллельных вариантов и генотипов генов ТЫ12, ТЪЯ4, 1Ь-1Яа, 1Ь-1р, 1Ь-10, Т№а, в предрасположенность, варианты клинического течения и исход сепсиса у пациентов с ожоговой травмойи, во-вторых, особенностям экспрессии генов адаптивного и врожденного иммунитета, как основному признаку, отражающему клиническое состояние ожоговых больных на определенный момент времени. Тема исследования выбрана в связи с тем, что иммунный ответ на ожоговую травму, в который вовлечены белковые продукты генов Т1Л12, Т1П4, 1Ь-1Ка, 1Ь-10, 1Ь-1(3, ТЫБа, во многом определяет течение ожоговый болезни, предполагается участие этих генов в развитии предрасположенности/устойчивости к развитию сепсиса, клинических вариантов его течения и исхода. В то же время экспрессия генов отражает изменения, происходящие в организме на данный момент времени, иными словами показывает соотношение между генетическими особенностями организма и клиническими проявлениями этих особенностей в виде иммунного ответа на травму.

Таким образом, мы изучали, насколько значима ассоциация генов рецепторов и цитокинов с предрасположенностью к ожоговому сепсису. А так же, на сколько параметры экспрессии могут отражать клиническое состояние ожоговых пациентов и прогнозировать исход заболевания.

В ходе проведенного исследования нами был поставлен ряд задач, по результатам решения которых можно сделать следующие заключения.

1. Первой задачей было определить особенности распределения генотипов и аллелей генов 1Ь-1Яа, 1Ь-1р, ТМ^а, 1Ь-10, ТЬЯ2 и ТЬЯ4 у ожоговых больных с сепсисом по сравнению со здоровыми лицами русской популяции. Необходимость формирования этнически однородной исследуемой выборки (русские Челябинской области) и соотносимым с ней по национальности контролем диктуется данными о различных частотах встречаемости SNP в разных этнических группах [74]. Так, в работе Сташкевич Д. С. [4] установлены особенности распределения генов основных цитокинов в популяциях русских и башкир Челябинской области и показано, что и для распределения генов цитокинов характерны межпопуляционные различия. Кроме того, по данным многих авторов, формирование предрасположенности к заболеваниям так же может иметь этнические особенности.

Таким образом, необходимо было провести оценку распределения аллелей и генотипов генов цитокинов среди практически здоровых представителей русской популяции и изучить вклад генов IL-IRa, IL-1(3, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4 в предрасположенность к развитию сепсиса у ожоговых больных.

Поскольку анализ распределения полиморфных вариантов генов TLR2, TLR4 и IL-10 среди здоровых лиц европеоидной популяции Челябинской области впервые проводился в нашем исследовании, мы сравнили полученные результаты по данным полиморфизмам с основными мировыми популяциями. Распределение частот генотипов IL-10 -G1082A укладывается в рамки европейских популяций с преобладанием гетерозиготности (52,6%). Для европейских популяций гетерозиготность варьирует в пределах 27,7−58% [34]. Частота гомозигот дикого типа (G/G) незначительно превышает частоту гомозигот с заменой аллеля (А/А) — 26,8% и 20,6% соответственно. Эти данные так же укладываются в частоты, наблюдаемые в популяциях европеоидов (18−39% и 13−49% соответственно). Нами установлено преобладание частоты гомозиготных генотипов дикого типа в точкахС819Т.

58%) иС592А (60,6%) над гетерозиготами С/Т и С/А (40% и 34% соответственно). Частота гомозигот с заменой аллеля -819 Т/Т (2%) приближается к минимальной среди европейских популяций и схожа с таковой у итальянцев. Частота гомозигот с заменой в точке -592 А/А (5,3%) приближается к частоте, наблюдаемой среди англичан и итальянцев. Кроме того, данные по распределению полиморфизмов, полученные нами среди европеоидов Челябинской области, соотносимы с результатами, полученными в популяции европеоидов Западной Сибири [34].

При распределении генотипов генов TLR2 и TLR4 в нашем исследовании наблюдалось преобладание гомозигот дикого типа: TLR2*753 G/G — частота 95,3%, TLR4*299 А/А — 86,1% и TLR4*399 С/С — частота 86,6%. Гетерозиготы составили: *753 G/A — 3,5%, *299 A/G — 13% и *399 С/Т — 12,5%. Частоты аллелей с заменой в генах TLR у европеоидов Челябинской области представлены следующими значениями: А*753 — 3%, G*299 — 7,4% и Т*399 — 7,1%. Наши данные укладываются в рамки других исследований, проведенных в популяциях Европы и Северной Америки [79, 118], где также наблюдается низкая частота встречаемости аллелей с заменой в генах TLR. Полиморфизмы в точках TLR4*299 и TLR4*399 находятся в неравновесном сцеплении.

