Определение активности аминотрансфераз (трансаминаз)

При участии аминотрансфераз (КФ 2.6.1) в организме человека осуществляются процессы переаминирования (обратимого переноса аминогрупп аминокислот на кетокислоты). Наибольшее значение имеет исследование активности аспартатаминотрансферазы (L-аспартат: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.1) и аланинамино-трансферазы (L-аланин: 2-оксоглутарат-аминотрансферазы; КФ 2.6.1.2). Эти ферменты обладают большой каталитической активностью и широко распространены в различных органах и тканях — печени, мышце сердца, скелетной мускулатуре, почках и других.

Аспартатаминотрансфераза (АсТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Щавелевоуксусная > Аспарагиновая + б-кетоглутаровая кислота кислота < кислота.

Аланипаминотрансфераза (АлТ) катализирует реакцию:

Глютаминовая + Пировиноградная >б-аланин + б-кетоглутаровая кислота кислота кислота <

Существующие методы определения активности указанных аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы: колориметрические и спектрофотометрические.

В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга. Эти методы являются наиболее специфичными и точными для исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Однако применение труднодоступных и дорогостоящих реактивов, а также необходимость измерения результатов на спектрофотометре не дают возможности широкого использования этих методов в клинических лабораториях.

Группа колориметрических методов основана на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования. Интенсивность окраски пропорциональна активности фермента.

Пировиноградная кислота+Динитрофенилгидразин = Динитрофеннлгидразон пировиноградной кислоты.

Динитрофепилгидразоновые методы впервые предложили в 1950 г. Тангази, Уайт, Умбрайт. У нас в стране они получили известность в модификации Т. С. Пасхиной.

В последние годы появился облегченный и упрощенный метод Райтмаиа и Френкеля, основанный па том же принципе, что и способ в модификации Т. С. Пасхиной, но имеющий перед ним ряд преимуществ. Они состоят в исключении из хода определения активности ферментов: 1) перевода щавелевоуксусной кислоты в пировиноградную с применением анилина, 2) экстракции 2,4-ДНФ-гидразона пирувата толуолом. Метод Райтмана и Френкеля нашел широкое применение за рубежом. Будучи технически простым, он вместе с тем выявляет изменения активности фермента при различных заболеваниях и дает воспроизводимые результаты.

Азометоды основаны на образовании цветного соединения между щавелевоуксусной кислотой и 6-бензамидо-4-метокситолуидиндиазо-ниевым хлоридом. Колориметрические методы этой группы просты и при наличии соответствующих все еще дефицитных реактивов могут быть использованы для быстрого ориентировочного определения активности аспартатаминотрансферазы [5].

Колориметрический динитрофенилгидразиновый метод исследования активности аминотрансфераз в сыворотке крови (по Райтману, Френкелю, 1957)

Принцип. В результате переаминирования, происходящего под действием АсТ и АлТ, образуются Щавелевоуксусная и пировиноградная кислота. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина энзиматический процесс останавливается и получается гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты [5].