Исключительно важная роль мембранных белков (МБ) в клетке обусловлена ихспособностью детектировать и передавать сигналы через липидный бислой, осуществлятьтранспорт ионов и различных веществ, участвовать в слиянии мембран и т. п. Кроме того,-30% всех белков, кодируемых целыми геномами, способны взаимодействовать смембранами (Wallin et al., 1998; Arkin et al., 2002). Понимание связи между структуройМБ и их функцией представляет собой одну из актуальных и интереснейщих задачструктурной биологии. Рещение указанной нроблемы имеет и большой нрактическийинтерес. В частности, МБ являются привлекательными объектами для создания новыхлекарственных нрепаратов (-50% всех представленных на рынке лекарственныхпрепаратов направлено на взаимодействие с МБ), осуществляющих коррекцию нередачисигнала через мембрану (взаимодействие с мембранными рецепторами, модификациюпроводимости ионных каналов). Указанные процессы являются ключевыми при развитииряда заболеваний. Многие такие белки содержат в своих мембранных доменах несколькоучастков нолипептидной цепи и/или функционируют в олигомерных состояниях — в виде, димеров, тримеров и т. д. Механизмы ассоциации и межбелкового узнавания, играющиеважную роль в ряде клеточных процессов (Harder et al., 2003; Ubarretxena-Belandia &Engelman, 2001), являются ключом для нонимания функционирования белковых-.:комнлексов. В связи с этим, большой интерес нредставляют задачи, но изучениюдетальных молекулярных механизмов межбелковых взаимодействий в такой гетерогеннойсреде, какой является линидный бислой. Получение структурной информации о процессахолигомеризации белков в мембранах с помощью современных экспериментальныхметодов крайне затруднено из-за больших сложностей с вьщелением, очисткой, нриготовлением образцов (Liang et al., 2002). Многообещающей альтернативой в рещенииданной проблемы является применение методов компьютерного моделирования. Наиболее подходящими объектами для разработки и тестировапия таких методовявляются а-спиральные комплексы в мембранах. Эти системы достаточно стабильны исостоят из гидрофобных и/или амфифильных а-спиралей. Последние представляютнаиболее часто встречающийся структурный элемент в мембранных доменах белков, ответственный за их связывание с липидпым бислоем. Взаимодействия междумембрапосвязанными а-спиралями обеспечивают функциональную активность огромногочисла белков и пептидов. Среди них — интегральные мембранные реценторы (например, семейство рецепторов, чье действие опосредовано G-белками, рецепторы гормонов, компоненты сенсорных систем), разнообразные ионные каналы (АТФазы, калиевыеканалы, лиганд-зависимые ионные каналы) и молекулярные транснортеры, дефензины. мембрано-активные пептиды, обладающие антибактериальной, фузогенной, мембранолитической активностью и др. (Efremov et al., 2004). В настоящее время расшифрованыпространственные структуры около 50 белков, имеющих в своем составе комплексытрансмембрапных (ТМ) а-спиралей (сайтhttp://blanco.biomol.uci.edu/Membrane_Proteins_xtal.html)).Появление пространственной модели ТМ димера гликофорина, А человека (GpA)стимулировало разработку теоретических методов исследования взаимодействия аспиралей в мембранных доменах белков (см. разд. П. З), т.к. появилась возможностьсравнения результатов расчетов с экспериментом. Эти работы можно разбить на тригруппы: 1) Подходы, основанные на расчетах энергии спираль-спиральныхвзаимодействий. При этом жестко фиксируется а-спиральная структура, и расчетыпроводят либо в «вакууме», либо в однород1юй среде с низкой диэлектрическойнроницаемостью (см. разд. II.3.1) — 2) Методы, использующие статистические данные новзаимодействию аминокислотных остатков а-спиральных пучков в белках с известнойпространственной структурой (см. разд. П.З.З) — 3) Моделирование, основанное на учетемембранного окружения неявным образом, например, с помощью обобщенной моделиБорна, с использованием энергии поверхностного натяжения и др. (см. разд. II.3.2) (Вдальнейшем термин «мембрана» будет употребляться и для математических моделей, имитирующих влияние мембранного окружения). Поскольку в настоящее времяпредпринимаются лишь первые попытки создания указанных подходов, предлагаемыеметодики характеризуются целым рядом ограничений. Так, в методах первой группы, ввиду отсутствия гетерогенного мембранного окружения, «естественным образом"стабилизирующего а-спиральную конформацию ТМ участков субъединиц, приходитсявводить искусственные ограничения, предотвращающие дестабилизацию спирали. Какбудет показано в настоящей работе, в этих случаях нет возможности выявитьспецифичность взаимодействия спираль-спираль (см. разд. III. 1.1). Кроме того, ограниченное число доступных пространственных структур делает трудновыполнимойзадачу использования статистики для предсказания спираль-спиральных контактов (методы группы 2). Наиболее перспективными являются подходы с использованиеммоделей неявно-заданной среды. С их помощью недавно были получены интересныерезультаты для ряда а-спиральных димеров (Ducarme et al., 2000; Im et al., 2003).