Далее перейдем к результатам, полученным при сравнительном анализе группы ожоговых больных и группы контроля. 2. Анализ, проведенный в нашем исследовании, показал наличие достоверных различий в частотах встречаемости генов IL-lRa (VNTR) и TLR2*753G/A у ожоговых больных по сравнению со здоровым контролем. Частоты полиморфизмов IL-l? +3953С/ТIL-10 -1082G/A, -819С/Т, -592С/АTNFa -238G/A, -308G/ATLR4*299G/A, *399С/Т в группе больных не имели статистически достоверных различий с группой доноров (табл.8). Остановимся более подробно на результатах, полученных по каждому изученному полиморфизму. 1Ь-Ша (?14X1*).

Нами было установлено, что группа ожоговых больных с сепсисом характеризовалась повышенной частотой генотипа 2г/2г и редкого генотипа 4г/5г. Кроме того, среди больных наблюдалась пониженная частота генотипа 4г/2г по сравнению с группой контроля (рис.8).

Однако стоит отметить, что при сравнении частот аллелей гена 1Ь-1Яа не было обнаружено статистически значимых различий с группой контроля (лишь повышенная частота редкого аллеля 5 г на уровне тенденции в группе больных). Это может свидетельствовать о том, что аллели 1Ь-1Яа способны оказывать влияние на развитие заболевания лишь находясь в составе определенного генотипа. Просто же наличие аллеля без учета генотипа, в который он входит, не может говорить в пользу предрасположенности/устойчивости к развитию сепсиса.

Полученные нами результаты согласуются с данными некоторых зарубежных исследователей. А именно, Х.М. Fang показал повышенную частоту аллеля 2Я у пациентов с тяжелым сепсисом по сравнению с контролем. В работе Р. Ма так же был установлен вклад аллеля 211 в развитие сепсиса в китайской популяции. Более того, в исследовании АгпаНсЬ Р. показано, что гомозиготы 211/211 имеют повышенный риск летального исхода тяжелого сепсиса [45, 63, 93].

Очевидно, что вклад тех или иных генотипов в развитие заболевания обусловлен их влиянием на выработку самого цитокина. Согласно литературным данным разные аллели гена 1Ь-1Яа по-разному влияют на выработку конечного продукта — причем не только цитокина 1Ь-1Яа, но и 1Ь-1а, 1Ь-1р. Так, детальное изучение взаимодействий аллельных вариантов внутри семейства 1Ь-1 показало, что аллель 2Я 1Ь-1Яа способен повышать продукцию 1Ь-1|3. При этом, влияние аллеля 2К сильнее на экспрессию IL-1(3, чем на продукцию самого IL-IRa [119]. В работе Danis V. A. et al. показана связь между носительством аллеля 2R, повышением продукции самого IL-IRa и снижением продукции IL-la, стимулированными моноцитами [60].

Однако более поздние исследования, проведенные с соавторами, указывают на различные механизмы генетической регуляции продукции для IL-IRa и для IL-ip, поскольку ими не было обнаружено ассоциации аллелей гена IL-IRa с продукцией IL-ip мононуклеарами периферической крови.

Существуют доказательства, полученные in vitro, что носительство самого по себе аллеля 2R не оказывает влияния на транскрипцию и стабильность мРНК IL-IRa [57]. Тем не менее, не исключено, что генотип 2R/2R, не влияя на продукцию IL-IRa, не находится в неравновесном сцеплении с другими вариантами ДНК внутри структурной части IL-IRa, регулирующей транскрипцию и непосредственно влияющую на выработку IL-IRa клетками.

Если принимать во внимание положение, высказанное М. Hurme et al о скоординированной и совместной регуляции уровня IL-IRa в плазме крови генами IL-IRa и IL-1B, а так же предположение Симбирцева, то можно сделать вывод, что гомозиготы 2R/2R приводят к сдвигу в системе IL-1/IL-IRa в сторону повышенной выработки IL-1.

То есть в нашем исследовании гомозиготы 2R/2R, вероятней всего, обусловливают повышенные уровни провоспалительного цитокина IL-1 у ожоговых больных, и ассоциированы у них с возникновением сепсиса.

