Исследование и оптимизация трансфекции, транспорта макромолекул и цитотоксичности, вызванных воздействием ультразвука и электрического поля на клетки и ткани

Адресная доставка лекарственных препаратов в органы, ткани и клетки человека является актуальной задачей, стоящей перед современной медициной. В человеческом организме существует множество малопроницаемых барьеров, препятствующих доставке макромолекул. Существующие способы химической и биологической модификации препаратов с целью улучшения их доставки обладают серьезными ограничениями, такими как возникновение побочных эффектов и иммунной реакции организма. В качестве альтернативных подходов к облегчению транспорта макромолекул и трансфекции клеток ДНК были предложены электропорация и ультразвук.

Было показано, что обработка клеток и тканей ультразвуком высокой интенсивности способна на некоторое время повышать эффективность транспорта макромолекул и ДНК внутрь клеток. Известно, что ультразвук с высокой точностью можно сфокусировать практически в любой точке человеческого организма и, таким образом, обеспечить высокую селективность воздействия.

Было обнаружено, что при приложении миллисекундных электрических импульсов высокого напряжения к клеткам и тканям (500−1000 В/см) можно обратимо повысить проницаемость клеточных мембран. В последнее время было также показано, что импульсная обработка кожи человека повышает ее проницаемость для макромолекул.

Целью настоящей работы является экспериментальное и теоретическое исследование транспорта макромолекул в клетки (клетки рака простаты БШ45) и ткани (кожа человека) под действием электрического поля и ультразвуковойобработкивыявление механизмов воздействия используемых физических методов на клетки и ткани, а также оптимизация их применения.

Для выполнения поставленной цели было произведено исследование влияния физических и химических параметров на эффективность трансфекции и цитотоксичность при ультразвуковом облучении суспензии клеток, а также определены оптимальные параметры для достижения максимальной трансфекции и минимальной цитотоксичности.

Было также произведено сравнение эффективности трансфекции при ультразвуковом облучении и электропорации. В данном исследовании в качестве промежуточного контроля использовалось измерение количества ДНК, доставленной в клетки.

В диссертации было впервые произведено исследование обратимых повреждений, вызванных в клетках ультразвуком. Скорость залечивания клеточной мембраны была охарактеризована с использованием экспериментов по заполнению клеток макромолекулами разного размера. При этом флюоресцентные молекулы добавлялись через определенные интервалы времени после окончания ультразвукового воздействия. С помощью математической модели удалось охарактеризовать размер и распределение пор, возникающих под действием ультразвука на клеточной мембране.

В данной работе также разработана модель транспорта макромолекул (кальцеина) в роговом слое кожи человека (stratum corneum) при приложении электрических импульсов высокого напряжения. Эта модель является первой теоретической моделью, показывающей, что электропорация липидных мультислоев в роговом слое коже позволяет объяснить экспериментальнонаблюдаемый обратимый рост проницаемости кожи при импульсной электрической обработке.4мЛитературный обзорПроблема доставки лекарственных препаратовТехнологии доставки лекарственных препаратов, которые позволяютлекарственным средствам попадать контролируемым способом в определенноеместо организма, в настоящее время становятся одним из наиболее динамичноразвивающихся разделов фармацевтической науки. Медицинская ифармацевтическая промышленность формирует возрастающий спрос наподобные технологии. Согласно современным экономическим прогнозам общаявыручка от продаж средств доставки лекарств к 2010 году будет составлять до/20% от всей выручки фармацевтической промышленности (эта доля составила 6% в 2000 году) ((Виге!, 2000)). Согласно другим исследованиям, около 13% мирового фармацевтического рынка уже занято препаратами, содержащими ту или иную технологию их доставки в организм (Ьееиу, и др. 2000). Исследователи выделяют три основных причины для подобного роста. Во-первых, новые средства доставки лекарств могут позволить выйти на рынок новому поколению терапевтических препаратов, которые отличаются более высокой эффективностью и селективностью по сравнению с ныне используемыми средствами. Во-вторых, использование новых патентованных средств доставки может позволить эффективно продлить патенты на уже используемые препараты. В-третьих, это позволяет более эффективно использовать уже разработанные и используемые препараты, а также сократить расходы на разработку. Новые технологии доставки лекарств должны быть способны безопасно и эффективно преодолевать естественные барьеры организма, с высокой селективностью направлять лекарственные препараты вклетки и ткани, нуждающиеся в них, а также минимизировать неспецифичную доставку. Также необходимо контролировать скорость введения лекарства в организм.

