Функции литостатина. 
Основные теории патогенеза хронического панкреатита

Ингибирование образования кальциевых камней. J. P. Bernard и соавт. [62] предположили, что ингибирующая функция литостатина реализуется N-терминальным андекапептидом. Однако концентрация, в которой проявляет свою активность N-терминальный пептид или его синтетический.

аналог, до сих пор не выяснена. J. P. Bernard и соавт. [62] наблюдали ингибирующий эффект различных концентраций как естественных, так и синтетических пептидов (1,2—5,9 и 3,0—9,0 мкмоль/л соответственно), ингибирующему действию литостатина S2−5 проявляет такую же активность (0,6—5,9 мкмоль/л). В то же время D. Bimmler и соавт. [67] наблюдали отсутствие какого-либо эффекта синтетического пептида даже при концентрации 243 мкмоль/л (тест на нуклеацию) или 81 мкмоль/л (тест на кристаллический рост). В другом исследовании [90] синтетический пептид был активен только при концентрации более 80 мкмоль/л. По данным S. Geider и соавт. [114], концентрация пептида должна была достигать 500 мкмоль/л, чтобы вызвать предотвращение кристаллообразования.

Противоречивость полученных данных вызвала оживленную дискуссию исследователей. D. Bimmler и соавт. [67] заявили, что различие между собственными данными и результатами J. P. Bernard и соавт. [62] может быть связано с дефектами дизайна исследования. Согласно мнению S. Geider и соавт. [114], размер андекапептида намного меньше, чем литостатина S2−5. Следовательно, для достижения активной концентрации и реализации его ингибирующего эффекта требуется большее количество молекул андекапептида (приблизительно в 100 раз больше), чем литостатина S2−5.

Было высказано мнение, что известный ингибирующий эффект литостатина был фактически реализован из-за присутствия высокой концентрации буфера Триса [90]. Действительно, в исследованиях М. de Reggi и соавт. буфер Триса при концентрации 1 ммоль/л полностью ингибировал формирование кристаллов из ионов Са²⁺. Поэтому ингибирование кристаллообразования кальция литостатином могло быть «побочным эффектом» типовой подготовки эксперимента. В дальнейшем было подтверждено, что низкие концентрации буфера Триса действительно ингибируют нуклеацию кальция и кристаллический рост, в соответствии с ингибирующими кривыми, первоначально приписанными литостатину [190].

По данным D. Bimmler и соавт. [67], рекомбинантный литостатин крысы обладал ингибирующей активностью в отношении осаждения кристаллов кальция. Однако при тех же самых условиях бычий трипсиноген и человеческий сывороточный альбумин также вызывал ингибирование выпадения кристаллов кальция, сопоставимое с таковым у литостатина. Кроме того, было показано, что NaCl, фосфаты и, в некоторой степени, трипсиноген и химотрипсиноген ингибируют рост кристаллов кальция [90]. L. Addadi и S. Weiner [54] также сообщили о существовании неспецифической функции ингибирования выпадения кристаллов кальция различными белками при концентрациях выше 0,5 мг/мл, как это было показано для литостатина.

Еще более интересным является эффект, выявленный S. Geider и соавт. [114], когда литостатин S2−5, напротив, потенцировал нуклеацию кристаллов кальция. По данным авторов, литостатин способствовал образованию множества микрокристаллов, не имеющих патологического значения, которые легко вымываилсь из протоковой системы ПЖ током панкреатического секрета.

Таким образом, биологические функции, первоначально приписанные литостатину, в настоящее время весьма дискутабельны.

В настоящее время существует несколько гипотез механизмов действия литостатина.

Гипотеза I. Литостатин связывает кальций. В экспериментах, выполненных с помощью литостатина, меченного радиоактивным ⁴⁵Са, было определено, что литостатин С имеет четыре эквивалентных и независимых кальцийсвязывающих участка. J. Lohse и R. Kraemer предположили, что связывание литостатина с кальцием, вероятно, изменяет физико-химические характеристики этого белка, ведя к формированию белковых пробок, предшествующих кальцификации, и объясняет присутствие протеинов во всех слоях панкреатических камней [162].