Кроме того, необходимо отметить, что в нашем исследовании достоверно чаще среди пациентов с ожогами встречался генотип 4г/5г, при сравнении их с контролем. Согласно литературным данным аллели Зг, 5 г и 6 г встречаются в популяции крайне редко, поэтому для них не выявлено диагностической значимости в развитии заболеваний (за исключением ассоциации с невынашиваемостью беременности). Тем не менее, в нашем исследовании генотип с редким аллелем 5 г показал достоверно значимый вклад в развитие сепсиса у ожоговых больных.

TLR2*753G/A.

Исследований посвященных ассоциации полиморфизма TLR2*753G/A не так много, однако, в нашей работе показана связь аллеля с заменой, А и генотипа G/A TLR2*G753 А с развитием сепсиса у ожоговых больных (рис.9). Результаты работ, посвященных ассоциации данного полиморфизма с возникновением сепсиса, довольно противоречивы. Так Е. Lorenz с соавт. в своем исследовании делает вывод, что TLR2 G753A полиморфизм может повышать риск развития тяжелого сепсиса, вызванного Грам+ микроорганизмами [91]. В тоже время, в более поздних работах, проведенных С. Е. Moore с соавт. изучалась роль полиморфизма G753A и GT микросателлитов в гене TLR2 при тяжелых инфекциях, вызванных Staphylococcus aureus. В результате исследователями не было обнаружено ассоциации данных полиморфизмов с заболеванием или его исходом [100].

Тем не менее в нашей работе среди ожоговых больных были обнаружены повышенные частоты аллея, А и генотипа G/A, как генетические маркеры предрасположенности к развитию такого осложнения как сепсис у обожженных. Считается, что аллель с заменой негативно влияет на проведение сигнала в клетку при активации рецептора посредством PAMPs.

То есть в организме при наличии мутантного аллеля может наблюдаться пониженное содержание медиаторов воспаления, что увеличивает риск развития инфекции. Особенно учитывая тот факт, что в последнее десятилетие основной причиной развития сепсиса в отделениях интенсивной терапии стали Грам+ микроорганизмы, которые несут в себе основные лиганды для распознавания TLR2. IL-l? +3953С/Т.

Частоты аллелей и генотипов, образованные полиморфным сайтом IL.

1(3 +3953С/Т не отличались между выборками здоровых и больных. Наши результаты согласуются с данными, полученными при исследовании китайской популяции, где так же не было обнаружено разницы в частотах встречаемости данного полиморфизма в группах септических больных и контроля.

ТОТа -238С/А, -308С/А.

Немногочисленные работы показывают противоречивые результаты относительно связи полиморфизма в точке С-238А с возникновением или течением сепсиса. В некоторых из них не обнаружено ассоциации с возникновением сепсиса и его исходом [130]. Наше исследование показало похожие результаты — отсутствие различий в частотах встречаемости в группе ожоговых пациентов по сравнению с контролем.

В своей работе мы не обнаружили каких-либо значимых различий в частотах аллелей и генотипов полиморфизма 0−308А среди ожоговых больных и здоровых. Такие результаты соотносятся с литературными данными, где так же не было обнаружено ассоциации данного полиморфизма с развитием тяжелого сепсиса и различным его исходом [133]. Т1Л*4*299С/А, *399С/Т.

Считается, что данные полиморфные сайты способны оказывать влияние на связывание ЛПС ТЬЯ, снижая отвечаемость клеток на Грам-бактерии.

Так же были описаны случаи отсутствия у человека нормальной чувствительности к ЛПС, проявляющегося снижением ЛПС-зависимой продукции лейкоцитами 1Ь-1 В, при наличии аминокислотной замены в последовательности ТЫ1−4 АБр29 901у. Однако, в некоторых исследованиях показаны результаты, говорящие об отсутствии каких-либо изменений в проведении ЛПС-индуцированного сигнала, жизненных показателей и уровне некоторых цитокинов у гетерозигот по Азр299С1у, были показаны еще в нескольких исследованиях [96].

Результаты некоторых исследований показывают, что аллели с заменами двух данных полиморфизмов ассоциированы с повышенным риском развития сепсиса, другие наоборот опровергают это. Так, в исследовании Agnese D. показано, что частота встречаемости полиморфизма оказалась значительно выше у больных грамотрицательным сепсисом, завершившимся септическим шоком, по сравнению с общей популяцией. Мутантный вариант гена встречался у 13% добровольцев и у 18% больных сепсисом, но при наличии грамотрицательной микрофлоры частота его обнаружения достигала 79% [39]. Аналогичные результаты можно встретить в исследованиях Е. Lorenz [91].