Наибольшие трудности для разработки технологий введения лекарств в организм составляет множество естественных барьеров в организме. Эти препятствия можно в целом разделить на две группы: внешние и внутренние. Внешние барьеры включают кожу, которая препятствует транспорту большинства лекарственных веществ, и ткани, омываемые потоком жидкостей и слизей, которые блокируют проникновение веществ в организм (например, ротовая полость, легкие, носоглотка, ушные раковины и желудочно-кишечный тракт). Внутренние барьеры включают систему биохимических преобразований веществ в печени, которая эффективно разрушает лекарственные вещества, иммунную систему организма, а также физические внутренние барьеры, представленные внешними мембранами клеток, межклеточными контактами и специализированными тканями (эпидермис, гематоэнцефалический барьер и т. д.). Показано, что система барьеров человеческого организма делает невозможной доставку абсолютного большинства терапевтических препаратов молекулярной массой больше, чем несколько сотен дальтон.

Одними из наиболее распространенных способов доставки лекарств являются внутримышечная и внутривенная инъекция. Однако, процедура инъекции отличается болезненностью и недостатком специфичности. Иные существующие методы доставки можно классифицировать как химические, биологические, электрические и механические.

Химический подход заключается в модификации структуры лекарственного вещества путем комплексования, связывания с молекулярнымигидами, упаковки в липидные бислои или липосомы (Zelphati и Szoka, 1996), или компенсации поверхностного заряда (Tomlinson и Rolland, 1996). Воздействуя на размер, гидрофильность и поверхностный заряд лекарственных веществ, удается воздействовать на их распределение в организме, скорость их деградации, фармакологическую кинетику и иммунный ответ (Langer, 1990). Однако, метод химической модификации необходимо подбирать индивидуально для каждого лекарственного препарата. Химическая модификация может вызывать нежелательные побочные явления, а также сильно удорожает стоимость разработки новых лекарств.

Наиболее известная стратегия биологической модификации заключается в использовании вирусов в качестве носителей терапевтической ДНК (Gunzburg и Salmons, 1995). Однако, этот метод не позволяет контролировать участок генома, на котором происходит внедрение нового гена. Уже показано, что в ряде случаев при использовании вирусной генной терапии вызываются фатальные нарушения функционирования клеток и смерть организма, содержащего такие клетки. В настоящий момент эти обстоятельства полностью исключают возможность применения вирусной генной терапии в медицине.

Электрические методы включают электрофорезис (ионтофорезис), а также электропорацию, которая позволяет создать временные поры в мембране клеток путем приложения коротких импульсов высокого напряжения (Chang и Reese, 1990, Weaver, 1993, Weaver, и др. 1998 Abidor, и др. 1978).

Механические методы заключаются в генерации импульсов давления и скачков температуры в тканях и суспензиях. С этими целями используется короткий лазерный нагрев (Lee, и др. 1996, Lin, и др. 2003), фокусированный импульса давления (литотрипсер) (Fair, 1986), ультразвука, а такженепосредственная механическая стимуляция (Fechheimer, и др. 1987, McNeil, идр. 1984).

УльтразвукЗвуковые волны (разновидностью которых является ультразвук) представляют собой продольные механические колебания распространяющиеся в газовой, жидкой или твердой среде. Для описания распространения звуковой волны в конкретном материале используется понятие акустического импеданса, который, как правило, является функцией частоты звука, и связывает плотность вещества со скоростью звука в нем. Когда звуковая волна проходит через границу раздела двух материалов с разными акустическими импедансами, происходит частичное отражение звукового фронта. Отражение от неоднородностей звукового импеданса, или эхо, интенсивно используется в геофизике, физике моря и медицине. Обработка отраженных сигналов позволяет воссоздать картину отражающей поверхности, что нашло применение в эхо локации, неразрушающем исследовании металлов и УЗИ. Термин ультразвук относится к звуковым колебаниям и волнам с частотой выше 20 кГц, что приблизительно совпадает с пределом слышимости человеческого уха (Woodstock, 1979).

