Структурные изменения во внутренней мембране митохондрий, индуцированные системой объемной регуляции

Актуальность. В бактериях и клетках животных и растений существует специфическая система регуляции метаболизма, в основе которой лежит эффект изменения объема цитоплазмы клетки (система объемной регуляции). Клеточный объем регулируется осмолярностью среды и системами ионного транспорта, локализованными в бактериальных и клеточных мембранах. Система объемной регуляции, по-видимому, используется для того, чтобы управлять метаболизмом клетки при изменении внешних условий, в частности, при изменении содержания солей в окружающей среде. В работах Э. Халестрапа [1] и нашей лаборатории [2−3] было показано, что система объемной регуляции присутствует в митохондриях. В частности было показано, что при увеличении объема митохондриального матрикса происходит стимуляция синтеза АТФ, (3-окисления жирных кислот, увеличение скорости дыхания и степени фосфорилирования некоторых митохондриальных белков. В условиях наших экспериментов функционирование системы объемной регуляции индуцировалось путем изменения тоничности среды инкубации. Ранее было обнаружено, что при снижении тоничности среды инкубации система окислительного фосфорилирования митохондрий резко меняет свои кинетические параметры [4−5]: ее функционирование соответствует модели локального сопряжения, предложенного Вильямсом. Согласно этой модели дыхательные протонные помпы и АТФ-синтаза работают как единый мембранный суперкомплекс. При этом протоны передаются на АТФ-синтазу в составе этого суперкомплекса. В условиях нормальной тоничности реализуется общепринятый в настоящее время механизм Митчелла [6], в котором ферменты дыхательной цепи и АТФ-синтетаза функционируют независимо друг от друга, дыхание и фосфорилирование сопряжены через электрохимический потенциал. Таким образом, оказалось, что система окислительного фосфорилирования способна функционировать в двух качественно различных состояниях, переход между которыми контролируется системой объемной регуляции.

В настоящее время появляется значительное количество работ, посвященных выделению и описанию свойств суперкомплексов дыхательной цепи [7] и олигомеризации комплексов АТФ-синтетаз [8−9]. Увеличивается число работ, посвященных описанию свойств специальной группы белков, контролирующих ультраструктуру митохондрий. Однако связь между системой объемной регуляции и изменением «структуры мембран митохондрий остается не исследованной. В этой связи представлялось важным исследовать структурные изменения, которые могут происходить в мембранах митохондрий под действием системы объемной регуляции. Для решения этой задачи был применен метод малоуглового рассеяния нейтронов, который позволил нам регистрировать структурные переходы в мембранах митохондрий без предварительной фиксации материала, которая может приводить к изменениям формы и размеров исследуемого объекта.

Цель работы. В настоящей работе поставлены две цели. Во-первых, показать возможность применения метода малоуглового рассеяния нейтронов для изучения строения мембран функционирующих («живых») митохондрий. Во-вторых, использовать метод малоуглового рассеяния нейтронов для регистрации перестроек ультраструктуры мембран митохондрий, индуцированных системой объемной регуляции (возникающих при низкоамплитудном набухании митохондрий).

Конкретные задачи исследования:

1) показать возможности применения метода малоуглового рассеяния нейтронов для изучения ультраструктуры функционирующих митохондрий;

2) показать влияние системы объемной регуляции на строение крист митохондрий. Исследовать фазовые переходы во внутренней митохондриальной мембране в условиях работы этой системы;

3) определить геометрические параметры крист митохондрий. Сравнить полученные результаты с данными электронной и атомно-силовой микроскопии;

4) сопоставить изменения в ультраструктуре митохондрий печени и сердца;

5) показать, что результаты малоуглового рассеяния нейтронов получены на митохондриях, сохраняющих дыхательную функцию и функцию генерации потенциала. Провести проверку функциональной активности митохондрий после эксперимента по малоугловому рассеянию нейтронов;

6) провести измерения толщины внутренней мембраны митохондрий на модели субмитохондриальных частиц с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Получить основные структурные характеристики этой мембраны (толщину, объемные доли липида и белка, распределение липида и белка по толщине мембраны).

Научная новизна. В работе показано, что митохондрии могут существовать в двух структурных состояниях, переход между которыми регулируется системой объемной регуляции. В условиях наших экспериментов он регулируется тоничностью среды инкубации. Показано, что при переходе к гипотоническим средам инкубации в митохондриях печени происходит формирование упорядоченных двумембранных структур из складок внутренней мембраны.

Впервые были показаны возможности применения метода малоуглового рассеяния нейтронов для изучения структуры внутренней мембраны функционирующих «живых» митохондрий.

На модели субмитохондриальных частиц была определена толщина внутренней митохондриальной мембраны. Без предварительной фиксации или заморозки образцов на функционирующих митохондриях показано существование «окон» липидного бислоя во внутренней митохондриальной мембране.

Практическая ценность работы. В работе на примере митохондрий показаны возможности применения метода малоуглового рассеяния нейтронов для определения параметров структуры функционирующих мембранных биологических систем. Существование исследованных в работе двух структурных (и функциональных) состояний митохондрий открывает новые возможности поиска митотропных физиологически активных препаратов, избирательно взаимодействующих с двумембранными ламеллярными структурами, которые могут возникать in vivo при набухании митохондрий, часто наблюдаемом при определенных заболеваниях и при стрессовых воздействиях.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Первая глава посвящена обзору литературных данных, сведениям о структурном полиморфизме митохондрий, проблеме сопряжения реакций окислительного фосфорилирования в митохондриях и влияния тоничности внешней среды на механизм окислительного фосфорилирования и другие функции митохондрий. Во второй главе описана методика выделения митохондрий и приготовления образцов для экспериментов по малоугловому рассеянию нейтронов, электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. Рассмотрены теоретические и экспериментальные основы метода малоуглового рассеяния. Третья глава посвящена исследованию структурных перестроек во внутренней митохондриальной мембране, происходящих под действием системы объемной регуляции. На примере митохондрий печени и сердца было показано, что митохондрии могут находиться в двух структурных состояниях, переход между которыми регулируется тоничностыо среды инкубации. В митохондриях печени было обнаружено формирование упорядоченных двумембранных структур, дающих интерференционные пики в кривых малоуглового рассеяния нейтронов. Результаты малоуглового рассеяния подтверждены данными электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии. В четвертой главе проведены структурные исследования внутренней митохондриальной мембраны в составе субмитохондриальных частиц. Получены основные характеристики структуры мембраны.

ВЫВОДЫ.

1. С помощью малоуглового рассеяния нейтронов идентифицированы два структурных состояния мембран митохондрий печени и сердца, переход между которыми регулируется системой осморегуляции.

2. Было показано формирование из складок внутренней мембраны митохондрий печени и сердца высокоупорядоченных структур, дающих интерференционные пики в кривых малоуглового рассеяния нейтронов.

3. Определены геометрические параметры двумембранной упорядоченной структуры, образующейся в митохондриях печени, и показано участие липидного бислоя в формировании этой структуры.

4. Полученные значения толщины двумембранных структур независимо подтверждены методами электронной микроскопии и атомно-силовой микроскопии.

5. Обнаружены различия в условиях формирования упорядоченных структур в митохондриях печени и сердца: в митохондриях печени эти структуры образуются в гипотонических условиях, а в митохондриях сердца — в изотонических средах.

6. Получены основные характеристики внутренней мембраны митохондрий на модели СМЧ: толщина мембраны, объемные доли липида и белка, степень неоднородности распределения белка и липида по толщине мембраны.

7. Полученные результаты показали возможности метода малоуглового рассеяния нейтронов для исследования структуры функционирующих митохондрий.