Однако в противовес этим данным можно поставить работы, где не было обнаружено ассоциации полиморфизмов Asp299Gly и Thr399Ile с предрасположенностью к инфекциям, либо была выявлена лишь статистическая тенденция к ассоциации [40, 80, 114]. А так же работы, где было показано отсутствие влияния данных полиморфизмов на цитокиновый ответ, тяжесть течения и исход сепсиса [66, 77].

Исходя из анализа литературы, исследования разных клинических групп и состояний показывают различные результаты. Нами изучалась группа пациентов с ожоговой травмой. Возможно, именно с этим связано то, что в нашей работе не было обнаружено ассоциации данных полиморфизмов с развитием сепсиса у обожженных, как и в работах [40, 80, 97, 114]. IL-10 -1082G/A, -819С/Т, -592С/А.

Нами не было получено данных о достоверных различиях в частотах встречаемости полиморфизмов IL-10 -1082G/A, -819С/Т, -592С/А в группах ожоговых больных и контроля. В доступной нам литературе встречаются довольно противоречивые данные о вкладе данных полиморфизмов в предрасположеность к инфекциям и сепсису. Так, P.R. Lowe с соавторами было обнаружено повышение уровня IL-1Q после стимуляции ЛПС у индивидов с генотипом -592 С/С, по сравнению с А/С и А/А. Более того, А аллель был ассоциирован со сниженной продукцией IL-10 и повышенной смертностью пациентов с сепсисом. Однако в данном исследовании не было обнаружено связи полиморфизма -1082 с выработкой IL-10, предрасположенностью к сепсису или повышенной смертностью [92].

В работе Q. Shu исследовалась ассоциация трех данных промоторных полиморфизмов с тяжестью сепсиса и выживаемостью. В результате было обнаружено повышение частоты аллеля G (без замены) -1082 у пациентов с сепсисом, по сравнению с контролем. Однако не наблюдалось никаких различий в распределении частот аллелей и генотипов -1082 между выжившими и умершими пациентами. Кроме того, достоверных различий в частотах полиморфизмов -592 и -819 у больных с тяжелым сепсисом по сравнению со здоровыми обнаружено не было, как и различий между умершими и выжившими [128].

Особого внимания заслуживает работа О. McDaniel с соавторами, где речь идет о пациентах с тяжелой травмой и ассоциации полиморфизмов генов цитокинов (в том числе IL-10 -592, -819, -1082) и их экспрессии с развитием септических состояний. У пациентов с гаплотипом IL-10 АСС/АТА (низкая продукция цитокина) риск развития сепсиса был в 3 раза меньше. В тоже время генотип IL-10 GCC с высокой продукцией цитокина был ассоциирован с сепсисом. Результаты О. McDaniel согласуются с данными Q. Shu, полученными на китайской популяции [94].

Учитывая спорные данные о влиянии этих SNP на экспрессию белка IL-10 и различия в связи с предрасположенностью, и клиническими вариантами сепсиса, описанными в литературных источниках, можно предположить, что при ожоговой болезни полиморфные сайты -1082G/A, -819С/Т, -592С/А не ассоциированы с развитием сепсиса. Однако, переходя к следующей задаче нашего исследования, стоит заметить, что именно полиморфизм IL-10 показал вклад в развитие осложнений септического процесса у обожженных.

3. Третьей задачей нашего исследования было изучить частоты встречаемости аллелей и генотипов генов IL-lRa, IL-l?, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4 при различных клинических вариантах и исходах септического процесса у ожоговых больных. Поскольку у ожоговых больных на 20−30 сутки ожога развивался сепсис, все пациенты были поделены на группы согласно особенностям дальнейшего течения сепсиса и его исхода.

Между пациентами с благоприятным и летальным исходом не было обнаружено достоверной разницы в частотах встречаемости аллелей, генов и гаплотипов исследуемых генов. Наши данные соотносимы с результатами, полученными в исследовании Shu Q, где также не наблюдалось достоверных различий в частотах данных полиморфизмов между выжившими и умершими пациентами с тяжелым сепсисом [128].

При сравнении частот встречаемости полиморфизмов изучаемых генов среди пациентов с разным течением ожогового сепсиса были установлены различия в распределении генотипов в точке С-819Т и гаплотипов гена IL-10 -1082/-819/-592. А именно, в группе ожоговых больных, перешедших в последствии в стадию тяжелого сепсиса обнаружены повышенные частоты гетерозиготного генотипа С/Т и гаплотипа GTA (рис. 10, 11).