В медицине ультразвук генерируется преимущественно акустическими преобразователями (как правило, пьезоэлектрическими) и литотрипсерами. Преобразователь (трансдьюсер) генерирует механический сигнал на частоте, используемого электрического сигнала. Трансдьюсеры, как правило, нагружают сигналом одной резонансной частоты, чтобы получить максимальную амплитуду излучаемой звуковой волны. Литотрипсеры, напротив, используют короткий электрический или химический разряд, для формирования одногоступенчатого волнового фронта (Bjorno, 1970, Bjorno и Jensen, 1973). Эти методы создания ультразвукового поля активно исследовались и широко применяются в медицине для диагностики (трансдьюсеры) и разрушения камней в почках и печени (литотрипсеры). В настоящее время ведутся исследования и иных способов применения ультразвука. Показано, что высокочастотный ультразвук способен вызвать коагуляцию крови и обеспечить оперативное «заваривание» обширных поверхностных кровоточащих поверхностей внутренних органов для использования в медицине катастроф (Vaezy, и др. 2001). Облучение мозга высокочастотным ультразвуком позволяет ускорить разрушение тромбов, вызывающих инсульт головного мозга, и находит применение в нейрохирургии (Eggers, и др. 2003).

Биологическое воздействие ультразвука на клетки возможно через нагрев, кавитацию пузырьков и синтез химически активных радикалов (Barnett, 1998, Chapelon, и др. 1992). Однако, именно кавитация является основныммеханизмом воздействия ультразвука на клетки (Barnett, 1998, Carstensen, и др. 1993, Ciaravino, и др. 1981).

Акустическая кавитацияТермин «акустическая кавитация» применяется для описания активности пузырьков газа в жидкости, возникающей вследствие приложенного акустического поля ((Apfel, 1997, Young, 1989). Возникновение пузырьков газа в. абсолютно чистой беспримесной жидкости описывается молекулярно-кинетической теорией, согласно которой предел прочности жидкостей определяется молекулярными связями между молекулами (Sirotyuk, 1971). Если руководствоваться этой теорией, то для образования газовых полостей к жидкости необходимо приложить отрицательное давление порядка нескольких десятков тысяч атмосфер. Так теоретический предел прочности для воды составляет порядка 1000 атмосфер (Apfel, 1997). На практике этот предел гораздо ниже, благодаря присутствию неоднородностей. Эти неоднородности действуют как зародыши газовой фазы. Они уменьшают энергетический барьер образования газовой фазы и, следовательно, предел прочности жидкости. Этими неоднородностями могут быть малые частицы пыли, растворенные или попавшие в неоднородности стенки сосуда пузырьки газа. Для экспериментальной проверки теоретических оценок предела прочности жидкости производятся исследования на сверхмалых каплях, так, чтобы вероятность найти каплю без неоднородностей, была выше 50 процентов (Apfel и Holland, 1991). Известно также, что порог амплитуды звуковой волны, при котором возникает кавитация, (кавитационный предел) зависит от частоты ультразвука (Gaertner, 1954, Kuttruf, 1991), вследствие этого энергиянеобходимая для достижения одних и тех же результатов при воздействии на биологические системы меняется с частотой воздействия (Sundaram, и др. 2003).

Для того, чтобы искусственно снизить кавитационный предел в жидкости, в нее добавляются стабилизированные газовые пузырьки. Благодаря модификации поверхности раздела газ-жидкость с помощью специальных молекул, а также использования плохо растворимых в воде газов, удается увеличить время жизни пузырька. Так коммерчески доступные пузырьки Optison размером 1−3 микрона (резонансный размер для частот ультразвука 0.53 МГц) стабильны при физиологических условиях в течение 10 минут. Воздушные пузырыси того же размера нестабильны. В зависимости от давления и температуры окружающей среды они растворяются или увеличиваются в размерах за счет ректификационной диффузии за доли секунды, поэтому вероятность их обнаружения при нормальных условиях чрезвычайно мала. Поведение пузырька в ультразвуковом поле является чрезвычайно сложным, помимо основной гармоники и кратных ей, в спектре колебаний пузырька наблюдаются такие субгармоники как ½ v, 3/2v, 1/3 v, ¼ V при приближении амплитуды звукового возбуждения к критической (Leighton, и др. 1991). Стабилизированные пузырыси под обобщенным названием контрастных агентов производятся фармацевтическими компаниями и используются в диагностических приложениях. Повышенное отражение ультразвука от поверхности раздела газ-жидкость в областях, содержащих контрастный агент улучшает контрастность получаемого с помощью УЗИ изображения (Goldberg, и др. 1994), дополнительное улучшение контрастности можно получить, если вести детектирование сигнала на частоте равной одной второй от той, на которой идет облучение (Shi, и др. 1999). Если же существенно поднятьамплитуду ультразвуковой волны и увеличить длительность воздействия, то нелинейные осцилляции пузырыса приводят к его катастрофическому схлопыванию — инерционной кавитации. При этом в широком диапазоне амплитуды давления ультразвука кавитация в физиологических жидкостях происходит только там, где содержатся контрастные агенты (Apfel и Holland, 1991) Традиционно газовый состав коммерчески доступных пузырьков был воздушным (AlbunexMallinckrodt), последнее время используются иные газы, такие как перфлюорокарбоны, например, октафлюоропропан C3F8 (Optison, Mallinckrodt). Кавитационные агенты, как правило, имеют белковую оболочку (например, взаимосвязанные молекулы сывороточного альбумина), в тоже время производятся коммерчески пузырьки, стабилизированные фосфолипидным монослоем (SonoVue, Вгассо, Италия) или синтетической полимерной оболочкой (Acuscphere, США).

