Метаболизм оксида азота в тканях

Характеристика оксида азота. Как известно, NO по своим физико-химическим свойствам представляет собой токсический газ, который в клетках организма может находиться в трех переходящих друг в друга формах: в виде нитрозония (NO+), нитроксиланиона (NO^-) и свободного радикала NO*, имеющего неспаренный электрон (N*=0). Все формы оказывают воздействие на внутриклеточные мишени. Однако NO* в виде свободного радикала из-за наличия неспаренного «лишнего» электрона обладает наиболее высокой химической активностью (в три раза большей, чем у кислорода) [15, 34].

Оксид азота способен быстро диффундировать (проникать) через мембрану клетки, легко попадать в другие клетки и ткани, где различными механизмами регулирует многие процессы. Таким образом, он выполняет функцию сигнальной молекулы или тканевого гормона. В свободном состоянии NO — короткоживущая молекула, полупериод жизни которой колеблется от 0,5 до 30 с, после чего она быстро разрушается. При избыточном количестве в клетке он может связываться с белками и пептидами, т. е. депонироваться и сохраняться более длительное время. В таком виде может мигрировать в межклеточное пространство и клетки других органов, где оказывает сигнальное, защитное или повреждающее физиологическое действие. Предполагается, что депонирование NO в связанном с белками виде играет важную роль в формировании устойчивости организма к повреждениям прежде всего свободными радикалами, вызванным как его дефицитом, так и гиперпродукцией [17].

Результат действия NO на биохимические процессы в тканях определяется его концентрацией. При больших количествах он осуществляет в организме защитные функции (в макрофагах убивает опухолевые и бактериальные клетки, обеспечивая цитотоксический и антибактериальный эффект иммунной системы) и повреждающие (запускает патологические процессы, приводящие к апоптозу — гибели клеток) [15].

При снижении уровня NO в тканях снижаются адаптивные возможности организма, наблюдаются патологические изменения метаболизма, приводящие к заболеваниям [12, 15, 18, 40]. Существует мнение, что первичной причиной патогенеза ишемической болезни сердца и атеросклеротического поражения сосудов является дефицит NO в сосудистом эндотелии и миокарде [12, 13]. При старении организма также уменьшаются активность ферментов синтеза NO и уровень тканевого NO, что способствует снижению адаптационных возможностей организма и развитию патологических процессов [19, 43].

Концентрация оксида азота в клетках зависит от скорости процессов его метаболизма в основном от активности и степени экспрессии ферментов синтеза, активности ферментов распада и скорости неферментативного превращения.

Синтез оксида азота в клетках организма человека осуществляется двумя путями: ферментативным и неферментативным [15, 34, 41].

При ферментативном синтезе NO образуется из азота иминогруппы (=NH) аминокислоты L-аргинина или его аналогов и молекулярного кислорода с помощью фермента нитрооксидсинтазы (NO-синтазы, или NOS): КФ 1.14.13.39 [42]. Скорость NOS-зависимого синтеза N0 в клетках зависит от количества и активности ферментов NOS, а также концентрации L-аргинина внутри клеток.

Для проявления активности ферментов NO-синтаз в тканях необходимы многие кофакторы: НАДФ, ФАД, ФМФ, гем, фолиевая кислота и тетрагидробиоптерин [15, 20]. В активном центре фермента находится железопорфириновый комплекс, содержащий аминокислоты цистеин или метионин.

является условно незаменимой аминокислотой, так как в тканях взрослого человека она синтезируется, а в детском организме не синтезируется. Суточная потребность в ней составляет около 5−6 г.

Процесс образования NO из аргинина схематически представлен на рисунке 1, где видно, что аргинин в тканях превращается в аминокислоты орнитин и цитрулин [34].

Эти кислоты играют важную роль в процессе обезвреживания аммиака и образования мочевины в печени.

Внутриклеточная концентрация аминокислоты L-аргинин зависит от поступления ее с пищей, синтеза в организме, активного транспорта внутрь NO-синтезирующих клеток и активности фермента аргиназы, катализирующей расщепление L-аргинина другим путем [34].

