Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью

Диссертация: Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В начале 1970;х годов группой российских иммунологов под руководством Р. В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга — миелопептиды (МП) (Михайлова А.А., Петров Р. В. 1972; Михайлова А. А., Петров Р. В., 1976). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и… Читать ещё >

Содержание

  • Список сокращений, используемых в работе
  • Обзор литературы
  • Глава 1. Миелопептиды- новый класс эндогенных иммуномодуляторов
    • 1. 1. История открытия МП
    • 1. 2. Биологическая активность и механизмы действия МП
  • Глава 2. Противоопухолевый иммунитет
    • 2. 1. Естественный и специфический иммунитет. Иммунологический надзор и опухоли
    • 2. 2. Свойства и стратегия опухолевой клетки. Механизмы уклонения опухоли от воздействия системы иммунитета

Особенности механизма действия миелопептидов, обладающих противоопухолевой активностью (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность работы. Известно, что иммунная система играет основную роль в защите организма против любых чужеродных агентов. К ним относятся бактерии и их токсины, вирусы, простейшие, паразиты, донорские ткани, мутированные собственные клетки организма (например, раковые) и т. п. (Ройт А., Бростофф Дж., 2000).

В 50-х годах XX века. М. Burnet сформулировал положение об иммунологическом надзоре, согласно которому главная задача иммунологической системы сводится к контролю за постоянством внутренней среды и уничтожению всего чужеродного для организма (Burnet FM, 1970). Это положение было экстраполировано и на злокачественные опухоли: если в организме появляются злокачественно трансформированные клетки, это значит, что иммунологическая система не справляется со своими функциями. Однако, наряду с понятием иммунологического надзора существует такое понятие, как «стратегия опухолевой клетки», включающее множество возможностей, которые опухоль мобилизует для продолжения своего роста. Опухолевая клетка способна реализовать свою «стратегию» на всех этапах взаимодействия с организмом, начиная с момента её распознавания иммунной системой. Есть все основания говорить о большом разнообразии механизмов «ускользания» опухоли от иммунологического контроля (Дейчман Г. И., 2000; Seliger, 2005).

В проблеме злокачественных новообразований важны как изучение этиологии и патогенеза опухолей, так и разработка новых методов лечения и реабилитации онкологических больных. В течение последних десятилетий 20-го столетия интенсивно разрабатывался новый подход к лечению злокачественных опухолей — иммунотерапия. (Rosenberg SA, 2001) Иммунобиологические препараты используются в настоящее время на различных этапах онкологических заболеваний в целях восстановления и поддержания противоопухолевого иммунитета (иммунореабилитации). При правильном выборе таких препаратов их терапевтическая эффективность не вызывает сомнений, свидетельством чему являются многочисленные работы по изучению механизмов иммунореабилитации и успешный практический опыт (Robin М, Schlageter МН, 2005; Roy Noy, Malka Eppel, 2005;. Одно из важнейших требований к такого рода препаратам — наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 520% пациентов (Rosenberg S.A., 2001).

В начале 1970;х годов группой российских иммунологов под руководством Р. В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга — миелопептиды (МП) (Михайлова А.А., Петров Р. В. 1972; Михайлова А. А., Петров Р. В., 1976). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Многочисленные экспериментальные данные по биологическим свойствам МП показывают, что функциональная активность этого класса эндогенных регуляторов направлена на поддержание иммунного гомеостаза организма. При возникновении сдвигов в иммунной системе определенный МП взаимодействует с соответствующей клеткой-мишенью и индуцирует цепь реакций, приводящих к исправлению возникших нарушений. Показано, что один из МП (МП-2) обладает способностью восстанавливать функциональную активность Т лимфоцитов, подавленную продуктами опухоли (Стрелков J1.A., Михайлова А. А., 1996), и, тем самым, оказывает противоопухолевый эффект, подавляя рост различных типов трансплантированных опухолей in vivo (Михайлова А.А., Герасимова Г. К., 1998). С помощью лазерной проточной цитометрии показано, что МП-2 действует на CD4±, но не на С08±клетки. Первичная структура гексапептида МП-2 (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp) гомологична по четырем аминокислотным остаткам структуре пентапептида МП-5 (Val-Val-Tyr-Pro-Asp), что указывает на возможность наличия противоопухолевой активности и у МП-5. Для выяснения наличия такой возможности представляет интерес изучить влияние МП-5 на функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленных продуктами опухолевых клеток, а также исследовать некоторые механизмы реализации этого явления.

Цель исследования: сравнительное изучение способности МП-2 и МП-5 восстанавливать функциональную активность Т-лимфоцитов, подавленную продуктами опухолевых клеток, и выяснение возможных клеточных и молекулярных механизмов реализации данного эффекта. Для выполнения этой цели решались следующие задачи.

Задачи исследования.

1. Исследовать способность МП-5 восстанавливать пролиферативный ответ к митогену Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленный продуктами опухолевых клеток.

2. Определить клетку-мишень для МП-5 и изучить характер связывания этого пептида с клеткой-мишенью.

3. Исследовать влияние МП-2 и МП-5 на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в С04±лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли.

4. Исследовать сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты, поврежденные продуктами опухоли.

5. Изучить возможность иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 на Т-лимфоциты после воздействия на них другого повреждающего фактора, вируса кори.

