Применение лиофилизированной амниотической оболочки в лечении воспалительных заболеваний роговицы

Актуальность работы.

Проблема оптимизации методов лечения воспалительных заболеваний роговицы в современных условиях приобретает особую актуальность в связи с широкой их распространенностью (по расчетным данным, в стране воспалительными заболеваниями глаз страдают около 16 млн. человек, составляя 40.2% амбулаторного приема и до 50% госпитализированных) [84], рецидивирующим течением, опасностью снижения остроты зрения и развитием слепоты. Многообразие микроорганизмов, вызывающих заболевания глаз (бактерии, хламидии, вирусы, грибки, простейшие), отсутствие четко выраженных симптомов, характерных для конкретного возбудителя, полиморфизм клинических проявлений одной и той же инфекции обуславливают трудности дифференциальной диагностики инфекционной офтальмопатологии [4], задерживают начало своевременного квалифицированного лечения, и, как следствие, приводят к тяжелым исходам и большому количеству осложнений.

Наблюдения последних лет свидетельствуют о серьезных сдвигах в эпидемиологии воспалительных заболеваний роговицы [84]. Немаловажную роль в изменении структуры и росте заболеваемости инфекционными кератитами играет появление относительно новых этиологических факторов, лежащих в основе патологических изменений в переднем отрезке глаза. Одним из них, к примеру, является микротравматизация роговицы при ношении контактных линз (KJI). По данным FDA с KJI связано до 13 тысяч бактериальных кератитов в год на 26 млн. носителей KJI. Риск развития бактериальных кератитов при использовании ЮГ составляет от 0.21% до 0.28% в год. Имеется зависимость между типом KJI, временем ношения и риском развития поражений роговицы.

Бурное развитие современных микрохирургических технологий, внедрение новых операций, увеличение числа амбулаторных вмешательств 5 рефракционная хирургия, факоэмульсификация) так же вносят некоторое количество осложнений воспалительного характера в этиологическую структуру инфекционных заболеваний глаз.

С другой стороны, параллельно сдвигам в этиологических факторах развития инфекции, меняются и сами возбудители — растет число резистентных штаммов микроорганизмов ко многим наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам. Это связано, как со свойствами самих возбудителей активировать механизмы формирования лекарственной устойчивости, так и с неадекватным применением противомикробных средств. Неправильное использование специфической антибактериальной и противовирусной терапии приводит к тяжелым последствиям для организма пациента: развитию дисбактериозов, аллергических реакций [83], хронизации патологического процесса. Что касается структуры возбудителей инфекционных кератитов, то необходимо отметить, что данные последних исследований свидетельствуют о сдвиге в сторону более агрессивной грамотрицательной микрофлоры, куда входит такой проблемный микроорганизм, как синегнойная палочка. Соотношение грамположительных и грамотрицательных возбудителей за последние 5 лет изменилось с 81,1%/18,1% до 51,4%/48,6% [172].

Таким образом, течение воспалительного процесса в роговице на современном этапе приобретает более тяжелый, длительный характер и представляет большие трудности в лечении.

К сожалению, в настоящее время нет регулярной отчетности и статистики по воспалительным заболеваниям роговицы, однако даже отдельные исследования, проведенные в Москве, Челябинске, Уфе подтверждают тезис о высокой распространенности и тенденции к росту этой группы заболеваний.

Исходя из выше изложенного, становится понятной необходимость поиска новых комплексных подходов к лечению данной патологии.

В последние годы в клинической медицине заметно возрос интерес к использованию тканей, представляющих собой биогенные стимуляторы. Одной из таких тканей является амниотическая оболочка — самый внутренний слой зародышевых оболочек человека.

Впервые в медицинской практике амниотическую мембрану применил в 1910 году Davis в кожной трансплантологии [168]. В офтальмологии ее используют с 40-х годов. Применение амниотической оболочки в качестве ткани для трансплантации регламентировано законом РФ от 22.12.1992 г. № 4180−1 (с изменениями от 20.06.2000 г.) «О трансплантации органов и (или) тканей человека». Настоящий закон определяет условия и порядок трансплантации органов и (или) тканей человека опираясь на современные достижения науки и медицинской практики, а также учитывая все рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения.

