Извлечение спирторастворимых пигментов

Критический обзор приемов, примененных моими предшественниками для извлечения спирторастворимых пигмен;

тов, находится в моем сочинении 1901 г.,¹ равно как и изложение тех данных, на которых был основан мною выбор растворителя. Данные эти резюмированы и дополнены в следующей таблице [см. стр. 61. — Ред.].

Числа 3-го столбца представляют средние из определений различных исследователей, сопоставленных Graetz’oM (см. Winkelman 03, S. 135). Согласно развиваемой Nernst’oM теории, они могут служить показателями электродиссоциационной силы соответствующих жидкостей по отношению к растворенным в них электролитам.^[1][2]

Из этой таблицы очевидно несомненное первенство петролейного эфира, как наиболее индифферентного растворителя. К сожалению, петролейный эфир извлекает из свежих или сухих листьев, или слоевищ водорослей, почти исключительно одну только составную часть хромофилла, именно каротин. Явление это обусловлено, как я нашел (Цвет 01, Tswett 06), адсорбцией, т. е., так сказать, механическим прилипанием большинства пигментов к остову хроматофоров.

Обильного извлечения всех пигментов посредством петролейного эфира можно достигнуть, подвергнув исследуемую ткань предварительному нагреванию в воде температуры выше 60 °C. Опыты с Aesculus, Dactylis glomerata, Elodea, Lamium, Plantago major. Извлечение пигментов тем значительнее, чем выше температура нагревания и чем продолжительнее последнее. Действие предварительного нагревания на растворяемость пигментов в петролейном эфире основывается на том, что при температуре свыше 60° последние, связанные с бесцветным коллоидальным спутником, выступают из хлоропластов в виде зеленых шариков (хлороглобин) и, удаляясь, таким образом, из сферы действия молекулярных сил остова хлоропласта, могут растворяться в петролейном эфире.

К сожалению, указанный прием непригоден для цели изучения природного пигмента, так как даже при непродолжительном (3 минуты) нагревании в некоторых растениях (может быть, и во многих) возникают особые производные хлорофиллинов, о которых будет речь впоследствии. Кроме того, по легко понятным причинам, появляются всегда, особенно при кипячении, кислотные дериваты хлорофиллинов.

Затруднение, которое встречается вследствие адсорбционных явлений при извлечении тканей петролейным эфиром, возможно устранить, прибавляя к растворителю небольшое количество (Vjo — ‘/ы часть) метилового или этилового спирта. При извлечении сухой ткани все пигменты переходят тогда непосредственно в растворитель. При экстракции же свежего, водосодержащего материала получается двуфазная система. Растертая ткань образует кашицу, пропитанную водным спиртом; пигменты растворяются в спирте и переходят затем в большем или меньшем количестве в петролейно-эфирную фазу. Некоторые из них более растворимы в нижней фазе (ксантофиллы) и потому являются в ней в большей концентрации, чем в верхней. Но, увеличивая объем последней, заменяя ее свежими порциями петролейного эфира, удается и эти последние пигменты перевести в петролейную фазу. Полученной таким образом петролейно-эфирной жидкости придается большая химическая устойчивость путем удаления из нее спирта; достигается это промыванием жидкости дестиллированной водой.

При соблюдении некоторых предосторожностей (употребление чистых растворителей, устранение света) можно пользоваться для извлечения пигментов бензолом и сероуглеродом. Обе жидкости извлекают из растираемых в них свежих (но не сухих,) тканей совокупность спирторастворимых пигментов. Получаемые растворы, равно как и петролейно-эфирные (очищенные от спирта), пригодны для отделения составных красящих веществ по моему адсорбционному методу (глава V).