Научная новизна. Впервые было показано в системе in vitro, что МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ митоген-стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови человека, сниженный под влиянием продуктов опухолевых клеток. Впервые было показано, что МП-5, как и МП-2, способен восстанавливать уровень продукции IL-2 и экспрессию IL-2R в Т-лимфоцитах периферической крови человека, подавленные продуктами опухолевых клеток.

В работе определена неизвестная ранее клетка-мишень для МП-5, CD4±лимфоцит, показано наличие специфического связывания этого пептида с клеткой-мишенью, построена изотерма полного насыщения для МП-5, рассчитана Kd (2.0×10″ 7М).

Экспериментально доказана общебиологическая значимость регуляторных пептидов МП-2 и МП-5: установлено, что эти пептиды исправляют нарушения в Т-лимфоцитах, вызванные различными повреждающими факторами (опухолевые клетки, вирус кори), если в основе этих нарушений лежит повреждение продукции IL-2 и экспрессии IL-2R.

Научная и практическая значимость. Расшифровка механизмов иммунокорригирующего эффекта МП-2 и МП-5 и доказательство общебиологической значимости этих регуляторных пептидов вносит вклад в понимание функционирования крайне сложной и совершенной системы иммунорегуляции. Выявление способности МП-2 и МП-5 восстанавливать продукцию эндогенного IL-2, подавленную в результате опухоль-индуцированной иммуносупрессии, указывает на перспективность использования данных пептидов в качестве препаратов, альтернативных рекомбинантному IL-2, токсичность которого доказана и является одной из основных проблем при его использовании в клинической практике.

Установленная в ходе данной работы клетка-мишень для МП-5 позволит в дальнейшем использовать его в качестве иммуномодулятора направленного действия при заболеваниях, связанных с нарушением функционирования CD4±iaieTOK.

Обзор литературы.

Выводы:

1. МП-5 восстанавливает пролиферативный ответ к митогену Т-лимфоцитов периферической крови человека, подавленный продуктами опухолевых клеток.

2. МП-2, как и МП-5, восстанавливает продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R в СБ4±лимфоцитах, сниженные под влиянием продуктов опухоли, что является ключевым звеном иммуномодулирующего эффекта этих пептидов.

3. Клеткой-мишенью для МП-2, как и для МП-5, является СБ4±лимфоцит, однако, аффинность рецептора к МП-2 значительно ниже, чем к МП-5.

4. С помощью радиактивнои флуоресцентномеченного МП-5, а также методом конкурентного вытеснения метки показана специфичность связывания МП-5 с клеткой-мишенью.

5. Под действием продуктов опухолевых клеток увеличивается связывание МП-5 с С04±лимфоцитами на 20−30%, что, очевидно, обусловливает направленное действие МП на поврежденное звено иммунитета.

6. Сдвиги в цитокиновой сети, происходящие при реализации иммунокорригирующего эффекта МП-2 на Т-лимфоциты после воздействия на них опухолевых продуктов in vitro, происходят, главным образом, в отношении Thl цитокинов, при этом выраженность эффекта тесно связана с состоянием иммунного статуса донора клеток.

7. МП-2, как и МП-5, оказывает иммунокорригирующее действие на пролиферативный ответ С04±лимфоцитов к митогену, на продукцию IL-2 и экспрессию IL-2R, сниженные под влиянием различных повреждающих факторов (продукты опухоли, вирус кори), что указывает на общебиологическую значимость этих эндогенных регуляторов.

Заключение

.

В течение последних десятилетий 20-го столетия интенсивно разрабатывался новый подход к лечению злокачественных опухолейиммунотерапия (Rosenberg SA, 2001). Иммунокорригирующие препараты играют в настоящее время ключевую роль при лечении иммунопатологических процессов, связанных с онкопатологией, в первую очередь там, где речь идет о воздействии на CD4±, NK-клетки и регуляции Thl/Th2 системы. Иммунобиологические препараты используются в настоящее время на различных этапах онкологических заболеваний в целях восстановления и поддержания противоопухолевого иммунитета (иммунореабилитации). При правильном выборе таких препаратов их терапевтическая эффективность не вызывает сомнений, свидетельством чему являются многочисленные работы по изучению механизмов иммунореабилитации и успешный практический опыт (Robin М, Schlageter МН, 2005; Roy Noy, Malka Eppel, 2005,). Одно из важнейших требований к такого рода препаратам — наличие противоопухолевых и отсутствие опухолестимулирующих свойств. По прогнозам специалистов такой метод лечения позволит, как минимум, в 2 раза снизить смертность от онкологических заболеваний. Используя иммунотерапию даже при самой запущенной, IV стадии рака, можно значительно продлить или спасти жизнь 520% пациентов (Rosenberg SA, 2001).

Хотя иммунотерапия злокачественных опухолей — относительно новое научное направление, полученные в течение последнего десятилетия результаты позволяют рассчитывать на доминирующую роль иммунотерапевтических препаратов в лечении онкологических заболеваний.