Кавитацию принято классифицировать как инерционную и стационарную (Miller, и др. 1996). При стационарной кавитации, наблюдаемой при низких амплитудах давления, пузырек растет за счет ректификационной диффузии, или сжимается за счет растворения газа вплоть до резонансного размера, а затем осцилирует неограниченно долго. Инерционная кавитация происходит при больших амплитудах давлениях. Она характеризуется быстрым ростом пузырька в фазе отрицательного давления, а затем коллапсом рэлееевского типа, когда инерция сжимающейся жидкости превалирует над давлением газа, препятствующим сжатию. Динамика пузырька в этой фазе описывается решением задачи о схлопывании сферической полости заполненной вакуумом в жидкости (Besant, 1859, Rayleigh, 1917, Ландау и1 в наших экспериментах с частотой 500 кГц биологические эффекты кавитации в жидкостях без кавитационных агентов была по крайней мере на три порядка слабее, чем в их присутствииЛифшиц, 1988). В решении задачи Рэлея скорость стенок пузырька неограниченно растет при сжатии. Для реального пузырька это описание применимо только до момента, когда скорость стенок пузырька достигает скорости звука в жидкости. Экспериментальное и теоретическое исследование кавитационного схлопывания показывает, что локальная температура в момент сжатия достигает 1000−5000 К, а давление в полости — тысяч атмосфер. Коллапс пузырька при схлопывании приводит к возникновению в жидкости локальных потоков с высокими скоростями течения, сдвиговых напряжений, ударных волн. При асимметричном коллапсе происходит генерация микроструй (Apfel, 1997). Среди физических явлений сопровождающих кавитацию необходимо упомянуть сонолюминесценцию, то есть генерацию фотонов видимого света. Механизм люминесценции до сих пор не полностью изучен. Эффекты кавитации могут вызывать повреждение материалов, например, разрушение лопаток турбин, быстро вращающихся в воде. В биологических системах повреждения наносимые мембранам клеток могут быть как необратимыми (Miller и Thomas, 1996), так и обратимыми (Fechheimer, и др. 1987). Оба явления могут быть с пользой использованы на практике. Целью нашего исследования являются обратимые воздействия.

Применения ультразвука для облегчения транспорта лекарственных веществВозможность облегченного транспорта макромолекул в биологических системах, обработанных ультразвуком, была в последнее время подтверждена в многочисленных исследованиях. Saad и Hahn (1989) показали, что облучение ультразвуком 2 МГц увеличивает токсичность адриамицина и амфотерицина в СНО (Chinese hamster ovary) клетках. Было также показано, что воздействиелитотрипсера способно вызывать эффективное увеличение транспорта лекарств в раковые опухоли ((Prat, и др. 1994)). Mitragotri и др. (1995) продемонстрировал возможность транспорта терапевтических доз инсулина, у-интерферона и эритропоэтина через эпителий кожи человека при использовании 20 кГц ультразвука.

Общей механизм облегчения транспорта во всех этих явлениях — порация барьеров (клеточных мембран или поверхностного слоя кожи) вследствие инерционной кавитации (Bao, и др. 1997). Ранее высказывалось предположение, что свободные радикалы, выделяющиеся при кавитации, могут быть ответственны за наблюдаемые разрушения клеточных мембран, однако, последнее время было показано, что воздействие свободных радикалов незначительно (Bamett, 1998).

Разрушение мембран, вследствие образования ударной взрывной волныБыло показано, что ударные волны с амплитудой 10−1000 атмосфер способны вызывать разрушение клеточных мембран (Delius, 1997, 2002, Kodama, и др. 2000). Критические значения амплитуд давления в ударных волнах, по-видимому, зависят в основном от конкретного вида экспериментальной системы (Kodama, и др. 2002, Raeman, и др. 1994, Sonden, и др. 2000). В частности было показано, что одиночной ударной волны с амплитудой всего в 3 атмосферы достаточно, чтобы вызвать обратимое увеличение проницаемости мембран, не вызывая летальных для клеток последствий (Kodama, и др. 2000).