В то же время отсутствие кальция в центре некоторых панкреатических камней, отмеченное в исследованиях L. Multigner и соавт. [178] и С.S. Pitchumoni и соавт. [196], противоречит мнению о предположительном участии кальция в инициации камнеобразования. A. Mariani и соавт. [166] также определили, что полипептидные ядра рентгеннегативных камней не имеют в своей основе кальциевого ядра. Кроме того, L. Multigner и соавт. [177] указали, что препятствие выпадению кристаллов кальция литостати-ном С нельзя было бы объяснять исключительно фиксацией кальция к белку. Действительно, при концентрации литостатина С, которая полностью ингибирует кальцификацию, более 98% ионов кальция остаются свободными [172, 177].

Возобновление интереса к механизму фиксации кальция к литостатину было обусловлено открытием у животных лектинов (фитогемагглютининов), гомологичных литостатину С (лектины — белки, функционирование которых зависит от кальция) [191, 192], а также описанием способности литостатинов HI и S2−5 потенцировать образование кальций-бактериальных комплексов [144].

Помимо литостатина, к настоящему моменту известно девять белков семейства лектинов С-типа. Семь из этих белков имеют кальций-зависимую активность: в том числе эпидермальный фактор роста человека [122], человеческий тетранектин [148], человеческий сурфактант легких [129].

В заключение следует отметить, что анализ структуры литостатина не позволяет нам идентифицировать кальций-связывающие участки, которые можно считать ингибирующими осаждение кальция и кристаллический рост конкремента.

Гипотеза II. Адсорбция литостатина на кристаллах карбоната кальция (адсорбционная гипотеза). Теоретическая возможность адсорбции литостатина на кристаллах карбоната кальция была предложена в качестве механизма ингибирования камнеобразования. L. Multigner и соавт. [177] описали механизм камнеобразования, при котором данный белок мог иметь большее сродство к кристаллу, чем к свободным ионам кальция. Точно так же А. Саго и соавт. [88] на основе проведенных исследований заключили, что сродство литостатина выражено больше к кристаллам, чем к свободным ионам кальция. В дальнейшем была продемонстрирована возможность адсорбции литостатина S2−5 на поверхности предсформированного кристалла [62].

Н. Sarles и соавт. подтвердили возможность адсорбции N-терминального андекапептида к кристаллической поверхности. По мнению авторов, снижение уровня N-терминального андекапептида в панкреатическом соке пациентов в результате его разрушения и преципитации является одной из причин развития кальцифицирующего ХП [213].

Теоретические предпосылки возможности адсорбции литостатина и N-терминального пептида к кристаллм СаСО₃ вскоре стали предметом многих исследований.

Так, S. Geider и соавт., используя иммунофлюоресцентные методы [114], определили, что литостатин действительно адсорбируется на гранях кристалла относительно оси роста. Однако важно подчеркнуть, что эти эксперименты были выполнены в условиях индуцированного кристаллического роста. Поэтому результаты данного исследования не доказывают, что адсорбция литостатина на кристаллах — это механизм ингибирования кристаллического роста in vivo, а только показывают возможность модификации кристаллической формы в присутствии этого белка.

Кроме того, было определено, что сродство литостатина к кристаллам карбоната кальция является даже более низким, чем у альбумина, а количество адсорбируемого литостатина и альбумина на единицу поверхности находятся примерно в одинаковом диапазоне [90]. Наконец, было доказано, что адсорбция литостатина на кристаллах карбоната кальция не намного выше, чем аморфного вещества, например стекла [190]. Эти наблюдения свидетельствуют не в пользу гипотезы адсорбции литостатина на кристаллах карбоната кальция как механизма элиминации кристаллов из протоковой системы ПЖ.

V. Gerbaud и соавт. [116] для изучения взаимодействия между кристаллами карбоната кальция и N-терминальным пептидом использовали молекулярное динамическое моделирование. Эти исследования показывают, что литостатин способен пространственно ориентироваться с кристаллами карбоната кальция и затем адсорбировать их. При этом, в дополнение к взаимодействию кристаллов с N-терминальным пептидом, биполярное распределение заряженных остатков в структуре С-концевого домена [64] может первоначально также играть роль в ориентации белка относительно кристаллической поверхности. Изучение кристаллографической структуры литостатина показало, что в С-терминальном домене кислые аминокислотные остатки расположены с одной и той же стороны молекулы, в двух отрезках, отделенных приблизительно на 6 А. Эта периодичность, аналогичная таковой для ионов кальция на нескольких кристаллические плоскостях, может позволять электростатически взаимодействовать между С-кон-цевым доменом и кристаллом.