При разработке новых иммунобиологических лекарственных средств большое значение имеет поиск прототипов эндогенных биологически активных веществ и познание механизмов биохимических реакций, происходящих в организме. В связи с этим в настоящее время лучшей основой для создания новых лекарственных средств являются природные биорегуляторы — вещества, которые в организме передают информацию и управляют многочисленными биохимическими реакциями. Эти вещества представляют собой пептиды с молекулярной массой 1000−10 000 Da и обладают способностью регулировать функциональную активность клеточных популяций, служащих исходным материалом для их получения. В настоящее время эндогенные биологически активные вещества выделены из ткани головного мозга (коры белого вещества, эпифиза и гипоталамуса), органов иммунной системы (тимуса, костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и небных миндалин), сердечно-сосудистой и дыхательной систем, мочеполовой системы, а также из сетчатки, кожи, печени и некоторых других тканей животных и человека (Яковлев Г. М., Морозов В. Г., 1986).

Первое место среди других систем организма по числу известных иммунорегуляторов занимает иммунная система. Основную их часть составляют пептидно-белковые вещества. Образование низкомолекулярных пептидов из белковых предшественников in situ вблизи клеточных рецепторов сегодня еще окончательно не доказано. Однако при разработке данного направления был открыт целый ряд высокоактивных олигопептидовфрагментов иммуноглобулинов, тимусных гормонов, кининов и других соединений (Чипенс Г. И., Полевая Л. К., 1980).

К настоящему времени как в России, так и в других странах широкое практическое применение нашли факторы, секретируемые вилочковой железой, обладающие физиологической активностью. Результаты их испытаний свидетельствуют о продукции клетками тимуса целого ряда биологически активных веществ: тимозина, тимопоэтина, сывороточного фактора тимуса, Т-активина, тималина, тимоптина и других (Чипенс Г. И., Полевая Л. К., 1980; Hadden J.H., 1993).

Гормоны, цитокины, ферменты, являясь эндогенными регуляторами, стали в настоящее время практически незаменимыми лекарственными средствами. Рекомбинантные цитокины, такие как IL-1, IL-2, интерфероны, колониестимулирующие факторы, эффективно используются в клинической практике для лечения онкологических заболеваний. IL-2 — один из основных препаратов, включенных в современные схемы лечения иммуночувствительных опухолей, таких как меланома, почечно-клеточный рак, рак мочевого пузыря, некоторые виды опухолей головного мозга. Использование препаратов интерлейкина-2 при онкологических заболеваниях базируется, прежде всего, на том, что это основной цитокин, запускающий иммунный ответ и активирующй факторы, участвующие именно в противоопухолевой защите.

Введение

IL-2 обеспечивает ускорение пролиферации Ти В-лимфоцитов, нарастание иммунного ответа на Т-зависимый антиген, восстановление функционального резерва макрофагов. Однако высокодозная иммунотерапия интерлейкином-2 сопровождается выраженными побочными эффектами. Наиболее ранние из них лихорадка и озноб. У ряда пациентов IL-2-терапия вызывает гастриты, что требует введения в схему лечения блокаторов Н-2 рецепторов. Высокие дозы IL-2 приводят к задержке жидкости в организме, вызванной олигурией, гипотензией и нарушением проницаемости сосудов. Также наблюдаются гемодинамические нарушения, сходные с септическим шоком (Rosenberg SA, Yang JC, 1994; White RL, Schwartzentruber DJ, 1994; Research initiative. Treatment Action! 1999).

Важно отметить, что миелопептиды как эндогенные пептидные регуляторы, действие которых направлено на сохранение иммунного статуса организма, чрезвычайно перспективны для использования в клинической практике. Отсутствие барьера гистосовместисмости при реализации их эффектов, низкая молекулярная масса, избирательное влияние на поврежденное звено иммунитета или кроветворения, природные механизмы действия — все эти свойства МП обеспечивают мягкую направленную коррекцию сдвигов в иммунной системе и полное отсутствие токсичности при их введении в организм.

Таким образом, исследование и внедрение в клиническую практику иммуномодуляторов направленного действия является сейчас актуальной проблемой. Подробное изучение физико-химических свойств, структуры и спектра биологических активностей пептидов, обладающих иммунорегуляторной активностью, позволит в будущем создать их нетоксичные синтетические аналоги для терапии различного рода заболеваний.

Материалы и методы.

Пептиды МП-2, МП-5 и МП-4 были синтезированы методом классической химии в ФГУ Российском Кардиологическом Научно-Производственном Комплексе Росздрава (Москва), МП-5-FITC был синтезирован на химическом факультете в Государственном Университете.

1 <5 г. Санкт-Петербурга, [ H]-Mn-5-de-hydro-proline (далее [ Н]-МП-5) был синтезирован твердофазным методом химического гидрогенолиза в атмосфере трития в Институте молекулярной генетики РАН (Москва).