В организме происходит синтез аргинина из L-цитрулина (см. рис.1). Молекула L-цитрулина с помощью ферментов арги-нинсукцинатсинтазы превращается в промежуточный продукт — аргининсукцинат, который расщепляется аргининсукцинатлиазой до аргинина и фумарата. Через фумарат осуществляется связь цикла превращения аргинина и образования NO с циклом три-карбоновых кислот.

L-аргинин используется в клетках не только для синтеза NO, но и для синтеза белков, мочевины, креатинина, полиаминов, пролина, глутамата. Он также стимулирует секрецию инсулина и других гормонов, влияет на процесс фибриногенолиза и другие процессы, не связанные с образованием NO [12, 15].

Таким образом, для поддержания постоянного количества NO в тканях необходимы его предшественники, в основном аргинин, ферменты синтеза, многие кофакторы — витамины, железо, аминокислоты, которые должны поступать в организм с пищей.

РИСУНОК 1 — Схема образования оксида азота в тканях [34].

Ферменты синтеза оксида азота — NOS — в тканях организма представлены тремя изоформами: эндотелиальной (eNOS), нейрональной (nNOS), индуцибельной (iNOS) [20]. Они являются продуктами различных генов, образуются в разных тканях и состояниях организма, имеют свои особенности механизма действия и биологического значения в организме [20, 24]. Отдельные формы локализуются: еNOS — в эндотелиоцитах и кардиомиоцитах, а nNOS — в тканях нервных окончаний, скелетных и сердечной мышцах, других тканях [43]. оксид азот мышца спортсмен Две изоформы (eNOS и nNOS) находятся в клетках постоянно, и их принято называть конститутивной формой (cNOS). Они синтезируют небольшое количество NO в ответ на стимуляцию рецепторов. Их активность зависит от концентрации свободного кальция внутри клетки и белка кальмодулина, который связывает и транспортирует свободный кальций, поэтому называются кальций-кальмодулинзависимой формой [20].

В настоящее время наиболее изучена eNOS, которая является основной формой NO-синтазы нормальной стенки сосудов, гладких мышц, кардиомиоцитов, тромбоцитов и других клеток [12, 40]. Установлено, что в условиях физиологического покоя этот фермент находится в плазматической мембране клетки и имеет низкую активность. Он кодируется геном с малой экспрессией, однако при стрессе, хронической гипоксии и физической нагрузке экспрессия его существенно повышается, что приводит к повышению внутриклеточного уровня NO [12, 15, 40]. Активируется eNOS при увеличении концентрации свободного кальция в клетке, что происходит под действием многих рецептор-зависимых стимулов (ацетилхолин, брадикинин, серотонин, тромбин, аденозин-дифосфорная кислота (АДФ), глутамат), повышающих концентрацию кальция. Свободный кальций связывается со специфическим белком кальмодулином и активирует eNOS. Активируемая Са²±кальмодулинзависимая eNOS высвобождается в цитоплазму, где окисляет L-аргинин и синтезирует небольшое количество NO, который из эпителиальных клеток сосудов проникает в гладкие мышцы, где посредством активации гуани-латиклазы и повышения уровня циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) вызывает снижение уровня свободного кальция, расслабление и расширение сосудов.

Активация eNOS и повышение уровня NO наблюдаются под влиянием агонистов кальция (Ca²±ионофоры, Ca^-АТФаза), а также растяжения стенки сосуда, движения крови и некоторых других факторов, что рассмотрено в обзоре [40].

Нейрональная NO-синтаза (nNOS) клеток миокарда находится в саркоплазматическом ретикулуме [13]. Синтезируемый ею NO облегчает циклические перемещения Ca²⁺, что играет важную роль в сопряжении возбуждения и сокращения и увеличивает сократимость миокарда. Он также угнетает активность фермента ксантиноксиредуктазы, который усиливает образование супероксид-аниона (О₂') в миокарде, и таким образом защищает от повреждения липиды и другие компоненты миокарда.