Также экспериментально установлено, что при кавитационном коллапсе в ультразвуковом поле происходит генерация ударных волн с амплитудойдавления в эпицентре до 40−60 тысяч атмосфер (Pecha и Gompf, 2000). Существуют теоретические и экспериментальные способы определения давления внутри коллапсирующего пузырька и амплитуды ударной волны, возникающей при коллапсе. В теоретических моделях адиабатический коллапс пузырька приводит к возникновению давлений свыше 10 000 атмосфер (Vichare, и др. 2000). Однако, провести прямое экспериментальное подтверждение этих предсказаний пока не удалось. В частности это связано с тем, что высокие давления возникают в исключительно узком пространственном и временном интервале (Pecha и Gompf, 2000). Тем не менее, вся совокупность прямых и косвенных измерений процессов в коллапсирующих пузырьках позволяет грубо максимальное давление от 1 000 до 73 000 атмосфер ((Matula, 1999, Pecha и Gompf, 2000, Wang, и др. 1999). Эти всплески давления сопровождаются ударными волнами, распространяющимися сферически симметрично вокруг центра коллапса. Точный механизм воздействия ударной волны на клетки не известен, однако, попытки прояснить этот вопрос продолжаются. В течение последних лет был опубликован теоретический анализ разрушения клеток в ударной волне (Lokhandwalla, и др. 2001b). Авторы этой статьи показывают, что пространственные и временные градиенты давления вызывают повреждения клеточной мембраны. Роль градиентов давления в разрушении мембран подчеркивается и в других работах (Doukas, и др. 1995). Howard и Sturtevant утверждают, что ударные волны вызывают деформацию клеток. Амплитуда деформации пропорциональна времени действия и амплитуде ударной волны (Howard и Sturtevant, 1997). Другая точка зрения, которую отстаивает Kodama и коллеги, состоит в том, что ударная волна приводит к увеличениюпроницаемости мембраны за счет вызова относительного смещения между клеточной мембраной и окружающей ее жидкостью (Kodama, и др. 2000).

Разрушение мембраны, вызванное осцилляциями размера кавитационного пузырькаСдвиговые напряжения, возникающие в жидкости при кавитации, также могут вызывать увеличение проницаемости клеточных мембран (Wu, 2002, Wu, и др. 2002). В статье Lokhandwalla высказано предположение, что радиальное движение стенки пузырька может вызывать деформацию клеток и, как следствие, растяжение клеточных мембран (Lokhandwalla, и др. 2001b). Они приводят некоторые оценки. Так в фазе низкого давления, пузырьки растут от их начального радиуса Ro до радиуса Rmax за время меньшее, чем половина периода акустических колебаний, а затем резко сжимаются в фазе положительного давления. Wu и Roberts оценили, что осциллирующие газовые полости в жидкости облучаемой ультразвуком 26.5 кГц растут до радиуса порядка 37 микрометров приблизительно за 16 микросекунд (от начального радиуса 5 микрон) и схлопываются за время порядка 3 микросекунд (Wu и Roberts, 1993). Таким образом средняя скорость стенки пузырька составляет 2 м/с при расширении и 12 м/с при сжатии. Деформация мембран, вызываемая вклетках в непосредственной близости от осциллирующего пузырька согласно модели ЬокЪапёшаИа составляет¦ААгиьЯ2ь, А г3где иьскорость стенки пузырька, Яьрадиус пузырька, г — расстояние клетки от пузырька и х — время расширения/сжатия соответственно (ЬокЬапсЬуаНа, и др. 2001а). Оценки, приведенные Бипёагат и коллегами, показывают, что на расстоянии меньше чем Г| 60−130 микрометров осцилляции стенки пузырька вызывают необратимые повреждения клеточных мембран, обратимые повреждения возникают при расстояниях от клеток до коллапсирующих пузырьков 107−110% от п.

Поскольку при акте кавитации клетка может погибнуть, получить обратимые повреждения или оказать незатронутой, то для теоретического описания применяют вероятностные модели. Такой вероятностный анализ был произведен для описания смертности и транспорта кальцеина при ультразвуковом облучении на частотах от 20 до 93 кГц линии ЗТЗ клеток мышей и показал статистически достоверное сходство теории и эксперимента (Зипёагат, и др. 2003).