Выделение фракции мононуклеарных клеток периферической крови человека. Необходимое количество крови (25−30 мл от каждого донора) собирали из вены здорового донора в 3 стерильные пластиковые пробирки (BD Biosciences, USA) объемом 10 мл каждая, содержащая гепарин в концентрации 17МЕ/мл. Кровь разводили PBS (1:1) при комнатной температуре и подслаивали шприцем смесь фиколл-урографин (d= 1.077), одну пятую от конечного объема, центрифугировали 20 мин (1000g, 20°С) с отключенным тормозом. Фракцию мононуклеарных клеток собирали на границе раздела фаз фиколл/среда, затем суспензию клеток дважды отмывали в PBS. Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Выделение фракции СБ4±лимфоцитов периферической крови человека. Метод негативной иммуномагнитной сепарации, основанный на применении парамагнитных полистирольных микрочастиц Dynabeads®, покрытых антителами к специфическим антигенам, был использован для выделения CD4+ лимфоцитов периферической крови человека. В экспериментах использовали «Систему для негативного выделения CD4±клеток» фирмы DYNAL beads, USA. Мононуклеары периферической крови здоровых доноров были получены центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина. В соответствии с протоколом, к образцу мононуклеаров были добавлены оптимизированный «коктейль» высокоспецифичных мышиных антител и частицы Dynabeads®. После 20-минутной инкубации пробирка с образцом была помещена в магнитный сепаратор Dynal МРС®-, где были захвачены все нежелательные клеточные популяции из образца мононуклеарной суспензии, связанные с магнитными частицами. Супернатант содержал С04±лимфоциты, чистота клеточной популяции составляла 95% (оценку проводили методом лазерной проточной цитометрии). Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60. Кондиционная среда лейкозной клеточной линии человека HL-60 (КС HL-60) (Санкт-Петербург, Россия) была использована как супрессирующая субстанция в экспериментах по опухоль-индуцированной иммуносупресии. Культивирование клеток проводили в пластиковой посуде фирм Costar (CLLIA), Nunclon (Дания). На вторые сутки культивации клетки были цетрифугированы 7 мин, при 500g, супернатант был отобран, разлит по аликвотам 1мл и о заморожен при t=-28 С.

Вирус кори. В качестве источника вируса кори использовали живую коревую вакцину (ЖКВ) — вакцинный штамм вируса кори L-16 (Microgen, Moscow, Russia). Количество вируса, которое может инфицировать 50% посеянного в плашку монослоя культуры ткани — ТЦД^оВ лунки 96-луночного планшета, содержащие по 2×105 Т лимфоцитов, добавляли от 100 до 200 ТЦД5о (500−1000 ТЦД50 на 1 млн клеток). Общий объем смеси составил 200 мкл/лунка.

Оценка пролиферативного ответа Т-лимфоцитов. ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека культивировали в атмосфере 5% СО2 при t=37°C в 96-ти луночном планшете в 7 количестве 150 тысяч клеток на лунку в объеме 200 мкл. Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопнева) — 5мк Ки/мл добавляли за 4 часа до окончания о инкубации. После окончания инкубации планшет охлаждали до t=-28 С, чтобы разрушить мембраны клеток. Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа.

Фильтры помещали в отдельные флаконы со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту).

Количественное определение продукции «свободного» IL-2. Уровень продукции «свободного» IL-2 проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА). ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60 (или вируса кори) и МП-2 (или МП-5) в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали 7 минут, при 500g, при t=20°C, аккуратно отбирали надосадочную жидкость и использовали в коммерческой тест-системе для определения «свободного» человеческого IL-2 в супернатанте культуры клеток и сложных биологических жидкостях (Citimmune sci inc. USA). Оптическую плотность образцов измеряли на приборе Multiscan («Titertek», Швейцария).

Оценка экспрессии IL-2R alpha chain (CD25). Для измерения уровня экспрессии IL-2R (CD25) ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии супрессирующих агентов (КС HL-60 или вируса кори) и МП в течение 24 или 48 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 1 мл буфера. Каждую пробу делили на две части по 0,5 мл («контроль» и «опыт»), В пробирки «опыт» добавили антитела (изотип: mouse IgG2a, Immunotech & Coulter Com., USA) в количестве 10 мкл/тест. Пробирки «контроль» оставляли без изменения для определения аутофлюоресценции. Клетки инкубировали 40 минут при t=4°C в PBS, содержащем 0,02% азида натрия и 1% FSC. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Регистрировали флуоресценцию не менее 5 тыс. клеток, соответствующих по характеристикам светорассеяния жизнеспособным. Полученные гистограммы анализировали с помощью программы WinMDI.

Одновременная регистрация IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy в одном образце (Cytometric Bead Array — СВА). Шесть популяций частиц с флуоресценцией определенной интенсивности были покрыты фиксированными антителами, специфичными к IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa или INFy, соответственно. Частицы были смешаны вместе, интенсивность флуоресценции регистрировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter XL Coulter, USA. На следующем этапе частицы с фиксированными антителами были смешаны с РЕ-конъюгатом регистрируемых антител, после чего были инкубированы с рекомбинантными стандартами цитокинов (для построения калибровочной кривой) или тестируемыми образцами, с образованием сэндвич-комплекса.

ФГА-стимулированные Т-лимфоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии КС HL-60, МП-2 в течение 24, 48 или 72 часов при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=20°C. Супернатант аккуратно отбирали и использовали (согласно протоколу) для одновременной регистрации IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNFa и INFy (BD Human Thl/Th2 Cytokine СВА Kit, BD Biosciences, USA).

Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Результаты были проанализированы с помощью программы BD СВА Analysis Software (BD Biosciences, USA).

Анализ специфического связывания МП-5 с клеткой-мишенью.

1) Построение изотермы полного насыщения для [ Н]-МР-5.

Для построения изотермы полного насыщения были использованы.

3 7 увеличивающиеся концентрации изотоп-меченного [ Н]МР-5 (0.06×10'М -117.5×10″ 7М) и С04±лимфоциты здоровых доноров. Клетки были инкубированы в пластиковом 96-луночном планшете 1 час при t=37°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500 g 7 минут, супернатант аккуратно удаляли и добавляли аналогичный объем буфера. Планшет охлаждали до t=-28°C, чтобы разрушить мембраны клеток. При помощи харвестера содержимое каждой лунки переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Каждый фильтр переносили в отдельный флакон со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводилось на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Результаты счета приведены в импульсах в минуту (срт). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

2) Построение изотермы полного насыщения для MP-5-FITC.

