Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Ионы меди входят в состав активных центров жизненно важных ферментов и необходимы млекопитающим в течение всего индивидуального развития. Конфликт между незаменимостью ионов меди для организма и их высокой токсичностью разрешается с помощью специальной системы белков, которые осуществляют перенос ионов меди по каналам межклеточной коммуникации, их транспорт через мембранные барьеры, распределение в клетках и экскрецию. Разнообразные генные мутации, нарушающие функционирование этих белков (врожденные ошибки метаболизма меди), приводят к избыточному накоплению ионов меди в клетках различных органов, или к дефициту ферментов, содержащих медь. Как дефицит, так и избыток ионов меди, вызванные экологическими факторами, приводят к развитию заболеваний, которые фенотипически сходны с врожденными ошибками метаболизма меди. Доля этих (наследственных и приобретенных) заболеваний, которые получили название «медь-зависимые микроэлсментозы», растет во всех странах мира. Особенно тяжелые нарушения функционирования печени, мозга и почек вызывает дисбаланс ионов меди в рационе новорожденных млекопитающих в период молочного вскармливания, когда еще сохраняется эмбриональный тип метаболизма меди, при котором медь не выводится из организма, а накапливается в печени. Молекулярно-генетические механизмы, контролирующие содержание меди в рационе новорожденного и смену типов метаболизма меди в онтогенезе, не известны. Реальные предпосылки для таких исследований созданы, в частности, работами Отдела молекулярной генетики НИИЭМ РАМН [20, 137], в которых, с одной стороны, показано, что на всех этапах эмбрионального развития источником ионов меди для зародыша является церулоплазмин матери (ЦП, КФ 1.16.31.1, медьтранспортный гликопротеин крови). С другойобнаружено, что в молоке (единственном естественном источнике ионов меди для новорожденного) содержится ЦП, который синтезируется в клетках молочной железы. Эти данные позволяют надеяться, что изучение роли ЦП молока как источника ионов меди для новорожденных будет способствовать пониманию особенностей эмбрионального типа метаболизма меди и открытию механизма, который обеспечивает контроль за уровнем меди в рационе новорожденного. В дальнейшем эти данные могут стать основой для иаучно-обосиопанных рекомендаций по содержанию ионов меди и их молекулярной «упаковке» в молочных смесях для новорожденных.

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ: I) изучение соотношения содержания ЦП и ионов меди в молоке в разные сроки лактации- 2) сравнение физико-химических свойств двух гканеспецифических молекулярных форм ЦП: ЦП крови и ЦП молока- 3) изучение распределения пептидной части молекулы ЦП молока в организме крысят с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1). Измерить энзиматическим и иммунологическим методами динамику содержания ЦП в молоке в течение первого месяца лактации, определить концентрацию ионов меди в этих же образцах молока и оценить молярные соотношения ЦП и меди в молоке одного срока пактации. 2). Сравнить препараты ЦП молока и крови по мол. массе, составу углеводных цепей, электрофорстичсской подвижности, чувствительности к хелатирующим и денатурирующим агентам. 3). Изучить динамику распределения радиоиодированной пептидной части ЦП грудного молока в организме крысят. Параллельно у крысят тех же зозрастов методом иммуноблотинга изучить тканеспецифический профиль экспрессии гена рецептора ЦП и сопоставить данные полученные в обоих типах экспериментов. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ, представленных в работе состоит в следующем. Получены доказательства, что rcc ионы меди в молоке первого месяца лактации входят в юстав тканеспецифического ЦП (ЦП молока). Содержание ЦП в молоке и, шедовательно, ионов меди в рационе новорожденного, поддерживается постоянным снижением уровня экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы по мере увеличения >бъема молока, производимого ею (примерно 10 мкг на кг тела ребенка). Помимо этого юказано, что препарат ЦП молока содержит десиалированные формы ЦП, он чувствительнее, чем ЦП кропи, к хелатирующим агентам, но более устойчив к Фонтанной протеолитической деградации. В экспериментах типа «чейз», в которых юпользовали электрофоретически чистый препарат [1251]ЦП грудного молока, тродемонстрировано, что пептидная часть ЦП, введенного per as в желудочно-кишечный •ракт крысят с эмбриональным типом метаболизма меди, без изменений переносится в сровоток, тканеспецифично распределяется по органам, утрачивает ионы меди переходит в форму апоЦП) и выделяется через желчь в виде низкомолекулярных.