ЭлектропорацияОбратимое повышение проницаемости клеточных мембран в суспензиях клеток может бьггь достигнуто при приложениях к ним коротких (несколько миллисекунд) электрических импульсов высокого напряжения (500−900 В/см). Было показано, что повышение проницаемости достигается, в первую очередь, за счет электропорации липидного бислоя, что, в свою очередь, приводит к созданию новых транспортных путей через клеточные мембраны. Это явлениеинтенсивно изучалось в последние 30 лет (Abidor, и др. 1978, Golzio, и др. 2002, Kinosita и Tsong, 1977, Neumann и Rosenheck, 1972, Rols, и др. 1994, Tsong, 1991, Weaver, 1993). В настоящее время электропорация широко используется для доставки препаратов в клетки и липосомы, а также для трансфекции клеток и интеграции белков в клеточные мембраны (Neumann и др, 1979; Chang и др, 1992). Электропорация также используется для противоопухолевой терапии (Mir и др., 1991; Orlowski и Mir, 1993), а также для трансфекции in vivo (Titomirov и др., 1991). Предполагается, что рост транспорта макромолекул при электропорации связан с образованием пор, созданных электрическим полем. Электрическое поле не только порождает новые транспортные пути, но и создает движущую силу для перемещения заряженных макромолекул (Klenchin, и др. 1991, Sukharev, и др. 1992, Xie и Tsong, 1990).

Использование слабых электрических полей для транспорта лекарственных веществ через кожу (ионтофорез) является хорошо известным методом (Delgado-Charro и Guy, 1994). Увеличение транспорта лекарственных веществ в этом случае вызвано тем, что миграция заряженных молекул в электрическом поле является гораздо более эффективной, чем пассивная диффузия. В диапазоне слабых электрических напряжений (U < 1 В) транспорт линейно зависит от напряжения. Следовательно, нет никаких оснований предполагать, что ионтофорез создает новые транспортные пути (Dinh, и др.

1993). Прямые измерения (Cullander и Guy, 1991, Scott, и др. 1993) показали, что основные пути транспорта при ионтофорезе пролегают через потовые железы и волосяные фолликулы кожи. Ряд авторов признает возможность ионтофоретического транспорта через липидно-корнеоцитный слой Stratum сотеит (Grimnes, 1983, Monteiro-Riviere, и др. 1994). В описанномэксперименте электрическое напряжение 1 вольта) недостаточно велико для электропорации липидных мультислоев рогового слоя, поэтому оно может выступать только в роли движущей силы. Однако, ситуация радикально меняется при росте прикладываемых напряжений. При приложении к коже человека напряжения в несколько вольт его вольтамперная характеристика становится нелинейной (Kasting и Bowman, 1990а, Kasting и Bowman, 1990b). При этих условиях электрический ток выходит на стационар со значительной задержкой по времени, и поведение системы приобретает необратимые черты. Это поведение никак не может быть объяснено на языке линейных уравнений электродиффузии. Теории поверхностно лимитированных стадий транспорта или электропорации возникли для объяснения возникающей нелинейности (Kasting и Bowman, 1990а, Kasting и Bowman, 1990b). Однако, только необратимая электропорация может быть причиной необратимых изменений системы. Также, при объяснении не омического поведения в данных работах не делается никаких предположений о возможных объектах электропорации. Наиболее вероятно, что при напряжении 1 В, только несколько последовательных слоев клеток могут быть порированы. Учитывая, что кожа практически полностью покрыта слоем ороговевших клеток, наиболее вероятно, что порация затрагивает в этом случае только волосяные фолликулы и/или сальные железы. Вероятность электропорации stratum сотеит при этих напряжениях пренебрежимо мала. SC содержит около 100 липидных бислоев. При напряжении на коже в несколько вольт разность электрических потенциалов на отдельном бислое составляет всего —10−100 милливольт. Эта величина недостаточна для пробоя. Термодинамическая теория возникновения пор в липидном бислое под действием электрического поля предложена вработе Глазера с соавторами (1988). Согласно этой теории возникновение пор при электрических полях даже вдвое ниже пробойного напряжения (обычно 200 милливольт на бислой) чрезвычайно мала.

При повышении напряжения на коже до 50 В ситуация разительно меняется. Как было показано Prausnitz и коллегами (1993а, 1993с), после обработки кожи человека in vitro несколькими миллисекундными импульсами высокого напряжения, поток кальцеина через кожу увеличился на несколько порядков величины. Похожие результаты были получены для транспорта метапролола через кожу крыс in vitro (Vanbever, и др. 1994). Более того, даже одного импульса высокого напряжения достаточно для существенного усиления последующего ионтофоретического транспорта (Bommannan, и др. 1994). Мы полагаем, что эти результаты обусловлены созданием новых транспортных путей через SC человека. При данных напряжениях разность потенциалов на каждом бислое более чем достаточна для электропорации. Другим возможным объяснением было бы активация существующих ионтофоретических путей через волосяные фолликулы и сальные железы. Однако, эта гипотеза не способна объяснить наблюдаемые явления, поскольку выстилающие ионтофоретические пути бислои должны испытывать электропорацию при существенно более низких напряжениях (Benz, и др. 1979, Kinosita, и др. 1988).