Для построения изотермы полного насыщения были использованы увеличивающиеся концентрации MP-5-FITC (0.9×10″ 7М — 100×10'7М) и CD4±лимфоциты здоровых доноров (п=3). Клетки были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. После окончания инкубации клетки центрифугировали при 500g 7 минут при t=4°C. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) — Mean (контроль). Изотермы были проанализированы методом нелинейной регрессии при помощи программы PRISM 4.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA).

3) Вытеснение MP-5-FITC с помощью МП-5, МП-2 или МП-4. Фиксированная концентрация MP-5-FITC (10 мкг/мл), которая использовалась для получения полного насыщения, и CD4+ лимфоциты здоровых доноров были инкубированы в пластиковом 24-луночном планшете 40 минут при t=4°C. По окончании времени инкубации в каждую пробу были добавлены избытки немеченых пептидов: МП-5 (0.1 мкг/мл — 31.2 мкг/мл) — МП-2 (10мкг/мл — 100 мкг/мл) — МП-4 (0.1 мкг/мл — 31.2 мкг/мл). Клетки были о инкубированы еще 40 минут при t=4 С. После окончания инкубации клетки о центрифугировали при 500g 7 минут при t=4 С. Супернатант аккуратно удаляли, клеточный осадок каждой пробы ресуспендировали в 500 мкл буфера легким встряхиванием. Измерение уровня флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter XL, Coulter, USA). Интенсивность лиганд-рецепторного взаимодействия оценивали по изменению средней интенсивности флуоресценции (mean) клеток, обработанных мечеными пептидами, в опытных образцах по сравнению со свечением контрольных клеток (необработанных меченым пептидом). Относительный уровень экспрессии вычисляли по формуле Mean (опыт) — Mean (контроль).