Индуцибельная форма (iNOS) появляется во многих тканях только при экспрессии гена под воздействием стресс-факторов, в том числе оксидантов и физических нагрузок [3, 15, 20]. Однако для миокарда показано наличие ее в клетках при нормальных физиологических условиях [23]. Локализована iNOS вдоль сократительных волокон, в митохондриях и других органеллах миокарда. Эта форма фермента способна синтезировать огромное количество NO (в 1000 раз больше, чем cNOS) [24].

Ферменты NO-синтазы, в частности eNOS, способны образовывать не только оксид азота, но и метаболиты оксидантного стресса: ион супероксида (O^-₂) и пероксид водорода (Н₂О₂), а также нитрит-анион, особенно в условиях недостатка коферментов или аргинина [15].

Таким образом, ферменты синтеза NO следует рассматривать как сложный ферментный комплекс, синтезирующий разные высокоактивные соединения в зависимости от различного функционального состояния клетки, обеспеченности ее коферментами, незаменимыми аминокислотами, антиоксидантами. В этой связи изучение этих ферментов представляет особый интерес при физических нагрузках, которые вызывают оксидантный стресс, гипоксию, адаптационные перестройки метаболизма.

При неферментативном синтезе оксид азота образуется в клетках из нитритов и нитратов или его стабильных метаболитов (NO₃ NO₂ ——NO) с помощью ферментов нитрити нитрат-редуктаз [15, 39].

Отдельные реакции восстановления нитритов в тканях протекают с участием гемосодержащих протеинов, имеющих нитритредуктазную активность. К ним относят гемоглобин, миоглобин, цитохромоксидазу и другие [27]. Схематически это можно представить следующим образом:

2Н^- + NO^-₂+ гемоглобин (НЬ) > met Нb + NO+ Н₂О.

Неферментативный синтез NO в клетках протекает, в большей мере, в условиях гипоксии при сниженной активности NO-синтаз и выполняет вазодилататорную роль, хотя имеются и другие функции такого синтеза [15, 39].

Распад и превращение оксида азота в тканях происходит, в основном, путем быстрого (в течение нескольких секунд) взаимодействия его с молекулярным кислородом с образованием стабильных конечных метаболитов — нитрита и нитрата [12, 15], которые являются косвенными маркерами концентрации NO в тканях организма. В жидкой среде организма они дают ионы нитрита (NO^-₂) или нитрата (NO^-₃). Наряду с этим оксид азота связывается с белками и пептидами и может оказывать регулятор-ное действие в течение нескольких часов или дней.

При избыточном количестве NO и свободных радикалов в клетках он способен взаимодействовать с супероксидом (О^-₂), превращая его в очень токсическое вещество — пероксинитрит [21], который считается самым сильным оксидантом, разрушающим клеточные мембраны, поскольку вызывает повреждение молекулы ДНК, модифицирует белки и липиды клеточных мембран сосудистого эндотелия, увеличивает агрегацию тромбоцитов, участвует во многих реакциях. Это приводит к нарушению процессов метаболизма и сигнальных путей. В клетках создается так называемый оксидативно-нитратный стресс, индуцирующий их гибель.

Интересным и важным является тот факт, что повышение уровня NO в клетках, независимо от источника, эффективно предупреждает значительное нарастание его количества при стрессе и связанные с ним повреждения в тканях путем ингибирования индуцибельной формы фермента (iNOS) или через образование протекторных антиоксидантых или других белков [15, 39], т. е. существует сложный механизм обратной связи.

Таким образом, система оксида азота в клетках тесно связана с наличием молекулярного кислорода и компонентов окислительного стресса. Их взаимосвязь остается еще неизученной. Тем не менее очевидным является то, что в условиях тканевой гипоксии и активации окислительного стресса, что наблюдается при интенсивных физических нагрузках, система NO может выступать стабилизирующей, предотвращающей разрушение скелетных мышц и других тканей, и запускать молекулярные механизмы адаптации организма.