Если обратить свое внимание на данные литературы касательно этого вопроса, то довольно интересной является работа, дающая оценку уровней транскрипции гена в зависимости от полиморфизмов. Так, в исследовании Suzanna Е. L. Temple с соавторами проводили стимуляцию мононуклеаров ЛПС и Streptococcus pneumoniae, у индивидов с гаплотипами ATA, GCC и АСС. После чего измеряли уровень мРНК и делали сравнение между индивидами с разными гаплотипами.

При стимуляции Streptococcus pneumoniae мононуклеары с гаплотипом АТА имели повышенные уровни мРНК IL-10 по сравнению с мононуклеарами, несущими гаплотипы GCC (Р=0.024) через 4 часа, и АСС через 4 (Р0.0001) и 8 часов (Р=0.007) после стимуляции. Похожая картина наблюдалась при стимуляции мононкулеаров ЛПС, однако различия не имели достоверной значимости. После стимуляции S. pneumoniae гаплотипы IL-10−819 Т/Т или IL-10−592А/А показывали более высокий уровень мРНК гена IL-10 по сравнению с гаплотипами IL-10−819 С/С или IL-10−592 С/С. Достоверных ассоциаций при стимуляции ЛПС не наблюдалось. Полиморфизм IL-10−1082 не оказывал эффекта на уровни мРНК IL-10. Авторы указывают на то, что такие ассоциации можно объяснить наличием SNP в позициях -819 и -592, которые находятся в неравновесном сцеплении и лежат внутри положительной и отрицательной регуляторных областей соответственно. Влияя на связывание транскрипционного фактора, аллели -819Т и -592А способны усиливать стимулированную транскрипционную активность. Однако это не было доказано экспериментально и потому допускается влияние других локусов на уровни экспрессии конечного продукта [140].

Учитывая эти литературные данные мы можем предположить, что аллельный полиморфизм гена IL-10 в точке С-819Т может оказывать влияние на тяжесть течения сепсиса у ожоговых больных. А именно, гетерозиготный генотип -819С/Т возможно предрасполагает к последующему развитию тяжелого сепсиса. Исходя из результатов S. Temple аллель с заменой -819Т способен усиливать стимулированную транскрипционную активность гена IL-10, обладающего противовоспалительным эффектом. То есть гетерозиготы являются высокопродуцирующими вариантами полиморфизма по сравнению с гомозиготами без замены аллеля. Возможно, именно с этим связано преобладание у больных с тяжелым сепсисом в нашем исследовании гетерозиготных генотипов, которые способны обуславливать развитие осложнений (в частности, таких как иммуносупрессия) при системном воспалении за счет повышенной выработки IL-10. Таким образом, гетерозиготность в точке -819 является маркером развития тяжелого сепсиса у ожоговых больных.

Вклад гаплотипа GTA в развитие такого осложнения как тяжелый сепсис (сепсис с ПОН) может объясняться тем, что в него входит аллель -819Т, который, по всей видимости, ассоциирован с тяжелым сепсисом как сам по себе, так и в составе гаплотипа.

Полиморфизмы (аллели, генотипы и гаплотипы) остальных исследуемых генов IL-lp +3953С/ТIL-IRa (VNTR) — TNFa -238G/A, -308G/ATLR4*299G/A, *399C/T и TLR2*753G/A не показали статистической значимости при сравнении больных с различным течением ожогового сепсиса. Возможно, это связано с небольшим объемом выборки больных, которые имели сепсис с ПОН в нашем исследовании. Вероятно, изучение вклада данных полиморфизмов на большем количестве исследуемых больных может открыть новые ассоциации генов с развитием тяжелого сепсиса и его исхода.

3. Четвертой задачей нашего исследования было определить особенности экспрессии генов рецепторов адаптивного (HLA-DRA, -DMA, СИТА), врожденного иммунитета (TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2) и генов цитокинов IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 среди ожоговых больных по сравнению со здоровыми лицами.

Как известно, ожоговая травма представляет собой большой стресс для организма и должна приводить к изменениям со стороны иммунной системы. И действительно, результаты нашей работы указывают на изменение экспрессии практически всех исследуемых генов в группе ожоговых больных по сравнению с группой контроля.