Показать весь текст

Список литературы

  1. Р.Г., Михайлова А. А. и др. Докл. АН, 1998, т. 358, с. 847 849.
  2. Р.Г., Елкина С. И., Калина Н. Г., Михайлова А. А. Иммунология, 2003, № 6, с. 342−327.
  3. Р.Г., Михайлова А. А., Ляшенко В. А. и др. Иммунология, 2000, № 3, с. 23−26.
  4. Н.М., Чехун В. Ф., Система интерлейкинов и рак, Киев: ДИА, 2000, с. 224.
  5. .Т., Володько Н. А., Шпарик Я. В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности. Львов, 1989.
  6. Вит В. Т, Хеллман С., .Розенберг С. А. Биологические методы лечения онкологических заболеваний. М. Медицина, 2002
  7. Г. И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты. Биохимия, 2000, № 65, с. 92−111.
  8. Р.Е. Взаимодействие организма и опухоли. Киев: Наук, думка, 1977.-235 с. 63.
  9. М.В., Белевская Р. Г., Александер С. К., Михайлова А. А. Эндогенный костномозговой иммунорегулятор миелопептид-2 нейтрализует иммуносупрессивное действие живой коревой вакцины. Физилология и патология иммунной системы, 2006 в печати.
  10. Ю.Лебедев К. А., Понякина И. Д. «Иммунограмма в клинической практике» 1990 г., М" «Наука»
  11. ЬМанцевичюте-Эрингене Е. В. Возможные подходы к исследованию иммунологического статуса у онкологических больных и у здоровых людей. Эксп. онкол.-1984.-T.6.-N.2.-C.8−14
  12. В.М. Патология иммунной системы у бестимусных животных. ИНиТ-сер. Иммунология-Т .8.-1979
  13. Д.Н. Хроническое воспаление. М.:Медицина, 1991., с. 272.
  14. Н.Михайлова А. А., Герасимова Г. К., Трещалина Е. М. и др. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева), 1998, т.42, № 5, с. 176 178.
  15. А.А., Захарова J1.A., Петров Р. В. Докл. АН, 1971, т. 203, с. 948 950.
  16. А.А., Петров Р. В., Захарова JI.A. Докл. АН, 1971, т. 197, с. 209 -220.
  17. П.Петров Р. В., Михайлова А. А., Фонина Л. А., Степаненко Р. Н. Миелопептиды М.: Наука 2000, с. 181.
  18. И.М., Зеленова М. А., Михайлова А. А. Иммунология, 1998, № 4, с. 30−33.
  19. Д.К. «Противоопухолевые реакции лейкоцитов». Минск, «НиТ», 1988.
  20. Р.В., Михайлова А. А., Захарова Л. А. Иммунология, 1980, № 4, с. 48 -50.
  21. Р.В., Михайлова А. А., Захарова JI.A. Гематология и трансфузиология, 1984, № 2, с. 43 45
  22. А., Бростофф Дж., Д.Мейл. Иммунология, Москва «МИР» 2000
  23. М., Берг П., Гены и геномы, т.2, Москва «МИР» 1998
  24. JI.A., Михайлова А. А. Иммунология, 1990, № 6, с.32
  25. JI.A., Михайлова А. А., Гурьянов С. А. и др. Докл. АН, 1998, т. 358, с. 134−136
  26. JI.A., Михайлова А. А., Сапожников A.M. и др. Докл. АН, 1996, т. 347, с. 278−271
  27. JI.A., Михайлова А. А., Фонина JI.A. и др. Бюл. эксперим. Биологии и медицины.1995.№ 5, с.530
  28. А.П. Макрофаги и противоопухолевый иммунитет". ИНИТ,-1990.-т. 19.
  29. JI.A., Балдин М. И., Ефремов М. А. и др. Биоорган, химия, 2001, т. 27, с. 403−407
  30. JI.A., Гурьянов С. А., Ефремов М. А., Смирнов О. В. Биоорган, хим. 1998, т. 24, с. 403−407
  31. JI.A., Михайлова А. А., Кирилина Е. А. и др. Докл. АН, 2001, т. 381, с. 834−836
  32. С.В., Герасимова Г. К., Михайлова А. А., Петров Р. В. Докл. АН, 2003, т. 390, с. 268−271
  33. Г. И., Полевая JI.K., Веретенникова Н. М. и др. Структура и функции низкомолекулярных пептидов. Рига 1980- 218.
  34. Я.В., Билынский Б. Т. «Некоторые методические подходы к изучению естественных клеток-киллеров в клинике.» Лаб.дело.-1988.-н.5.-с.3−8.
  35. Г. М., Морозов В. Г., Хавинсон В. Х. Цитомедины. Функция в организме. Использование в клинической практике: Сб науч тр. Томск 1986- 9−11.
  36. А.А. Основы иммунологии. Москва «Медицина» 1999.
  37. Abul К. Abbas, Andrew Н. Lichman. Cellular and Molecular Immunology. Fifth edition, ELSEVIER SAUNDERS, 2005.
  38. Addae MM, Komada Y, Taniguchi K, Kamiya T, Osei-Kwasi M, Akanmori BD, Nkrumah FK. Surface marker patterns of T cells and expression of interleukin-2 receptor in measles infection. Acta Paediatr Jpn. 1998 Feb-40(l):7−13.
  39. Antony Paul Andrew and Restifo Nicholas P CD4+CD25+ T Regulatory Cells, Immunotherapy of Cancer, and Interleukin-2 J Immunother. 2005 — 28(2): 120— 128.
  40. Bardoscia MT, Amstad P, Honegger P. Expression of the proto-oncogene c-fos in three-dimensional fetal brain cell cultures and the lack of correlation with maturation-inducing stimuli. Brain Res Mol Brain Res.1992 Jan-12(l-3):23−30).
  41. Bell AF, Burns JB, Fujinami RS. Measles virus infection of human T cells modulates cytokine generation and IL-2 receptor alpha chain expression. Virology. 1997 Jun 9−232(2):241−7.
  42. Biassoni R, Cantoni C, Human natural killer receptors and co-receptors. Review. Immunol Rev.2001 Jun- 181:203−14.
  43. Во X, Broome U, Remberger M, Sumitran-Holgersson S. Tumor necrosis factor alpha impairs function of liver derived T lymphocytes and natural killer cells in patients with primary sclerosing cholangitis. Gut. 2001 Jul-49(l):131−41.
  44. Borodai NV. Carpentier V, Vassard C, Plessis C, Motta G, Monsigny M, Roche AC. The characteristics of lectin distribution and level in breast dysplasias and cancers Tsitol Genet. 1998 Jan-Feb- 32(l):49−55.
  45. Bottino C, Castriconi R Cellular ligands of activating NK receptors. Review. Trends Immunol. 2005 Apr-26(4):221−6.