Выводы.

В данной работе показано, что частота облучения, плотность звуковой энергии, плотность клеток и температура являются факторами, определяющими эффективность трансфекции клеток рака простаты человека (Би 145) при ультразвуковом воздействии. В оптимальных условиях приложение ультразвука вызывает 100 кратный рост трансфекции. Эти условия были достигнуты при облучении суспензии клеток с концентрацией 107 на мл, ультразвуком частотой 500 кГц с потоком звуковой энергии 10−30 Дж/см2 в присутствии кавитационных стабилизированных пузырьков при температуре 37 °C.

Измерение транспорта ДНК при ультразвуковой обработке показало, что в условиях, соответствующих максимальной трансфекции, ДНК удается обнаружить в 21% облученных клеток, при этом среднее количество молекул ДНК, доставленных в клетку, составляет 800 молекул при концентрации ДНК в растворе 20 цг/мл. Сопоставление данных по трансфекции и транспорту ДНК показало, что трансфекция наблюдается только в 20 процентах клеток, в которые ДНК была доставлена при ультразвуковом облучении.

•.

Предложено математическое описание пассивной диффузии макромолекул в клетки, получившие повреждения поверхности. Данный подход позволяет рассчитать характеристики повреждения мембраны, используя данные по кинетике диффузии макромолекул в клетки. Обработка экспериментальных данных с помощью предложенного подхода показала, что при ультразвуковом облучении на поверхности клеток образуется зона повреждения размером порядка 1 микрона, залечивающаяся с характерным временем 20 секунд. Анализ проницаемости поврежденных клеток для пяти макромолекул разного размера показал, что подавляющая часть открытой поверхности закрыта для транспорта молекул радиусом более 15 нм.

Построена модель транспорта макромолекул через кожу человека при электрообработке импульсами высокого напряжения. Модель позволила объяснить экспериментально наблюдаемые явления, исходя из гипотезы об электропорации липидной фазы рогового слоя кожи. Результаты моделирования показывают, что новые транспортные пути, образованные в роговом слое кожи, по всей видимости, проходят через корнеоциты и электропоры в липидных мультислоях.

6.

Заключение

.

Экспериментальное исследование трансфекции ОШ45 клеток (линия рака простаты человека) показало, что путем выбора оптимальных условий трансфекция «свободной» плазмидной ДНК может быть увеличена практически в 100 раз. Увеличение трансфекции наблюдалось как для ультразвука при частоте 24 так и 500 кГц, хотя более высокая частота обработки приводила к более успешной трансфекции. Поток звуковой энергии, который, как было показано в данной работе, является хорошим индикатором силы воздействия ультразвука, коррелирующим как с трансфекцией, так и выживаемостью клеток, приводил к оптимальной трансфекции при значениях 10 — 30 Дж/см2. При этих условиях достигался баланс между уменьшающейся выживаемостью клеток и увеличивающейся порацией клеток, и, следовательно, улучшенному транспорту ДНК при больших энергиях облучения. Мы также обнаружили, что концентрация клеток в суспензии серьезно влияет на эффективность п трансфекции, а лучшие результаты достигаются при концентрации 10 клеток/мл. Полученные данные также свидетельствуют о том, что повышение температуры с 21 до 37 °C существенно повышает трансфекцию, но не оказывает заметного влияния на выживаемость клеток.

Несмотря на то, что при высоких потоках звуковой энергии через суспензию наблюдалось повреждение ДНК, плазмиды ДНК не были повреждены в диапазоне параметров оптимальном для трансфекции. Это, в свою очередь, свидетельствует о том, что полезное воздействие ультразвука на клетки может бьггь достигнуто с использованием акустических энергий ниже порога повреждения молекул ДНК.

Сходство экспериментальных результатов, полученных для двух различных плазмид, дает основание считать, что полученные результаты не являются специфичными только для одного вида плазмидной ДНК, а могут быть распространены на более широкий класс молекул, сходного размера.