Эфирные экстракты могут играть важную роль в количественном анализе хромофиллов. Посредством этилового эфира всего легче извлечь в кратчайшее время совокупность спирторастворимых красящих веществ при исключении водорастворимых. В отличие от спирта, эфир растворяет очень мало воды, а потому эфирная вытяжка свежей ткани содержит лишь незначительные количества водорастворимых примесей и может быть освобождена от них посредством взбалтывания с дестиллированной водой. Обезвоженная затем посредством встряхивания с безводным Na₂S0₄, она становится химически более устойчивою; растворитель же, благодаря его огромной летучести, легко отогнать в безвоздушном пространстве при слабом нагревании, а пигмент перевести в петролейный эфир, в бензол или сероуглерод.

По моим наблюдениям, эфирные и петролейно-эфирные растворы хлорофилла гораздо более постоянны на свету, чем растворы спиртовые, из чего можно заключить о малой растворимости кислорода в двух первых жидкостях. Тем не менее нужно принять во внимание, что эфир, особенно в присутствии воды, способен под влиянием света соединяться с кислородом, причем образуется перекись водорода и уксусная кислота (Richardson a. Fortey). Отсюда необходимость сохранять запас эфира, как и вообще органических растворителей, в темном помещении.

Спирт, этот классический растворитель, par excellence для хлорофилла, может и впредь — при соблюдении некоторых предосторожностей — играть роль в расследовании хлорофиллов. Не нужно забывать только, что при медленном настаивании тканей в спирту нередко некоторые составные хлорофилла (хлорофиллины) претерпевают своеобразные изменения (Цвет 00; 01, Tswett 01).

Вообще прием настаивания тканей следует сдать в архив; в оправдание его можно лишь привести ignavam rationem, соображение простоты.

Рационально же приготовленные спиртовые экстракты могут применяться в контрольных целях, например в опытах разделения пигментов в двуфазных системах (отмешивание по Kraus’y).

Что касается методики экстрагирования, то избранная мною состоит в следующем. В целях вскрытия всех клеточек исследуемая ткань тщательно растирается в стеклянной ступке вместе с наждаком, к которому, для усреднения тканевых кислот, примешано немного осажденного СаС0₃ или MgO. Если ткань очень кислая, то можно прибавить соды.

Сухие, жесткие объекты, как например, листья Taxus, очень трудно растираются в сухом наждаке; массу следует увлажнить. Вместо наждака, в качестве размельчающего материала, можно применять стеклянный порошок; так как последний обладает значительной щелочностью (ср. Mylius, Warburg u Ihmori), то при обработке малокислотных объектов, как, например, листья Lamium или водяных растений (Tschirch, 84, S. 44), можно обходиться и без особого усреднителя. Употребление стеклянной ступки при работе с наждаком рекомендуется в виду того, что на фарфоре последний оставляет неотмываемые бурые следы.

На тщательно растертую массу наливается растворитель, и растирание продолжается до тех пор, пока густота окраски последнего не перестанет заметно увеличиваться. Раствор сливается, и масса растирается в свежих порциях растворителя, в зависимости от желаемой полности извлечения.

Наиболее трудно достичь количественного извлечения (из свежих тканей) посредством петролейного эфира с примесью спирта, в виду образования упомянутой выше двуфазной системы. Поэтому непосредственное извлечение петролейным эфиром непригодно для количественного анализа спирторастворимой группы составных хромофиллов, тем более, что некоторые члены этой группы (например хлорофиллин у бурых водорослей) вообще не способны растворяться в петролейном эфире, даже при наличности спирта.

В предыдущем была речь об извлечении пигментов из свежих тканей. Предварительное высушивание объектов в большинстве случаев нерационально, так как оно связано почти всегда с дезорганизацией протопластов и с воздействием всевозможных растворимых веществ клетки (между прочим кислых солей или кислоты) на пигмент хроматофоров. Величина этого воздействия — функция температуры и времени. Уменьшить же один из этих двух факторов можно только при условии увеличения другого.

• [1] Физико-химическое строение хлорофильного зерна. Труды Казанск.Общ. естествоисп., 35.
• [2] Для смесей жидкостей применима приблизительно формула пропорциональности n Е + пт_Е*_ (L|nebarger 96). п + ш