Особое место трансплантация амниотической мембраны занимает в лечении различных заболеваний роговицы [3,8,9,113,115,143,178,199,211].

Метод послойной лечебной кератопластики далеко не новый. В качестве биологических покрытий предлагаются различные ткани: кадаверная роговица, фиброзная капсула почки, сухожильные трансплантаты, синтетические материалы и т. д. Однако в последнее время приоритет, благодаря его уникальным качествам, отдается трансплантату из амниона.

Амниотическая мембрана человека обладает высокой прочностью и пластичностью, однако не препятствует прохождению лекарственных веществ из конъюнктивальной полости, что дает возможность использовать ее в качестве универсального биологически активного барьера. Кроме этого, амниотическая оболочка является полупрозрачной и позволяет беспрепятственно наблюдать за динамикой патологического процесса в роговице. Доказана способность амниотической мембраны активизировать процессы репаративной регенерации в роговице посредством содержащихся в ней биологически активных энзимов 7 эпидермальный фактор роста, трансформируемый фактор Р, основной фибробластный фактор роста, эндотелины, усиливающие пролиферацию, миграцию и дифференцировку стволовых клеток эпителия), а также веществ, предупреждающих эпителиальный апоптоз и угнетающих развитие фиброза [178].

Широкие возможности применения амниотической оболочки в офтальмологии, в частности для лечения инфекционных кератитов, ставят вопрос о разработке комплексных методик амниопластики, создании необходимых запасов трансплантационного материала и наиболее эффективных методах его консервации.

Среди многочисленных методов, предложенных для консервирования тканей, особое место занимает высушивание из замороженного состояния. Лиофилизация — метод высушивания предварительно замороженной ткани, предназначенной для длительного хранения и последующего использования ее в клинической практике (Большая медицинская энциклопедия Т. 16,1960, С22−23). В офтальмологии разрешены к применению и успешно используются: лиофилизированная твердая мозговая оболочка для склеропластических операций (лицензия В167 373 регистрационный № 623 от 03.12.1996), лиофилизированная кадаверная роговица для послойной кератопластики (авт. свидетельства 5 037 564 от 14.04.1992, 5 038 677 от 28.05 1992), высушенная над силикогелем амниотическая оболочка (патент РФ 2 214 091 С1 от 09.04.1992). Многими авторами доказано, что процесс лиофилизации сохраняет трансплантационные и пластические свойства тканей, не требует применения химических консервантов, изменяющих их биохимический составлиофилизированные трансплантата могут длительно храниться при комнатных условиях (до 5 лет), легко транспортируются на любые расстояния, не требуя при этом каких-либо особых условий [58,119,139].

Цель исследования: разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием консервированной методом лиофилизации амниотической оболочки.

Задачи:

1. Разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний глаз с использованием кератопластики лиофилизированной амниотической оболочкой и консервативной терапии.

2. Разработать способ консервации амниотической оболочки человека методом лиофилизации.

3. Изучить тканевые изменения в амниотической мембране человека, происходящие в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации.

4. Проанализировать антимикробную активность лиофилизированной амниотической оболочки в разные сроки от момента консервации, в сравнении с нативным амнионом.

5. На основании полученных результатов определить сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной амниотической оболочки человека для лечения воспалительных заболеваний роговицы.

Научная новизна.

Впервые в нашей стране разработан комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы, в основе которого лежит кератопластика с использованием консервированной AM человека. Впервые разработана методика заготовки и консервации AM человека методом лиофилизации — высушивания в вакууме из замороженного состояния. Описаны физические и морфологические изменения, происходящие в ткани амниона в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации. Проведены исследования, доказывающие 9 высокую антимикробную активность консервированной AM в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных кератитов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacter freundi.

Практическая значимость.

Определены показания и противопоказания к кератопластике лиофилизированной АО для лечения воспалительных заболеваний роговицы. Разработаны практические рекомендации по применению лиофилизированной AM, показана целесообразность использования данной методики лечения при различных воспалительных заболеваниях роговицы.

Определены оптимальные сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной AM. Морфологически доказана возможность создания депо лекарственных препаратов в трансплантате, усиливающих действие AM на воспалительный процесс в роговице.

Внедрение.

Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием кератоамниопластики лиофилизированной АО человека используется в практической работе стационара ОКБ, материалы диссертационной работы включены в учебный план работы кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ, используются в лекционном курсе для ординаторов, аспирантов и слушателей кафедры.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на:

1. Научно-практической конференции «Актуальные вопросы воспалительных заболеваний глаз», проходившей в НИИГБ имени Гельмгольца 20−21 ноября 2001 году в Москве.

2. Научно-клинической конференции кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ совместно с сотрудниками офтальмологической клинической больницы г. Москвы 17. декабря 2003 года.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Библиография включает 221 источников, в том числе 139 работ отечественных и 82 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 20 рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием лиофилизированной АО является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнениипозволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Лечебное кератопокрытие лиофилизированной АО при тяжелых деструктивных поражениях роговицы может служить предварительным этапом подготовки глаза к радикальным хирургическим вмешательствам, например сквозной пересадке роговицы.

3. Способ консервации АО методом лиофилизации позволяет сохранить ее важнейшие биопластические свойства (прочность, эластичность) в течение длительного времениявляется эффективным, экономичным, не требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

Выводы.

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы различной этиологии с использованием лиофилизированной амниотической оболочки является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнении. Применение его в клинической практике позволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Распространенность воспалительных заболеваний роговицы на примере стационара ОКБ за период 1998 — 2002 годы остается на достаточно высоком уровне и составляет 190,4 ± 0,33 (1,91% от общего числа больных, госпитализированных за год), при этом около 50% составляют больные наиболее активного трудоспособного возраста. Наибольшую часть 39,4%-44,8% в структуре воспалительных заболеваний роговицы с тенденцией к росту занимают глубокие посттравматические и герпетические кератиты, осложненные иритами и иридоциклитами.

3. Разработан способ консервации амниотической оболочки человека путем высушивания в вакууме из замороженного состояния (лиофилизации), который позволяет сохранять ее важнейшие пластические (прочность, эластичность) и биохимические (антимикробные, противовоспалительные, регенераторные) свойства в течение длительного времени (12−15 месяцев) — является эффективным, экономичным, простым в исполнениине требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

4. Тканевые изменения, происходящие в амниотической оболочке под действием лиофилизации, заключаются в гомогенизации и уплотнении составляющих ее слоев за счет потери влаги. В.

103 процессе последующей регидратации происходит восстановление структуры и размеров (до 68,3%) амниотической оболочки. Деструктивных изменений в ткани как лиофилизированной, так и регидратированной амниотической мембраны независимо от срока хранения не выявлено.

5. Регидратация лиофилизированной амниотической оболочки лекарственными веществами позволяет создать депо препарата в глубоких слоях составляющей ее соединительной ткани, что усиливает положительное действие трансплантата на воспалительный процесс в роговице. Содержание антибиотика (гентамицин 4%) в амниотической мембране при насыщении ее 2 мл раствора в течение 40−60 мин составляет в среднем 0,054 ± 0,003 г (1,113 ±0,033 мл).

6. В процессе лиофилизации, хранения и регидратации противомикробное действие амниотической мембраны снижается по сравнению с нативной в среднем на 10,2%. Лиофилизированная амниотическая оболочка со сроком хранения до 1 года обладает достаточно высокой активностью в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных кератитов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Candida spp. При хранении амниотической оболочки в лиофилизированном состоянии более 1 года (1года и 4,5 месяца) антимикробная активность значительно снижается, однако остается достаточной для того, чтобы предотвратить распространение микроорганизмов по поверхности трансплантата.

7. Рекомендуемый нами срок хранения и использования амниотической оболочки, консервированной методом лиофилизации 12 -15 месяцев.

Практические рекомендации.

1. При отсутствии эффекта от консервативной терапии у больных с инфекционными кератитами следует применять хирургические методы лечения для быстрого купирования воспалительных явлений и предотвращения опасных осложнений. В качестве такового может быть использован метод кератопластики лиофилизированной амниотической оболочкой.

2. У больных с глубокими язвами роговицы, развившимися на фоне выраженной недостаточности лимбальных стволовых клеток (тяжелые ожоги, множественные хирургические вмешательства, синдром СтивенаДжонса) кератопластика амниотической мембраной может служить предварительным этапом перед выполнением других операций: трансплантации лимбальных клеток, сквозной кератопластики и их различных модификаций.