Авторам удалось осуществить моделирование ассоциации спиралей в гетерогенноммембранном окружении без «стягивающих» межмономерных ограничений. Вместе стем, следует отметить и ряд серьезных допущений, сделанных в этих работах. Так, ТМсегменты заведомо располагали в гидрофобном слое мембраны, в ориентации «голова кголове», что не дает возможности проанализировать энергетические характеристикивстраивания пептидов в мембрану. Кроме того, авторы избегают вопроса о ролизаряженных остатков на концевых участках пептидов (Im et al., 2003), В данной работе предлагается метод моделировапия а-спиральных димерныхкомплексов в мембранном окружении, основанный на поиске наиболее энергетическивыгодных состояний системы «спираль-спираль-мембрана» методом Монте-Карло (МК).Важно отметить, что вычисления проводятся без применения каких-либо ограничений. Метод МК позволяет эффективно исследовать конформационные возможностиполипептидной цепи небольшой системы, состоящей из двух а-спиральпых сегментов. Ключевым моментом в предлагаемой методике является применение модели неявнозаданной мембраны, основанной на совместном использовапии атомных параметровсольватации для воды и углеводородов, описывающих гидратированные полярные группыи ацильные цени линндов, соответственно (Efremov et al, 2001). Данная модель обладаетвысокой вычислительной эффективностью и хорошо себя зарекомендовала при описанииосновных особенностей взаимодействия белок-мембрана. Так, применение МК метода всовокупности с неявно заданной моделью мембраны нозволило адекватно описатьособенности взаимодействия целого ряда пептидов и белков с различным типом укладкиполипептидной цепи (а-спиральные, ри а/р-структурные) и с различным характеромсвязывания с мембраной (ТМ, периферические).Работа состоит из трех частей. В первой рассматривается, каким образом окружениес разными характеристиками влияет на ассоциацию белковых субъединиц. Вторая частьпосвящена описанию результатов моделирования структуры димера GpA в гетерогенноммембранном окружении и сравнению результатов расчетов с известнымиэкспериментальными данными. Сделан вывод о том, что разработанный нодход позволяетадекватно онисать структуру димера GpA в мембрано-подобном окружении. В третьейчасти ноказано применение разработанной методики для изучения возможных механизмовдимеризации ТМ сегмента белка BNIP3, нространственная структура которого еще неустановлена. Полученные модели комплексов хорошо согласуются с данными мутагенеза. Научная новизна. В ходе выполнения работы был впервые создан комнлекс новых вычислительныхметодик и компьютерных программ, позволяющих нолучать информацию о структуребелок-белковых комнлексов в линидном бислое. Кроме того, применение разработанныхоригинальных подходов к апализу димерных структур помогло установить ряд факторов изакономерностей, имеющих фундаментальное значение для попимания особенностейдимерной организации и функционирования белков. Среди них: механизм взаимодействияТМ а-спиральпых пептидов, взаимосвязь между гидрофобной/гидрофильной организациейпептидов и их укладкой в димере, физические принципы встраивания а-сниральныхпептидов в мембранное окружение, энергетические аспекты димеризации в «бислое» и др. Основные результаты.1. Исследована роль гетерогенного, полярпо-неполярного, растворителя примоделировании белок-белковых взаимодействий. Выводы: а) Моделирование без учетаэффектов среды не позволяет корректно описать поведение двух ТМ а-сниралей GpAб) Присутствие второго пептида при расчете МК двух мономеров GpA в «вакууме"стабилизирует а-спиральную структуру мономеров за счет ван-дер-ваальсовыхвзаимодействий. Однако полученные конформации димерных состояний значительноотличаются от установленных в экспериментах. Кроме того, не наблюдаетсяспецифичности межспиральных контактов.2. Исследованы механизмы ассоциации пептидов в гетерогенном мембранномокружении. Выводы: а) Моделирование пептидов GpA в мембране без приложенного ТМпотенциала показало, что пептиды, сохраняя а-спиральную структуру, располагаются вТМ положении, образуя димеры как в ориентации «голова к хвосту», так и в ориентации"голова к голове». Найдена только одна группа структур с антипараллельной ориентациейпептидов хорошо коррелирующая с данными мутагенеза (GpAMKti) — б) При расчете сразной толщиной мембраны наблюдается эффект подстройки димера GpAMKti подтолщину гидрофобного слоя без нарушения межспиральных контактовв) Субъединицы вкомплексах обладают а-спиральной структурой при толщине мембраны D < ЗбА, придальнейшем увеличении толщины наблюдаются нарушения а-сниральной конформации.3. Димеры GpA в мембране с приложенным