  46. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells. Immunol Rev. 2006 Dec-214(l):73−91.
  47. Burgers, J.K., Marshall, F.F. and J.T. Isaacs. Enhanced anti-tumor effects of recombinant human tumor necrosis factor plus VP-16 on metastatic renal cell carcinoma in a xenograft model. J. Urol. 1989,142: 160−164.
  48. Burnet FM The concept of immunological surveillance. Progress in Experimental Tumor Research 13:1−27,1970.
  49. Chiao J.W., Arline Z., Lutten J.D. et. al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, vol. 83, p. 3432
  50. Coffer PJ, Burgering BM. Forkhead-box transcription factors and their role in the immune system. Nat Rev Immunol 2004−4:889−899.
  51. Cui S, Reichner JS, Mateo RB, Albina JEActivated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide-dependent or -independent mechanisms. Cancer Res. 1994 May l-54(9):2462−7.
  52. Damoiseaux J., Regulatory T cells: back to the future. The Journal of Medicine. Review, 2006.
  53. De Mejia EG, Prisecaru VI. Lectins as bioactive plant proteins: a potential in cancer treatment. Crit Rev Food Sci Nutr. 2005−45(6):425−45.-
  54. Den van Eynde B. Identification of cancer antigens of relevance for specific cancer immunotherapy. Bull Mem Acad R Med Belg. 2001−156(10−12):548−55.)
  55. Fetsch J., Maurer H.R. Exp. Hematol., 1990, v. 18, p. 322 327-
  56. Filho JP, Correa ZM, Odashiro AN, Coutinho AB, Martins MC, Erwenne CM, Burnier MN Jr. Histopathological Features and P-glycoprotein Expression in Retinoblastoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Oct-46(10):3478−83.)
  57. Glycoconj J. Characterization and cellular localization by monoclonal antibodies of the 60 kDa mannose specific lectin of human promyelocytic cells, HL60. 1994 Aug-ll (4):333−8.-
  58. Goldstein A.L., Slater F.D., White A. Natl. Acad. Sci., 1966, v.69, p.1800−1803
  59. Greider Carol W. and Blackburn Elizabeth H., Tracking telomeraseCell, Vol. SI 16, S83-S86, January 23,2004 Copyright 2004 by Cell Press
  60. Hadden J.H. Immunol Today 1993- 14: 275−280.
  61. Howell WM, Rose-Zerilli MJ. Interleukin-10 polymorphisms, cancer susceptibility and prognosis. Review. Fam Cancer. 2006−5(2): 143−9.
  62. Huff Т., Muller C.S., Otto A.M. e.a. Int. J. Biochemistry, 2001, v. 33, p. 205 -220.
  63. Jager D, Jager E, Knuth A. Immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J Clin Pathol. 2001 Sep-54(9):669−74.
  64. Janson D Fontenot, Jeffrey P Rasmussen, Marc A Gavin, Alexander Y Rudensky, A function for interleukin 2 in foxp3-expressing regulatory T cells, Nature Immunology, vol.6, num.11, nov.2005.
  65. JOHNSEN, A.K., TEMPLETON, D. J, SY, M, and HARDING, C.V. (1999). Deficiency of transporter for antigen presentation (TAP) in tumor cells allows evasion of immune surveillance and increases tumorigenesis. J Immunol 163, 4224−4231.
  66. Jurianz K, Ziegler S, Garcia-Schuler H, Kraus S, Bohana-Kashtan O, Fishelson Z, Kirschfink M. Complement resistance of tumor cells: basal and induced mechanisms. Review. Mol Immunol. 1999 Sep-Oct-36(13−14):929−39.
  67. Kalland Т. Physiology of natural killer cells. In vivo regulation of progenitors by interleukin-3//J.Immunol.-1987.-V.139.-P.3671 3675.
  68. Kaver R. EMF and current cancer concepts., Bioelectromagnetics, 1996- 17(5), p. 339−357.
  69. Kirk A. Landon AACR Prize for Basic Cancer Research Lecture Blackburn Telomerase and Cancer. Mol Cancer Res.2005- 3: 477−482.
  70. Kosmaczewska A, Frydecka I, Bocko D, Ciszak L, Teodorowska RCorrelation of blood lymphocyte CTLA-4 (CD 152) induction in Hodgkin’s disease with proliferative activity, interleukin 2 and interferon-gamma production. Br J Haematol. 2002 Jul-118(l):202−9.
  71. Krensky AM. The HLA system, antigen processing and presentatio. Kidney Int Suppl. 1997 Mar-58:S2−7.
  72. Kuo L.M., Robb R.J.// J. Immunol. 1986. Vol. 137. P. 1558.
  73. Larsson Anna-Karin Early life cytokines, viral infections and IgE-mediated allergic disease Doctoral thesis from the Department of Immunology, the Wenner-Gren Institute, Stockholm University, Stockholm, Sweden 2006. ISBN 91−7 155 304−5 ppl-74
  74. Malik S. T, Naylor M.S., East N, Oliff A, Balkwill F.R. // Eur. J. Cancer. 1990. V.26. P.1031−1034.
  75. Miescher S, Whitesside T. L, Carrel S, von Fliedner V.J. J. Immunol. 1986, vol. 136, p. 1899
  76. Mikhailova A, Fonina L., Kirilina E. e. a. Reg. Peptides, 2003, v. 114, p. 183 -187.
  77. Mikhailova A, Fonina L, Kirilina E. e. a. Reg. Peptides, 1994, v. 53, p. 203 -209.
  78. Mullins DW, Martins RS, Elgert KD Tumor-derived cytokines dysregulate macrophage interferon-gamma responsiveness and interferon regulatory factor-8 expression. Exp Biol Med (Maywood). 2003 Mar-228(3):270−277.
  79. , H.J. (1938). The remaking of chromosomes. Collecting Net to be found. 13,181−198.
  80. Naito Z. Role of the small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family in pathological lesions and cancer cell growth. J Nippon Med Sch. 2005 Jun-72(3):137−45.
  81. Paul S, Sodhi A. Immunol. Letters, 2002, v. 2, p. 171 182.
  82. Paukovits W. R, Laerum O.D. Naturforsch, 1982, v. 37C, p. 297 300.
  83. Perri RT. Impaired expression of cell surface receptors for В cell growth factor by chronic lymphocytic leukemia В cells. Blood. 1986 Apr-67(4):943−8.
