В настоящее время не вызывает сомнений, что в патогенезе большинства гематологических заболеваний основную роль играют так называемые химерные гены, получающиеся путем генетических аберраций (транслокаций, инверсий, делеций и т. д.) (Johansson В. et al., 2003). Гены, сформировавшиеся при этих транслокациях, кодируют не характерные для данного типа клеток белки, которые либо инициируют реакции, предотвращающие апоптоз клетки либо изменяют рецепторный репертуар клетки. Кроме того, существует большая группа транслокаций, патогенетическое значение которых не определено, но известно, что они являются маркерами для некоторых патологических процессов. <
С точки зрения лабораторной диагностики гематологических заболеваний, данные генетические перестройки являются высокоспецифическими маркерами течения патологического процесса. Исследования данных маркеров как качественные, так и количественные могут служить одним из основных диагностических и прогностических критериев. Кроме того, разработка высокочувствительных методов выявления генетических перестроек является основой для определения минимальной остаточной болезни. Минимальная остаточная болезнь (МОБ) — это состояние персистенции небольшого количества клеток лейкозного клона в организме больного. Мониторные исследования количества трансформированных клеток позволяют корректировать проводимую терапию, что в свою очередь позволяет снизить частоту рецидивов путем коррекции проводимой терапии (Colombat М. et al., 2006; Ecket С. et al., 2000).
Одним из наиболее клинически значимых генетических нарушений при хроническом миелолейкозе (XMJI) является транслокация bcr-abl (филадельфийская хромосома), которая встречается в 95% случаях (0е Klein et al., 1986). Точки разрыва при данной транслокации находятся в гене аЫ хромосомы 9 и в области гена bcr хромосомы 22. Транслокация приводит к образованию химерного гена bcr-abl. В зависимости от положения точек разрыва на 22 хромосоме, различают несколько типов транслокации — Ь3а2, Ь2а2, ela2 (Biernaux С. et al., 1993; Van Dongen et al., 1996).
Стандартная диагностика XMJI направлена на определение непосредственно транслокации t (9−22) при помощи цитогенетического метода и метода FISH и определение транскриптата химерного гена BCR-ABL с использованием молекулярно-генетических методов. Однако в ряде случаев для постановки диагноза стандартных методов диагностики бывает недостаточно. Это характерно для больных, у которых количество опухолевых клеток столь мало, что оно находится ниже уровня разрешения используемых диагностических методик. Такие состояния могут возникать у больных после проведения химиотерапии. Также существуют такие течения XMJI, при которых BCR-ABL может не определяться. В этих случаях стандартная диагностика не может применяться вследствие отсутствия объекта для поиска. Исходя из вышеперечисленных данных, становится очевидно, что для диагностики XMJI помимо стандартных методик требуются дополнительные методы диагностики.
Цель работы. Разработка информативной системы для подтверждающей диагностики и мониторинга хронического миелолейкоза с целью определения минимальной остаточной болезни на фоне использования различных методов терапии.
Задачи исследования.
1. Разработать протокол для качественной и полуколичественной (автоматизированной) оценки вариантов транслокаций 1:(9−22) у больных ХМЛ;
2. Изучить клиническую значимость определения клональных реаранжировок Т-клеточного рецептора у больных ХМЛ;
3. Изучить активность субъединицы теломеразы ЬТЕЯТ у больных ХМЛ;
4. Изучить чувствительность больных ХМЛ к химиотерапии;
5. Разработать единый протокол молекулярно-генетического обследования пациентов с ХМЛ на минимальную остаточную болезнь. I.
Научная новизна.
Впервые проведена оценка состояния опухолевого клона у больных хроническим миелолейкозом методом, включающим в себя методику определения реаранжировок Т-клеточного рецептора и методику определения активности субъединицы ЬТЕЯТ фермента теломеразы. Также проведена сравнительная оценка данных методик со стандартными методами диагностики.
Впервые даны практические рекомендации для мониторинга ВСЯ-АВЬ-негативных больных ХМЛ. Данные рекомендации включают в себя полную схему обследования больных ХМЛ, начиная с момента постановки диагноза и далее, для наблюдения за изменениями молекулярно-генетических показателей в динамике.
Практическая значимость. Предложен для клинической практики протокол обследования BCR-ABL-негативных больных XMJI, включающий в себя как стандартные, так и дополнительные методы диагностики.
Апробация результатов исследования. Материалы диссертации изложены на IV Симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2005), 31я Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Прага, 2005), конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2005), 1ой Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология"(Санкт-Петербург, 2005), 16 Wilsede Meeting «Modern trends in human leukemia» (Wilsede, 2005), 32^ Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation (Гамбург, 2006).