1251]дериватов. У крысят со взрослым типом метаболизма меди [1251]ЦП молока расщепляется в пищеварительном тракте. Во фракции плазматических мембран, выделенных методом флотационного центрифугирования из клеток сердца, почек, эритроцитов, легких и селезенки крысят, рецептор ЦП обнаружен при обоих типах метаболизма меди. По данным иммуноблотинга экспрессия гена рецептора ЦП существенно изменялась в зависимости от типа метаболизма меди только в трех органах. Так, при эмбриональном типе метаболизма меди рЦП обнаружен в печени и в клетках слизистой желудка, но не найден в клетках мозга. После смены типа метаболизма меди, напротив, содержание рецептор" ЦП снижается в печени, он появляется на мембране клеток мозга и не выявляется в клетках слизистой желудка.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о функционировании белков, поддерживающих баланс ионов меди у новорожденных, и особенностях тканеспецифической экспрессии их генов. Установлена роль ЦП молока как единственного источника ионов меди для новорожденного. При этом выявлены три важных аспекта. Во-первых, содержание ионов меди в пище новорожденного строго контролируется путем регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы матери, что косвенно, но убедительно, свидетельствует о важном значении баланса меди в рационе новорожденного. Во-вторых, ЦП молока на фоне низкого содержания ЦП в крови при эмбриональном типе метаболизма меди, выполняет роль транспортера меди для клеток внепеченочных органов новорожденных. В-третьих, при грудном вскармливании молекулярно-клеггочные механизмы предотвращают поступление ионов меди из кровотока в клетки мозга. В целом результаты показывают, что в период новорожденности метаболизм меди у млекопитающих адаптирован к получению ионов меди, связанных с молекулой ЦП молока. Полученная информация выявляет причинно-следственную связь между сохранением эмбрионального типа метаболизма меди в течение молочного вскармливания и молекулярной формой ионов меди в пище новорожденного в этот период. Это заставляет по-новому взглянуть на выбор стратегии вскармливания новорожденных. Так, опираясь на полученные данные, следует широко развернуть тропаганду в пользу грудного вскармливания детей, так как молочные смеси не обеспечивают баланс ионов' меди в рационе. С другой стороны, молоко матерей, у которых в клетках молочной железы нарушены репрессия гена ЦП, или метаболическое включение ионов меди в молекулу ЦП, может быть токсичным, как, например, молоко гомозиготных мышей линии toxic milk. Поэтому своевременно поднять вопрос об измерении содержания ЦП и ионов меди в молоке женщин группы риска (различные хронические печеночные и неврологические заболевания в семье). Необходимо также на уровне ВОЗ добиваться, чтобы содержание меди и их молекулярная «упаковка» в молочных смесях соответствовали изменению этих показателей в грудном молоке в течение лактации. Это составляет практическое значение представляемого исследования. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования доложены на: ХХХП1 Международном конгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня- 5 июля 1997 г., Международной школе по биологии и медицине для молодых ученых (Берлин, октябрь 1997), Первой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга (ноябрь 1997), Второй Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов (декабрь 1997), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, май 1998), на Международном симпозиуме по структуре, стабильности и фолдингу белков (Москва, июнь 1998 г.), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, сентябрь, 1998), на конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», (Москва, апрель, 1998, устное сообщение, отмечено премией), Международной конференции по медицине для молодых ученых (Люблин, Польша, апрель 1998 г.), а также на научно-практических конференциях, посвященных проблемам экологии и здоровью нового поколения (ЮНЕСКО, МАНЕБ и ЭкоБалтика, 1998 г.) ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав ЦП молока. 2. ЦП молока отличается от ЦП крови по ряду физико-химических свойств. З. При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного тракта переносится в кровоток новорожденного и избирательно поглощается различными органами, которые освобождают его в кровоток в })орме апо-ЦП.

выводы.

1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав ЦП молока, тканеспецифической самостоятельной молекулярной формы ЦП.