Эта модель могла объяснять адсорбцию литостатина на кристалле кальция, но не доказывала функцию ингибирования кристаллизации или специфику адсорбции литостатина на кристалле [190].

В целом, ни одно из вышеупомянутых исследований не было способно четко прояснить функцию или механизм действия литостатина.

Для объективизации приведенной выше информации необходимо упомянуть и другие белки с известным или предполагаемым участием в процессе кристаллизации.

Бакуловирусный экспрессируемый рекомбинантный литостатин крысы также обладает ингибируюшей активностью в отношении осаждения, кристаллизации и роста кристаллов карбоната кальция. Было показано, что, в отличие от человеческого литостатина, только С-терминальный полипептид демонстрировал ингибирующий эффект в отношении нуклеации кристаллов кальция и кристаллического роста. Однако отмеченный эффект был менее выраженным, чем у молекулы литостатина человека. Ни N-терминальный андекапептид, ни его синтетический гомолог не имели подобного эффекта даже при более высоких концентрациях. Следует отметить, что другие белки, например бычий трипсиноген, человеческий сывороточный альбумин имели сопоставимый ингибиторный эффект. В силу этого специфика и физиологическое значение ингибирующей способности литостатина крысы в настоящее время подвергается сомнению [65, 66].

Антифриз-эффекторные белки. Многие из морских рыб, обитающих в полярных океанах и северных морях, защищены от низких температур и даже замораживания в ледяной морской воде так называемыми антифризбелками сыворотки крови, являющимися гликопротеинами. К настоящему времени идентифицировано четыре различных типа антифриз-белков. Предположительно эти макромолекулы связываются с поверхностью кристаллов льда, предотвращая их рост. Этот тип белков характеризуется высокой идентичностью аминокислотной последовательности (от 25 до 29%) по отношению к человеческим литостатинам и гомологичны С-типу лектинов [100]. Исследования К.V. Ewart и соавт. показали, что связывающий лед участок антифриз-белков сельди соответствует кальций-связывающему участку лектинов С-типа [106].

Белки, потенциально управляющие минеральным ростом. Недавно был изолирован и выделен овоклеидин — основной белок кальфицированного слоя яичной скорлупы [165], обладающий 30% идентичной последовательностью с человеческим литостатином и состоящий из отдельного лектино-подбного домена С-типа. Функция овоклеидина пока еще не установлена, предположительно, он играет роль в формировании матрицы яичной скорлупы.

Перлюцин — белок, выделенный из раковины моллюска Haliotis laevigata [243]; по своей аминокислотной последовательности он также принадлежит к группе лектинов, состоящих из единственного домена С-типа. Кальций-связывающий участок 2 полностью гомологичен таковому у литостатина, в то время как кальций-связывающие участки 1 и 3 имеют только несколько общих аминокислотных остатков. Перлюцин промотирует осаждение СаСО₃, в раковине моллюска, хотя авторы подчеркивают, что это может быть только одним из множества аспектов его функционирования.

Человеческий тетранектин (который содержит кальций-связывающие участки 1 и 2) также принадлежит к семейству лектинов С-типа, осуществляя роль белковой матрицы кости при минерализации [246]. Недавно было высказано мнение, что он играет ключевую роль в росте этих и ремоделировании костной и мышечной тканях [142].

Панкреатит-ассоциированный белок синтезируется и секретируется в ПЖ, по своей аминокислотной последовательности весьма близок литостатину (идентичность —43%, подобие — 54%). Панкреатитассоциированный белок соответствует основным характеристикам лектинов. Функция панкреатит-ассоциированного белка остается неизвестной, хотя сообщается, что секреция литостатина и панкреатит-ассоциированного белка увеличиваются в ответ на повреждение pancreas [190].

В семействе лектинов С-типа только эти два белка (и их гомологи) расщепляются трипсином на участке между аргинином и изолейцином с образованием по существу нерастворимых нитеобразных структур (фибрилл). Это, вероятно, и составляет наиболее важную их общебиологическую особенность.