В результате нашей работы были установлены следующие закономерности экспрессии мРНК в группе больных по сравнению с контролем:

1. Повышена экспрессия генов IL-1, IL-10, TLR2 и TLR4. Кроме того среди больных так же наблюдается повышенная экспрессия генов IFN однако данные не имеют статистической значимости;

2. Снижена экспрессия генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, IFNy, IL-6 и TREM-1. Высокие уровни экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета TLR2 и TLR4 могут быть обусловлены наличием большого количества молекул эндогенного происхождения, которые появляются в результате получения ожоговой травмы. Так, известно, что такие эндогенные молекулы как белки теплового шока (HSP60, HSP70, GP96), компоненты свертывающей системы (фибронектин А, фибриноген) и олигосахариды гиалуроновой кислоты могут приводить к активации врожденного иммунитета через TLR и индуцировать продукцию провоспалительных цитокинов [44, 103].

Кроме того, есть данные показывающие, что некротические ткани могут индуцировать экспрессию цитокинов макрофагами, поддерживающие идею о том, что поврежденные ткани могут напрямую запускать реакции врожденного иммунитета через TLR.

Таким образом, наши данные еще раз подтверждают тот факт, что ожоговая травма сопровождается развитием системного воспаления за счет активации TLR молекулами повреждения.

В то же время в нашей работе в группе ожоговых больных наблюдались пониженные уровни экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА.

Известно, что HLA-DR молекулы необходимы для антигенной презентации и активации Т-хелперов [111], поэтому играют центральную роль в специфическом иммунном ответе на инфекцию. Некоторые исследования показывают, что экспрессия данных молекул на моноцитах снижается после обширных травм, хирургических вмешательств и трансплантации. Сниженная экспрессия HLA-DR на моноцитах коррелирует с инфекционными осложнениями и развитием сепсиса. Считается, что у больных с тяжелыми травмами пониженный уровень поверхностных и растворимых HLA-DR является ранним индикатором иммунных нарушений и развития тяжелого сепсиса [56, 62, 99].

Молекула HLA-DMA, являющаяся продуктом экспрессии гена локуса DM [127], принимает участие в стабилизации молекул HLA II, в освобождении антигенсвязывающей щели от инвариантной цепи, в корректном транспорте молекул HLA II класса из эндоплазматического ретикулума и стабильном связывании альфа-бета гетеродимеров со специфическими пептидами. Предполагается, что молекулы HLA-DM совместно с молекулами HLA-DO принимают участие в генетической рестрикции при распознавании антигена [101, 108]. В группе ожоговых больных нашего исследования так же наблюдается снижение экспрессии гена HLA-DMA.

Как известно экспрессия генов HLA II класса контролируется в основном на уровне транскрипции [109]. Одной из главных молекул регуляторов транскрипции HLA II является трансактиватор II типа СИТА [116, 146], экспрессия которого также оказалась пониженной в группе ожоговых больных нашего исследования.

Экспрессия генов HLA II класса контролируется высоко консервативным регуляторным модулем, который расположен выше сайта инициации транскрипции 150−300 пар нуклеотидов во всех генах МНС II класса. Регуляторный модуль SXY состоит из боксов S, X, Х2 и Yимеющие строгий порядок, ориентацию и интервалы. Данный модуль обнаружен так же в области промотора генов, кодирующих аи (3-цепи молекул HLA II класса, а также в области промотора генов, кодирующих инвариантную цепь (Ii), HLA-DM, HLA-DO и молекулы HLA I класса.

Связываясь с различными факторами модуль формирует мультипротеиновый комплекс — энхансеосому, который является платформой для присоединения СИТА [89].

Стоит так же отметить, что СИТА, помимо регуляции транскрипции генов НЬА, осуществляет позитивную и негативную модуляцию экспрессии генов с различными функциями, что определяет характер течения таких важных для организма событий как воспаление, врожденный иммунный ответ, адаптивный иммунитет, в частности, обеспечивает: инициацию хемотаксической активности лейкоцитов и моноцитов, стимуляцию продукции миелопероксидазы, Т№а, тканевого фактора, 1Ь-8 — подобного фактораактивацию клональной экспансии, созревания и дифференцировки Ти В-клетокнегативную регуляцию продукции 1Ь-4, экспрессии РАБ-лиганда при сверх активации гена МНС СИТАнегативную регуляцию генов, не относящихся к системе главного комплекса гистосовместимости.

Таким образом, пониженная экспрессия генов НЬА-БК иОМ скорее всего обусловлена низкой экспрессией трансактиватора СИТА, регулирующего их транскрипцию. По всей видимости, при травме снижение количества поверхностных молекул НЬА происходит не только за счет их откалывания с поверхности клетки, как полагалось ранее, но и по причине снижения транскрипции генов, кодирующих как сами молекулы НЬА, так и регуляторы их транскрипции.