Оптимальные условия определенные нами оказались следующими, частота ультразвука 500-кГц, облучение в присутствии кавитационного агента Орйвоп, поток звуковой энергии 10−30 Дж/см2 приложенный к суспензии клеток с концентрацией 10 клеток/мл при температуре 37 °C. Есть все основания полагать, что не только замеченные закономерности, но и определенный нами. диапазон оптимальных параметров применения ультразвука может бьггь использован в оптимизации его применения для трансфекции клеток, тканей, а также клинического применения.

Наши измерения показали, что трансфекция была достигнута только в 25 процентах клеток, в которые ДНК была доставлена с помощью ультразвука. Более пристальное изучение взаимосвязи между доставкой ДНК в клетки и трансфекции показало, что эффективное количество ДНК, необходимое для трансфекции зависит от среднего уровня доставки и ее способа. Так электропорация способна доставить существенно большее количество ДНК, чем ультразвук, однако, ультразвук позволяет достигнуть сравнимой и даже большей трансфекции. Данное явление может являться следствием разнообразных факторов, таких как а) действие внутриклеточной системы инактивации сторонней ДНК, действующей тем эффективнее, чем больше ДНК попадает в клеткуб) возможном существенном повреждении ДНК при электропорациив) меньшей эффективности электропорации по сравнению с ультразвуком в облегчении транспорта ДНК к клеточному ядру. Эти и другие возможные гипотезы подлежат дальнейшему детальному исследованию. Объяснение механизмов столь разного реагирования клеток на одинаковое количество доставленной в них ДНК может объяснить довольно низкую эффективность генной терапии с помощью суспензий чистой ДНК и указать способы повышения эффективности.

В данной работе было произведено исследование размера и кинетики залечивания повреждений клеточных мембран при ультразвуковом облучении. Для определения степени через определенное время после окончания обработки повреждения мембраны к суспензии клеток добавлялись флюоресцентные маркеры. Измерение транспорта макромолекул из внешней среды в цитоплазму клеток позволило оценить степень проницаемости клеточной оболочки в зависимости от размера тестовой молекулы и времени, прошедшего после облучения. В данной работе предложено математическое описание пассивной диффузии макромолекул в клетки, получившие повреждения поверхности. Данный подход позволяет рассчитать характеристики повреждения мембраны, используя данные о скорости диффузии макромолекул в клетки. Обработка экспериментальных данных с помощью предложенного подхода показала, что при ультразвуковом облучении на поверхности клеток образуется зона повреждения размером порядка 1 микрона, залечивающаяся с характерным временем 20 секунд. Анализ проницаемости поврежденных клеток для пяти макромолекул разного размера показал, что подавляющая часть открытой поверхности недоступна для транспорта молекул радиусом более 15 нм.

В данной работе была разработана модель транспорта молекул кальцеина через роговой слой кожи, подвергшейся обработки импульсами электрического напряжения. Модель транспорта макромолекул через 51га1шп согпешп при электропорации кожи человека позволила объяснить наблюдаемые явления нелинейного роста транспорта кальцеина. При построении модели были предложены два возможных пути транспорта (прямой путь через корнеоциты и извилистый путь через липидную фазу). Из сравнения расчетных значений с экспериментально наблюдаемыми следует, что прямой путь является более вероятным. Прямой путь может проходит в обход корнеоцитов или через корнеоциты в зонах, повышенной проводимости. По нашим оценкам доля гидрофильная область, участвующая в транспорте, составляет примерно 1% объема SC.

Разработанная' модель позволила показать, что транспорт макромолекул через кожу при импульсной электрообработке объясняется электропорацией липидно-корнеоцитного матрикса. После публикации данной модели был получен ряд интересных результатов, которые подтвердили основные положения и выводы модели. Так измерения электрического тока через кожу при умеренных напряжениях (до 30 В) показали возможность электропорации макропор кожных придатков, а при больших напряжениях подтверждают нашу гипотезой об электропорации липидно-корнеоцитного матрикса (Chizmadzhev и др., 1998). Экспериментальные наблюдения также показали, что при приложении импульсов высокого напряжения на слое SC проводимость растет не гомогенно, а в случайно расположенных «зонах повышенной проводимости». Было показано, что появление этих зон вызвано электропорацией, а также предложены стохастические и детерминистические модели их появления (Weaver и др., 1999). В других экспериментах было показано, что при приложении к коже электрических импульсов длительностью 100 миллисекунд напряжением 300 В джоулево тепло, выделяющиеся при прохождении тока через электропоры, вызывает фазовый переход в липидной фазе, вследствие чего проводимости кожи необратимо растет (Pliquett и Gusbeth, 2000).