2. ЦП молока отличается от ЦП крови по составу углеводных цепей и чувствительности к ЭДТА. Препарат ЦП молока микрогетерогенен и устойчив к спонтанной протеолитической деградации.

3. При созревании молока (молозиво — переходное — зрелое) содержание ЦП в нем падает обратно пропорционально увеличению объема молока, потребляемого новорожденным, Таким способом достигается поддержание количества меди в рационе новорожденного на постоянном уровне.

4. При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока без модификаций переносится из желудочно-кишечного тракта в кровоток новорожденного и избирательно поглощается различными органами, которые освобождают его в кровоток в форме апо-ЦП.

5. При эмбриональном типе метаболизма меди клетки печени содержат рецептор ЦП и способны поглощать ЦП молока сразу после поступления его в кровоток.

6. В раннем постнатальном периоде клетки мозга не поглощают ионы меди, поступающие в составе ЦП молока в организм новорожденного.

7. Эмбриональный тип метаболизма меди адаптирован к ЦП молока как единственному источнику ионов меди. Смена типов метаболизма меди у млекопитающих находится в причинно-следственной связи с молекулярной формой ионов меди в пище.

Работа поддержана грантами РФФИ № 98−04−49 790 и № 98−04−49 846, Программой «Геном человека» (грант № 74−98), межвузовской научной программой «Университеты России — фундаментальные исследования» (№ 1316), Программой ГКНТ «Приоритетные направления генетики» (№ 1−232), грантом Совета поддержки «Ведущие научные школы России» (№ 96−15−97 742). ш.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Представленные данные позволяют считать, что тканеспецифический ЦП молока в раннем периоде онтогенеза является единственным источником ионов меди для новорожденных и является механизмом обеспечивающим баланс меди до формирования механизма экскреции ионов меди через желчь. Помимо этого круговорот меди в раннем онтогенезе адаптирован к получению ионов меди только в составе ЦП. Адаптация выражается в способности клеток слизистой верхних отделов желудочно-кишечного тракта с помощью специфического рецептора эндоцитозного типа перемещать ЦП молока в кровоток. Похоже, что ЦП молока непосредственно доставляет часть своих ионов меди к клеткам различных органов. Круговорот ЦП молока, по-видимому, завершается в печени, куда он доставляет прочносвязанные с его молекулой ионы меди, являясь причиной накопления их в этом органе в раннем периоде новорожденное&trade-. На основании этих данных могут быть уточнены некоторые детали путей переноса ионов меди при эмбриональном типе метаболизма меди (срав. схему 3.2 со схемой 2 в разделе «Обзор литературы»).

Полученные результаты указывают, что для новорожденных может быть очень важным, чтобы ионы меди были «упакованы» в молекулу ЦП, снижение содержания которого в молоке обеспечивает постоянный уровень потребления ионов меди в расчете на 1 кг веса тела ребенка. Данные обращают внимание также на то, что при искусственном вскармливании нарушается форма «упаковки» ионов меди и не соблюдается контроль за количеством ионов меди в рационе новорожденного. Таким образом, данные затрагивают вопросы, связанные с влиянием искусственного вскармливания, при котором в организм поступает избыток свободных ионов меди, на распределение меди в организме новорожденных, а также на функционирование органов, страдающих в первую очередь при нарушениях метаболизма меди, то есть печени и мозга. Они позволяют высказать предположение, что нарушение экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы, приводящие как к дефициту, так и к избытку меди в рационе новорожденного в период молочного вскармливания, могут быть причиной развития различных заболеваний, как, например, изменения в метаболизме меди у мышей гомозиготных носителей tx гена (toxic milk) [74, 130].

Медь, упакованная в ЦП грудного молока 4 трансцитоз ЦП молока через слизистую желудочно-кишечного тракта 4 транспорт ЦП молока по кровотоку к печени и к другим органам передача Из426-Си)? выведение из клеток апоЦП молока.

Схема 3.2. Круговорот меди у млекопитающих при эмбриональном типе метаболизма меди.

По-видимому, необходимы специальные дополнительные исследования, направленные на изучение влияния молочных смесей на метаболизм меди в раннем онтогенезе, нарушения которого, весьма вероятно, могут бьггь причиной умственной ретардантности и хронических заболеваний печени и почек.