То есть, исходя из полученных нами данных о повышении экспрессии генов ТЫ1 и снижении экспрессии генов НЬА у ожоговых больных, можно сделать вывод, что наблюдается одновременное вовлечение основных звеньев иммунитета в ответ на травму. Это положение также подтверждается особенностями экспрессии генов цитокинов. У ожоговых больных наблюдается одновременное изменение в экспрессии как протак и противовоспалительных цитокинов.

Если обратиться к данным литературы, то и там можно встретить похожие результаты. В своем исследовании В.А. Cairns и С.М. Barnes продемонстрировали, что комплекс и динамика цитокинового профиля после ожога в результате активации TLR не имеет четкой проили противовоспалительной направленности и ассоциированы с уникальными изменениями в популяции макрофагов [54].

Исходя из всего вышесказанного, мы посчитали, что самым логичным объяснением нашим результатам может служить феномен «геномного шторма». Данный феномен характеризует ответ организма на любой стресс, будь то травма, инфекция или ожог, и проявляется в одновременном изменении экспрессии генов врожденного и адаптивного иммунитета, прои противовоспалительной направленности.

Большой интерес представляют результаты, полученные относительно экспрессии гена TREM-1. Как известно, TREM-1 (триггерный рецептор, экспрессируемый на миелоидных клетках) — мономерный трансмембранно-активируемый рецептор, который экспрессируется нейтрофилами, моноцитами и различными субпопуляциями макрофагов [72, 106, 112,121]. Во время инфекций, вызванных Грам+ и Грамбактериями и грибами, экспрессия мембранно-связанного TREM-1 значительно возрастает [125]. Растворимая форма TREM-1 также высвобождается из клеток и может быть количественно определена в биологических жидкостях. TREM-1 является важным регулятором в системе врожденного иммунитета, осуществляя усиление воспаления в ответ на инфекцию [65, 67, 69]. В то же время, существуют данные, указывающие, что TREM-1 не является специфическим маркером инфекционного процесса [64]. Естественный лиганд TREM-1 не известен. Однако, активация TREM-1 на моноцитах агонистом антител в присутствии лиганда То11-подобного рецептора (TLR) синергистически усиливает продукцию провоспалительных хемокинов и цитокинов, а также снижает продукцию противовоспалительного IL-10.

В нашем исследовании группа больных характеризовалась пониженными уровнями экспрессии гена TREM-1. Возможно, это связано с тем, что мы оценивали экспрессию данного гена в мононуклеарах. Скорее всего, более показательными в отношении экспрессии гена TREM-1 при ожоговой травме являются нейтрофилы (неопубликованные данные).

5. Пятой задачей нашего исследования было изучить различия в экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-ip, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 на различных клинических стадиях с учетом исхода у ожоговых больных. Для решения этой задачи в нашей работе все ожоговые пациенты были разделены на группы по времени взятия образцов (с момента ожога), дальнейшему течению заболевания и его исходу:

I группа — 3−6 сутки ожога: 1. ССВО-выжили.

2. сепсисвыжили.

3. сепсис с ПОН — выжили.

4. сепсис с ПОН — летальный.

II группа — 10−17 сутки ожога: 5. сепсис — выжили.

6. сепсис с ПОН — выжили.

7. сепсис с ПОН — летальный.

Две основные группы (I и II группы), то есть ожоговые больные на разные сутки ожога различались между собой по уровням экспрессии генов TLR2 и TLR4. А именно, ожоговые больные на 3−6 сутки ожога экспрессировали более высокие уровни TLR2 и TLR4 по сравнению с больными на 10−17 сутки. Вероятней всего, такие особенности экспрессии генов TLR в первые дни после ожога обусловлены активацией врожденного иммунитета в ответ на травму. Такая активация, как отмечалось ранее, может происходить не только при попадании инфекционного агента, но и при появлении в организме большого количества эндогенных молекул повреждения тканей. Затем в более поздние сроки после травмы происходит снижение уровней экспрессии генов TLR. В литературе так же существуют данные, указывающие на повышение экспрессии TLR2 и TLR4 в ранние сроки после ожога, и затем на снижение их экспрессии в более поздние сроки (после 14 суток), предполагая, что это происходит под воздействием цитокинов Th2, в частности IL-10 [54].

Далее в нашей работе мы сравнивали группы ожоговых больных с учетом клинического течения и исхода сепсиса.