  84. Petrov R. V, Mikhailova A.A. J.Immunol. 1969, v. 103, p.679.
  85. Petrov R. V, Mikhailova A.A. Cell Immunol, 1972, v. 5, p. 392 401.
  86. Petrov R. V, Mikhailova A. A, Stepanenko R. N, Zakharova L.A. Ibid, 1975, v. 27, p. 342.
  87. Petrov R. V, Mikhailova A. A, Zakharova L.A. L. e. a. Ann. Immunol, 1980, 131 D, p. 161−171.
  88. Petrov R. V, Mikhailova A. A, Zakharova L.A. L. e. a. Scand. J. Immunol, 1986, v. 24, p. 237−243.
  89. Petrov R. V, Mikhailova A, Kirilina E. Folia Biologica, 1994, v. 40, p. 455 -461.
  90. Phillips J.H., Gemlo G.T., Myers W.W. et al. In vivo and in vitro activation of natural killer cells in advanced cancer patients undergoing combined recombinant interleukin-2 and LAK cell therapy//J.Clin.Oncol.-1987.-V.5.-P.1933.
  91. Rosenberg SA, Yang JC, Topalian SL, et al. Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high dose bolus interleukin-2. JAMA. 1994−271:907−913.
  92. Rosenberg SA. Progress in human tumor immunology and immunotherapy. Nature 411:380−384,2001.
  93. Routes JM, Morris K, Ellison MC, Ryan S. Macrophages kill human papillomavirus type 16 E6-expressing tumor cells by tumor necrosis factor alpha-and nitric oxide-dependent mechanisms. J Virol. 2005 Jan- 79(1): 116−23.
  94. Sakaguchi S. Naturally arising CD4 regulatory T cells for immunological self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 2004−22:531−562.
  95. Schuld A, Haack M, Hinze-Selch D, Mullington J, Pollmacher T, Experimental studies on the interaction between sleep and the immune system in humans, Psychother Psychosom Med Psychol. 2005 Jan-55(l):29−35.
  96. Seliger В. Strategies of tumor immune evasion. BioDrugs. 2005- 19(6):347−54.
  97. Sentman CL, Barber MA, Barber A, Zhang T. NK cell receptors as tools in cancer immunotherapy. Adv Cancer Res. Review. 2006−95:249−92.
  98. Sersa, G., Willingham, V. and L. Milas. Anti-tumor effects of tumor necrosis factor alone or combined with radiotherapy. Int. J. Cancer. 1988,42:129−134.
  99. Simmons Paul, RN, ACRN Research initiative. Treatment Action! Volume 5 No.2, Aprill 1999 Interleukin-2 for the treatment of HIV infection.
  100. Spies Thomas, Hutchinson Fred Cancer Research Center, Seattle, WA Relevance of NKG2D and its Ligands in Tumor Immunity, Cancer Vaccines 2004, Abstract Book, S-09.
  101. Stella Pelengaris, Mike Khan & Gerard Evan. Cell, C-MYC: MORE THAN JUST A MATTER OF LIFE AND DEATH. Nature Reviews Volume 109, Issue 3,3 May 2002, Pages 321−334.
  102. Stella Pelengaris' and Mike Khan. The many faces of c-MYC. Archives of Biochemistry and Biophysics. Volume 416, Issue 2,15 August 2003, Cancer 2, 764−776 (2002) p. 129−136.
  103. Strelkov L.A., Mikhailova A.A., Sapozhnikov A.M. e. a. Immunol. Letters, 1996, v. 50, p. 143−147.
  104. Strelkov L.A., Mikhailova A.A., Fonina L.A., Petrov R.V. FEBS Letters, 2000, v. 470, p. 281 -284.
  105. SUMMARIES FOR PATIENTS, Genetic Risk Assessment and BRCA Mutation Testing for Breast and Ovarian Cancer Susceptibility: U.S. Preventive Services Task Force Recommendations Ann Intern Med. 2005 Sep 6−143(5):I47.
  106. Szoke T, Kayser K, Baumhakel JD, Trojan I, Furak J, Tiszlavicz L, Horvath A, Szluha K, Gabius HJ, Andre S. Prognostic significance of endogenous adhesion/growth-regulatory lectins in lung cancer. Oncology. 2005−69(2): 167−74.
  107. Takatsu K. Role of interleukin-5 in immune regulation and inflammation Nippon Rinsho. Review 2004 Oct- 62(10): 1941−51.
  108. Taytor-Paradimitiou J. The interferons//Biochem. Soc. Symp.-1984.-V.49.-P.109.
  109. Winkelhake, J. L, Stampfl, S. and R.J. Zimmerman. Synergistic effects of combination therapy with human recombinant interleukin-2 and tumor necrosis factor in murine tumor models. Cancer Res. 1987,47: 3948−3953.
  110. White RL, Schwartzentruber DJ, Guleria A, et al. Cardiopulmonary toxicity of treatment with high dose interleukin-2 in 199 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell carcinoma. Cancer. 1994−74:3212−3222.
  111. Whiteside TL Immune suppression in cancer: Effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention. Semin Cancer Biol. 2005 Sep 6.
  112. Wootton SK, Halbert CL, Miller AD. Sheep retrovirus structural protein induces lung tumours. Nature. 2005 Apr 14−434(7035):904−7.
  113. Wyatt HA, Sampson AP, Balfour-Lynn IM, Price JF. Production of the potent neutrophil chemokine, growth-related protein alpha (GROalpha), is not elevated in cystic fibrosis children. Respir Med. 2000 Feb-94(2): 106−11.
  114. Xu Y, Sette A, Sidney J, Gendler SJ, Franco A. Tumor-associated carbohydrate antigens: a possible avenue for cancer prevention. Immunol Cell Biol. 2005 Aug-83(4):440−8.
  115. Yamada K, Brink I, Engelhardt R. Factors influencing F-18. 2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (F-18 FDG) accumulation in melanoma cells: is FDG a substrate of multidrug resistance (MDR)? J Dermatol. 2005 May-32(5):335−45.
  116. Zimmermann VS, Benigni F, Mondino A. Immune surveillance and anti-tumor immune responses: an anatomical perspective. Immunol Lett. 2005 Apr 15−98(l):l-8.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?