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в иностранных журналах.
Основные положения, выносимые на защиту. *.
1. Моноклональные реаранжировки Т-клеточного рецептора у больных XMJI не является редкостью и отражают степень вовлеченности лимфоидного ростка в патогенез XMJI. Несмотря на отсутствие прямых статистических корреляций между наличием или отсутствием BCR-ABL и «моно-» или поликлональностью Т-клеточного рецептора гамма-дельта, последний может использоваться в качестве дополнительного критерия оценки состояния опухолевого клона у BCR-ABLнегативных пациентов.
2. Повышенная теломеразная активность (экспрессия мРНК субъединицы hTERT теломеразы) может сохраняться на фоне проводимой терапии, указывая на минимальную остаточную болезнь или на устойчивость к некоторым химиопрепаратам. Повышение теломеразной активности, особенно в посттрансплантационном периоде, как правило связано с прогрессированием основного заболевания.
3. У больных ХМЛ на фоне терапии Гливеком в стандартной дозировке в 43% случаев выявляются признаки минимальной остаточной болезни. Последнее может указывать на один из механизмов резистентности к данному препарату.
4. Единый протокол молекулярно-генетического обследования больных ХМЛ, включающий динамическое наблюдение за изменчивостью специфических (ВСЯ-АВЬ) и опосредованных показателей (теломеразная активность и реаранжировки ТКР) с учетом особенностей клинической картины применим у больных ХМЛ. г,.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 96 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания используемых в работе материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения и выводов. Библиография включает 94 источников литературы, из которых 13 отечественных и 81 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 рисунками и 13 таблицами.
ВЫВОДЫ.
1. Встречаемость варианта Ь3а2 транслокации 1(9−22) у больных ХМЛ выше, чем других вариантов (51,7%). Встречаемость варианта е1а2 минимальна (1,3%). В хроническую фазу у 28,6% пациентов ген ВСЯ-АВЬ не выявлялся. В фазу акселерации и фазу бластного криза у 100% обследованных определялось наличие транскриптата химерного гена ВСЯ-АВЬ;
2. На фоне монотерапии Гливеком (400 мгсут) у 43% пациентов, находившихся в хронической фазе, сохранялось наличие гена ВСЯ-АВЬ, что отражает состояние минимальной остаточной болезни.
3. Монотерапия Гливеком в дозе 400 мг в сутки приводит к снижению количества ВСЯ-АВЬ позитивных клеток у больных ХМЛ и уменьшает экспрессию мРНК гена ЬТЕЯТ. $.
4. Уровень экспрессии мРНК гена ЬТЕЯТ был достоверно повышен у пациентов с ВСЯ-АВЬ по сравнению с группой здоровых’доноров (р=0,045) и группой пациентов без ВСЯ-АВЬ (р=0,032).
5. Уровень экспрессии мРНК гена ЬТЕЯТ у пациентов без ВСЯ-АВЬ был ниже, чем в группе здоровых доноров, однако данные различия были не достоверны (р=0,68).
6. Явление моноклональности Т-клеточного рецептора гамма-дельта определялось у больных ХМЛ вне зависимости от клинической картины заболевания.
7. При восстановлении гемопоэза на раннем этапе постТСГК-периода моноклональные реаранжировки ТКР появлялись с отсрочкой на 10−12 дней после появления ВСЯ-АВЬ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
Типирование вариантов транслокации у больных ХМЛ целесообразно только на этапе первичной диагностики. Впоследствии можно осуществлять мониторинг МОБ при помощи консенсусных праймеров.
Для повышении объективности исследования в условиях цитопении после проведения курса химиотерапии и особенно для детекции МОБ необходимо использовать полуколичественный протокол (Ь1§ Ь1Сус1ег).
Детекция клональных реаранжировок Т-клеточного рецептора показана как дополнительный диагностический инструмент, подтверждающий вовлеченность лимфоидного ростка в патогенез ХМЛ и для прогнозирования развития бластного криза по лимфоидному типу.
Детекция и мониторинг экспрессии гена ЬТЕЯТ теломеразы, отражающие активность патологического процесса, должны проводиться как на фоне монотерапии Гливеком, так и в процессе ТСГК. |.
Исследование клональных реаранжировок Т-клеточного рецептора и мониторинг экспрессии гена ЬТЕЯТ теломеразы могут служить самостоятельными методами мониторинга МОБ у пациентов с ХМЛ.