потенциалом. Выводы: а) Пептиды, сохрапяя а-спиральпую копформацию, встраиваются в мембрану в ТМ положении иобразуют димеры в ориентации «голова к голове" — б) Конформации низкоэнергетическихсостояний хорошо согласуются с данными мутагенезав) найдена группа состояний справой закруткой, по параметрам упаковки близкая к экспериментально установленнойдимерной структуре ((ЗрАямрУ, г) Наблюдается группа плотно унакованных димерныхструктур с левой закруткой, также хорошо согласующаяся с данными мутагенеза иудовлетворяющая ограничениям на расстояния, получеппым методом спектроскопииЯМР (MacKenzie et al., 1997) — д) Исследованы энергетические аспекты встраивания аспиралей в мембрану и их олигомеризации, проведен анализ особенностей образованиялевои нравозакрученных димерных упаковок, рассмотрено влияние мутаций на упаковкудимера и т. д. Таким образом, впервые предложена методика моделирования днмерныхкомплексов в мембранном окружении.4. Разработанная методика применена для моделирования димера с неизвестнойпространственной структурой — ТМ сегмента белка BNIP3. Выводы: а) АЬ initio поискнизкоэнергетических состояний выявил несколько возможных грунн димерных состоянийкак с правой, так и с левой закруткой. Наблюдается высокая корреляция с даннымимутагенезаб) Сделан вывод о роли состояния ионизации остатка Hisi73 в ассоциации аспиралейв) Предложены мутантные формы BNIP3 с потенциально более высокой, чем вбелке дикого тина, димеризационной способностью.
Выводы:
1. Моделирование без учета мембранного окружения не позволяет корректно описать поведение ТМ a-спиралей GpA. Так, полученные конформации димерных состояний значительно отличаются от установленных в экспериментах. Не наблюдается специфичности в образовании межспиральных контактов.
2. Исследовано влияние гетерогенного окружения с разными характеристиками на ассоциацию ТМ сегментов GpA. Показано, что образование димерных комплексов, хорошо согласующихся с экспериментальными данными, возможно при следующих условиях: 1) толщина гидрофобной части мембраны должна примерно соответствовать длине гидрофобного участка мономера GpA 32A) — 2) необходим учет ТМ потенциала мембраны- 3) свойства липидного бислоя наилучшим образом аппроксимируются моделью среды «вода-циклогексан-вода».
3. На основании результатов моделирования предложены две модели пространственной структуры димера ТМ сегмента белка BNIP3. Полученные модели хорошо согласуются с данными мутагенеза.
4. На основании анализа гидрофобных/гидрофильных характеристик ТМ сегментов GpA/BNIP3 и расчетов МК предложены мутантные формы ТМ пептида BNIP3, потенциально, обладающие улучшенной димеризационной способностью. Апробация мутантных форм будет осуществлена экспериментально в нашей Лаборатории.
IV. 2. Научно-практическое значение работы.
Представленные в работе результаты дополняют существующие представления о молекулярных механизмах ассоциации белков в мембранном окружении и позволяют лучше понять основные факторы, способствующие образованию ТМ димерных комплексов.
Разработанная методика позволяет предсказывать пространственную структуру а-спиральных димерных комплексов в мембранном окружении и выявлять особенности спираль-спирального взаимодействия в мембранном окружении. В частности, созданный подход дает возможность идентифицировать а.к. остатки, важные для димеризации. Полученные результаты помогут создавать de novo пептиды, обладающие (или, наоборот, не обладающие) высокой аффинностью друг к другу, либо к заданным пептидам-мишеням.
IV. 3. Перспективы.
Основываясь на результатах выполненной работы и анализе литературных данных, можно обозначить направления дальнейших исследований и сформулировать перспективные задачи в области молекулярного моделирования олигомерных комплексов в мембранном окружении.
1) Поскольку димеризация пептидов и белков в мембране окружении играет важную роль при передаче сигнала в клетке, в настоящее время ведутся активные исследования механизмов олигомеризации с целью последующего целенаправленного управления процессами ассоциации ТМ белковых фрагментов. Существенную помощь в понимании функционирования таких систем могут оказать методы, позволяющие предсказать возможные типы белок-белковых взаимодействий между белковыми субъединицами, а также проектировать мутантные формы белков, обладающие улучшенной димеризационной способностью. Поскольку функционирование целого ряда рецепторов сопровождается значительными конформационными перестройками, представляется чрезвычайно важным понять энергетические аспекты таких процессов и исследовать их in silico. Также, с фундаментальной точки зрения представляется важным научиться оценивать свободную энергию ассоциации пептидов в модельном мембранном окружении — это даст возможность сравнения степени димеризации различных природных и искусственных ТМ сегментов.