Недавно было предположено, что именно эти плотные экстрацеллюляр-ные фибриллярные комплексы, сформированные в условиях секреторного напряжения ПЖ, обеспечивают защиту внутриполостного матрикса и осуществление полноценной регенерации протоковых структур [60п].

Существуют данные, что на ранних стадиях болезни Альцгеймера отмечается повышенная секреция как литостатина, так и панкреатит-ассоциированного белка, что также подтверждает предположение о тесной функциональной взаимосвязи этих двух полипептидов [121].

Недавно появилась альтернативная гипотеза камнеобразования, утверждающая, что механизм взаимодействия литостатина с кальцием не имеет принципиального значения, хотя этот белок и играет существенную роль в образовании внутрипротоковых преципитатов [147]. Гипотеза основана на результатах приведенных ниже исследований. Во-первых, стало известно, что при добавлении трипсина к секрету ПЖ отмечается трансформация растворимых изоформ литостатина S2−5 в нерастворимую фибриллярную изоформу S1 [149].

Во-вторых, у больных ХП чистый панкреатический секрет обладает небольшой протеолитиче-ской активностью [57, 115, 201, 234]. В-третьих, было выявлено, что в центре панкреатических камней помимо непременного содержания литостатина часто выявляется трипсин [136]. В связи с этим оправданной выглядит точка зрения, что при внутрипротоковой активации трипсиногена растворимые изоформы литостатина S2−5 могут конвертироваться в нерастворимую форму Sic последующим его осаждением в конкременте [147].

При использовании электронной микроскопии была оценена локализация литостатина в конкрементах (применялась методика иммунного окрашивания с добавлением коллоидного золота; рис. 3.2). Частицы золота, указывающие на наличие литостатина, были равномерно распределены от центра к периферии конкремента [147]. В более ранних работах, было определено, что трипсиноген располагался более плотно в центре конкремента, чем по периферии [136].

Судя по плотности распределения частиц золота, вовлечение трипсиногена на начальном этапе формирования конкремента кажется более интенсивным, чем на последующих этапах. С другой стороны, вовлечение литостатина, вероятно, достаточно постоянно в течение всего периода камнеобразования. В физиологических условиях литостатин, как, впрочем, и другие белки панкреатического сока, возможно, и играет ингибирующую роль в отношении осаждения карбоната кальция. При патологии, когда происходит локальная активация пищеварительных зимогенов [115, 201, 234], литостатин может играть литогенную роль, заключающуюся в преобразовании протеазами растворимых форм белка S2−5 в нерастворимую форму S1. Данная гипотеза представляется более обоснованной, чем предполагаемая ранее ингибирующая роль литостатина в нуклеации и осаждении кристаллов кальция. Однако, в свете представленных данных, остается неясным, какой же все-таки белок является наиболее важным для преципитации и камнеобразования.

В этом разделе мы рассмотрели основные работы по механизму действия литостатина. Результаты этих исследований достаточно противоречивы, однако самые современные данные не подтверждают мнения о значительной роли литостатина в ингибировании роста кристаллов кальция в протоковой системе ПЖ [54, 67, 190]. N-терминальный андекапептид, скорее всего, не обладает функциями цельного белка и не ингибирует кристаллизацию in vivo. Литостатин тропен к адсорбции на кристаллах кальция, хотя эта особенность неспецифична и характерна для других белков, секретируемых ПЖ. Установленный факт, что литостатин может адсорбироваться на кристаллах карбоната кальция и ингибировать их рост, не исключает и другую его биологическую роль.

Приведенные факты подтверждаются данными сравнительной биологии, включая информацию о белках, только недавно идентифицированных. Примечательно, что несколько белков, выделенных с литостатином, также предположительно играют регуляторную роль в процессах кристаллизации. Обширный перечень названий литостатина (литостатин, белок панкреатических камней, панкреатический фибриллярный белок, белок) отражает различные обстоятельства идентификации литостатина, а также меняющиеся предположения о его функции. Кроме того, тот факт, что Regген экспрессируется в разнообразных тканях человека, в том числе в тех, где отсутствует карбонат кальция, предполагает плейотропность этого гена [242].

Все это определенно говорит о том, что дискуссия относительно биологической роли литостатина остается открытой.