Наибольший интерес представляют результаты, полученные в группе больных с ПОН и летальным исходом.

Уровни экспрессии генов у ожоговых больных на 3−6 сутки имели следующие особенности — группа больных с ПОН и летальным исходом (группа 4) показала пониженные уровни экспрессии гена IL-1 и повышенные уровни TLR2. А группа выздоровевших после ССВО (группа 1) показала пониженные уровни TREM-2 (рис.19) по сравнению с теми, у кого в дальнейшем развился сепсис.

TREM-2 — также является триггерным рецептором на миелоидных клетках [55, 125], однако в отличие от TREM-1, оказывает позитивную регуляцию апоптоза и негативную регуляцию воспалительного процесса. В доступной нам литературе нет данных об экспрессии гена TREM-2 при ожоговой травме. Можно предположить, что в ранние сроки после травмы системное воспаление у ожоговых пациентов еще не было обусловлено наличием инфекции, поэтому экспрессия гена TREM-2 была снижена.

Группа пациентов с летальным исходом (на 10−17 сутки) показала низкую экспрессию генов HLA-DRA, -DMA, IFNy, и повышенную экспрессию генов TNFa, TLR2, TLR4, TREM-2 по сравнению с выжившими. Из полученных нами данных видно, что на 10−17 сутки в группе с летальным исходом увеличивается число показателей, которые имеют значимые различия. Становится видно, что особенностью пациентов с летальным исходом является снижение уровней экспрессии генов адаптивного иммунитета и повышение экспрессии генов иммунного ответа с преобладанием врожденного. Наши результаты соотносятся с концепцией «геномного шторма», которая указывает на одновременные изменения как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете при травме. Причем эти изменения имеют ту же направленность, что и в нашем исследовании — гены, экспрессия которых увеличивается, отвечают в основном за врожденный иммунитет, микробное распознавание и воспалениегены, экспрессия которых снижается, отвечают за Т-клеточную функцию и презентацию антигена.

Исходя из вышесказанного, для прогноза клинического течения и исхода сепсиса у обожженных можно использовать оценку уровней экспрессии в динамике, при этом понижение экспрессии генов HLA и повышение экспрессии генов TLR может говорить о высокой вероятности развития ПОН и летального исхода у обожженных.

6. Шестой задачей нашего исследования было оценить возможную связь особенностей экспрессии генов HLA-DRA, -DMA, СИТА, цитокинов IL-1|3, TNFa, IFNy, IL-6, IL-10 и рецепторов TLR2, TLR4, TREM-1, TREM-2 с наличием полиморфизмов генов IL-IRa, IL-lp, TNFa, IL-10, TLR2 и TLR4. В результате мы не обнаружили достоверных различий в уровнях экспрессии генов в зависимости от их полиморфизма. В доступной нам литературе не встречалось подобных исследований. В основном представлены работы, где изучалась и была установлена связь полиморфизмов генов с выработкой конечного продукта. Мы не изучали концентрации конечных продуктов исследуемых нами генов в зависимости от их полиморфизма. Возможно, связь продукции цитокинов с полиморфизмом генов существует, однако изучая уровни экспрессии не стоит забывать о посттранскрипционных и посттрансляционных модификациях, которые, безусловно, оказывают влияние на выработку конечного продукта. Возможно, именно с посттранскрипционными модификациями может быть связаны расхождения полученных нами данных об отсутствии зависимости экспрессии от полиморфизмов и данных о связи полиморфизмов с продукцией конечного белка.

Таким образом, в настоящее время пришло понимание того, что сепсис является комплексным, динамичным синдромом с высокой степенью гетерогенности, но не отдельным заболеванием. Сепсис это результат, складывающийся из различных причин, и чувствительность к нему может определяться преморбидными факторами, включая этническую принадлежность, пол, возраст, генетические особенности организма и факторы окружающей среды. Особое место занимают генетические и эпигенетические изменения, такие как мутации в генах, кодирующих паттерн-распознающие рецепторы или медиаторы воспаления и их рецепторы, способные модифицировать иммунный ответ организма. Поскольку подлежащий иммунный ответ в ходе сепсиса носит индивидуальный характер и варьирует между пациентами, то, возможно, в терапии таких состояний было бы эффективно использовать различные подходы. Наиболее правильным кажется то, что пациенты, при оценке полиморфизмов генов и уровней их экспрессии, могли бы подвергаться точному мониторированию для обнаружения изменений в характерных маркерах иммунного ответа, для того чтобы делать прогноз и правильный выбор специфической иммуномодулирующей терапии.