2) Дальнейшее совершенствование моделей сольватации с явно и неявно заданным бислоем. В первом случае основное внимание, по-видимому, будет уделяться уточнению параметров силовых полей, описывающих ван-дер-ваальсовы и электростатические взаимодействия, проблемам совместимости силовых полей, отработанных по-отдельности для «чистых бислоев» и изолированных белков. Во втором случае большое внимание будет уделено разработке дополнительных термов в выражении для потенциальной энергии, которые позволят учесть в процессах взаимодействия белок — мембрана роль таких важных явлений, как влияние внешнего электрического поля (например, при деполяризации мембраны), упругие свойства мембраны, «отклик» липидного бислоя и процессы его дестабилизации при встраивании пептидов и белков и т. д.
ГЛАВА V. Методы.
V. 1. Вычислительные протоколы.
Объект исследования: ТМ сегмент гликофорина, А человека.
Расчеты проводили для ТМ сегмента гликофорина, А человека из мембран эритроцитов. Аминокислотная последовательность: 86 у.е.РЕ1ТШРСУМАОУ1СТ1Ь 1Л5УС11Ш97. Стартовую структуру каждого мономера (А и Б) задавали в а-спиральной конформации, в полноатомном представлении. В расчетах не применяли каких-либо ограничений для поддержания а-спиральной структуры и задания положения пептидов относительно мембраны.
А В 1) Л//УУ/УУ/Ч () 2).
Рис.У.1 А) Модель объекта для работы в пространстве двугранных углов. Цилиндры обозначают а-спиральные участки мономеров ТМ сегментов гликофорина А. В) Геометрические параметры, использованные для характеристики взаимного расположения мономеров в димере: 0 — угол, с1 — расстояние между осями а-спиралей. Пояснения см. в тексте.
С целью изменения в ходе МК-процедуры ориентации пептидов как друг относительно друга, так и относительно бислоя, к И-концу мономера, А были присоединены 10 «фиктивных» остатков, а между мономерами, А и Б введены 20 «фиктивных» остатков (Рис. V.1). Атомы данных остатков имели нулевые параметры силового поля, поэтому не давали вклад в энергию системы. Атом N в первом «фиктивном» остатке помещали в начало системы координат (0, 0, 0). Стартовые конформации системы задавали случайным образом: в водном и в мембранном окружении, а также с частичным погружением в мембрану (Рис. Ш. З).
Исследование конформационного пространства методом Монте-Карло.
Исследование поверхности потенциальной энергии пептидов осуществляли методом МК в пространстве двугранных углов с помощью программы FANMEM (усовершенствованная авторами версия программы FANTOM (von Freyberg and Braun, 1991)). Цель — поиск и последующий анализ наиболее низкоэнергетических состояний системы — структура и взаимное расположение мономеров, их ориентация относительно мембраны, белок-белковые и белок-мембранные взаимодействия. Предварительно структуры подвергали энергетической минимизации: 80−150 циклов методом сопряженных градиентов. Отбор конформеров на каждом шаге МК осуществляли по критерию Метрополиса (Metropolis et al., 1953). Вычисления проводили без наложения каких-либо ограничений, если это не оговорено особо. Выбор варьируемых двугранных углов производили случайным образом (варьировали 1−2 угла), минимизацию на каждом цикле МК осуществляли методом сопряженных градиентов. В качестве начального состояния при каждом запуске программы FANMEM брали наиболее низкоэнергетический конформер, полученный в предыдущем расчете. В «вакууме» было проведено ~2−10 и 4−104 МКитераций для одиночного мономера и двух субъединиц, соответственно. Для эффективного преодоления локальных минимумов использовали схему с подстройкой температуры, аналогично (von Freyberg & Braun, 1991). При вычислении нековалентных взаимодействий использовали сферическую отсечку с радиусом 30 А. В методе МК углы, а не варьировали (за исключением углов, а «фиктивных» остатков). Для учета гетерогенной мембранной среды использовали модель неявно заданной мембраны, описанной ранее (Efremov et al., 2001/2002а). Расчеты проводили при различной толщине мембраны (D): 24, 30, 34, 36, 40 А. Для каждого значения D выполняли по ~ 6−104 шагов МК. Остальные детали расчета можно найти в работе (Efremov et al., 1999а).