Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a

Диссертация: Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Существует стандартный подход к культивированию штаммов-продуцентов BL21(DE3), при котором индуктором синтеза является ИПТГ (изопропил-|3−0−1-тиогалактопиранозид). Этот подход может применяться для тестирования штаммов в процессе разработки, но для использования в промышленности он малоэффективен — из-за низкого выхода продукта при такой схеме культивирования и высокой стоимости ИПТГ. Для… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Семейство белков человеческого интерферона альфа
    • 1. 2. Влияние наличия N-концевого метионина в молекуле интерферона 17 альфа-2 на свойства белка
    • 1. 3. Существующие в настоящее время способы получения интерферона 19 альфа
    • 1. 4. Современные требования к параметрам качества субстанции интерфе- 23 рона альфа
    • 1. 5. Способы получения интерферона без N-концевого метионина в Е. col
    • 1. 6. Технология получения рекомбинатных белков в Е. col
    • 1. 7. Обеспечение безопасности получаемого препарата для пациента
  • 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
    • 2. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
      • 2. 2. 1. Разработка технологии производства безметионинового интерферона альфа
        • 2. 2. 1. 1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 48 фа
        • 2. 2. 1. 2. Исследование влияния замены редко встречающихся в Е. coli ами- 53 нокислотных кодонов на уровень экспрессии гена интерферона альфа-2Ь человека в системе транскрипции бактериофага Т
        • 2. 2. 1. 3. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб- 59 ридного белка интерферона альфа
        • 2. 2. 1. 3. 1. Подбор оптимального состава культуральной среды
        • 2. 2. 1. 3. 2.Азотсодержащий компонент
        • 2. 2. 1. 3. 3. Минеральные соли
        • 2. 2. 1. 3. 4. Факторы роста
        • 2. 2. 1. 3. 5. Состав питательной среды для культивирования штамма ЕСЫ- 74 Ш1-Т
        • 2. 2. 1. 3. 6. Подбор оптимальных условий культивирования
        • 2. 2. 1. 3. 7.Подбор схемы получения инокулята
        • 2. 2. 1. 3. 8. Углеродсодержащие субстраты и индуктор
        • 2. 2. 1. 3. 9. Проведение установочных серий процесса культивирования в 105 объеме 30 л
        • 2. 2. 1. 4. Разработка процесса выделения и очистки тел включений гибрид- 106 ного белка интерферона альфа
        • 2. 2. 1. 4. 1. Подбор оптимальных условий процесса выделения и очистки телец включений
        • 2. 2. 1. 5. Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка
        • 2. 2. 1. 6. Очистка субстанции человеческого рекомбинантного безметионинового интерферона альфа
        • 2. 2. 1. 7. Исследование полученного человеческого рекомбинантного альфа
  • 2. Ь безметионинового интерферона методом автоматического N-концевого секвенирования
    • 2. 2. 1. 8. Определение подлинности человеческого рекомбинантного безме- 128 тионинового интерферона альфа-2Ь методом пептидного картирования в сравнении с Европейским стандартным образцом
      • 2. 2. 1. 9. Технологическая схема
      • 2. 2. 1. 10. Валидация технологического процесса производства человече- 140 ского рекомбинантного безметионинового интерферона альфа
      • 2. 2. 1. 12. Экономическая эффективность процесса
      • 2. 2. 1. 13. Перенос технологии на производственную площадку ООО «Фармапарк»
      • 2. 2. 2. Разработка технологии производства безметионинового интерферо- 152 на альфа-2а
      • 2. 2. 2. 1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 153 фа-2а
      • 2. 2. 2. 2. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб- 155 ридного белка интерферона альфа-2а

Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность темы

Повышение эффективности отечественного биофармацевтического производства, ликвидация технологического отставания отечественной биотехнологии является актуальной проблемой, решение которой связано, в том числе, с коммерциализацией созданных передовых технологий, применением эффективных систем экспрессии рекомбинантных белков и технологий культивирования клеток.

Препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь широко используются как в ветеринарии, так и медицине. В медицине препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь широко используются для лечения социально значимых и тяжелых заболеваний, таких как хронический вирусный гепатит В и С (17, 14, 71, 3), для лечения онкологических болезней, в том числе волосатоклеточного лейкоза, хронического миелолейкоза, неходжкинской лимфомы, меланомы, множественной миеломы, саркомы Капоши на фоне СПИДа, прогрессирующего рака почки и других (12), а также для профилактики гриппа и ОРВИ у взрослых и детей (9). Широкое применение интерферонов альфа-2 связано с их действием на реакции инфекционного и противоопухолевого иммунитета.

Миллионы людей в России используют препараты интерферона альфа-2, в том числе и в длительных курсах лечения. В связи с этим, необходимо, во-первых, обеспечить внутренний рынок России эффективной субстанцией интерферона альфа-2а и альфа-2Ь отечественного производства, во-вторых, создать коммерчески рентабельную технологию производства субстанции, основанную на применении современных высокопродуктивных систем экспрессии рекомбинантных белков и новых технологий культивирования генетически модифицированных бактериальных продуцентов.

Современные требования к качеству субстанции рекомбинантного интерферона альфа-2, изложены в Европейской фармакопее, 7-ой редакции.

Параметры качества субстанции включают в себя аминокислотную последо5 вательность белка, его происхождение, чистоту, физико-химические свойства, активность и стабильность, причем эти параметры должны контролироваться валидированными методиками, методическое описание которых приведено в Европейской фармакопее, 7-ой редакции.

При производстве «биодженерика», которым является и интерферон альфа-2, для обеспечения эффективности и безопасности продукта, необходимо обеспечить его соответствие установленному стандартному образцу. В международной практике, как указано в Европейской фармакопее, в качестве стандарта должен использоваться референсный образец Chemical Reference Substances (CRS) интерферона альфа-2а (CRS 10 320 300) и интерферона альфа-2Ь (CRS 10 320 301), рекомендованный Европейским управлением по качеству лекарственных средств (The European Directorate for the Quality of Medicines).

Только после проведения всех испытаний, доказывающих, что полученный интерферон альфа-2 соответствует стандарту, субстанция интерферона альфа-2 может быть признана эффективной и безопасной. Если же полученный продукт отличается от стандартного образца, по каким либо параметрам, например, по аминокислотной последовательности, трехмерной структуре, наличию примесей, то продукт может обладать сниженной биологической активностью, повышенной иммуногенностью и вызывать непредсказуемые побочные эффекты.

Основной проблемой при производстве рекомбинантного интерферона является удаление из молекулы N-концевого метионина, который образуется при синтезе рекомбинантного белка рибосомой бактериальной клетки и может влиять на иммуногенность и стабильность (S. Hermeling, D.J.A., 2004; M. Kamionka., 2011; Ben-Bassat A., Bauer К.- 1987).

В Европейской фармакопее указано, что молекула рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2 должна состоять из 165 аминокислот, в положении 23 у интерферона альфа-2а находится лизин, у альфа-2Ь — аргинин, N-концевым аминокислотным остатком должен являться цистеин, свя6 занный дисульфидной связью с 98 цистеином белка. Любой рекомбинант-ный интерферон, чья аминокислотная последовательность отличается от указанной, не может считаться «биодженериком», аналогичным стандартным международным образцам, в том числе по биологической активности и безопасности.

Однако синтез любого белка рибосомой бактериальной клетки инициируется АТГ-кодоном, поэтому N-конец любого бактериального белка представлен формилметионином. При эффективной экспрессии рекомбинантных белков в современных экспрессионных системах рекомбинантные белки накапливаются в клетках прокариот в больших количествах. Отщепление фор-милметионина в этом случае идет неэффективно, и рекомбинантный белок содержит дополнительный формилметионин на N-конце молекулы, который может влиять на иммуногенность и стабильность белка (51, 70, 27).

В России на настоящий момент не существует технологии производства отечественной субстанции рекомбинатного человеческого интерферона аль-фа-2а и интерферона альфа-2Ь, удовлетворяющей всем параметрам качества, указанным в Европейской фармакопее, в частности отсутствию N-концевого метионина в молекуле рекомбинантного интерферона альфа-2.

Разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства отечественной субстанции интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих аналогов более низкого качества, является актуальной задачей.

На настоящий момент FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) и ЕМЕА (Европейское агентство по лекарственным средствам) выдали лицензию на применение в фармацевтике более чем 150 рекомбинантных белков (83). Мировые продажи биофармацевтических препаратов на 2010 год оцениваются в 70−80 миллиардов долларов (114). Для производства 30% рекомбинатных фармацевтических белков в качестве штаммов-продуцентов используются бактерии, 7 среди которых самой часто используемой является Е. coli. В современном биотехнологическом производстве широко используются эффективные системы экспрессии рекомбинантных белков на основе генетически модифицированных микроорганизмов, одной из которых является система на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта экспрессионная система широко используется и в научных исследованиях, и в промышленной биотехнологии.

На основе штамма Е. coli BL21(DE3), который является одной из наиболее эффективных систем экспрессии рекомбинантных белков, созданы штаммы-продуценты ряда важнейших фармацевтических продуктов, таких как соматотропин, проинсулин, различные виды интерферонов.

Существует стандартный подход к культивированию штаммов-продуцентов BL21(DE3), при котором индуктором синтеза является ИПТГ (изопропил-|3−0-1-тиогалактопиранозид). Этот подход может применяться для тестирования штаммов в процессе разработки, но для использования в промышленности он малоэффективен — из-за низкого выхода продукта при такой схеме культивирования и высокой стоимости ИПТГ. Для реализации в производстве необходимо разработать высокоэффективную схему культивирования, которая должна обеспечить высокий выход целевого белка и позволить создать коммерчески рентабельную технологию.

Разработка и оптимизация процесса культивирования часто идет эмпе-рическим путем. Создание универсальной технологической схемы процесса культивирования для штаммов-продуцентов, созданных на основе одной экспрессионной системы, позволило бы снизить затраты в процессе фармацевтической разработки.

При широком использовании штаммов-продуцентов на основе разработка такого универсального способа культивирования является актуальной задачей.

Предложенная схема культивирования штаммов-продуцентов на основе штамма-реципиента ВЬ21(ОЕЗ) позволяет применять ее для новых продуктов и оптимизировать уже существующие технологии. При широком использовании штаммов-продуцентов на основе штамма-реципиента ВЬ21(БЕЗ) в современном биотехнологическом производстве разработка такого универсального способа культивирования является актуальной задачей.

Таким образом, разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства субстанции интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, в том числе и разработка высокоэффективной схемы культивирования штаммов-продуцентов и биохимической очистки, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих аналогов более низкого качества является актуальной задачей.

Создание коммерчески рентабельной технологии, обеспечивающей получение отечественной субстанции интерферона альфа-2, препараты которого внесены в Реестр жизненно важных и необходимых лекарственных средств, соответствующей по параметрам качества и безопасности современным требованиям, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка и реализация на практике технологии промышленного производства субстанции интерферона альфа-2Ь и интерферона альфа-2а, соответствующей современным требованиям качества и безопасности, в том числе требованию отсутствия в белке Ы-концевого метионина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать и оптимизировать экспрессионные конструкции гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

2. Разработать универсальную схему культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. соИ ВЕ21(ОЕЗ), дающую высокий выход по биомассе и целевому белку.

3. Разработать способ выделения и очистки телец включений, процесс рена-турации, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков предшественников и схему дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

4. Оценить соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2Ь требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.

5. Провести валидацию и перенос технологического процесса на производственную площадку ООО «Фармапарк».

6. Зарегистрировать субстанцию «Интерферон альфа-2б человеческий ре-комбинантный безметиониновый» и внести ее в Государственный реестр лекарственных средств.

Научная новизна. Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта схема была реализована на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона аль-фа-2Ь и альфа-2а человека.

В ходе работы изучено влияние редко встречающихся в Escherichia coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного белка, ген которого расположен на многокопийном экспрессионном векторе, под контролем регуляторных элементов транскрипции бактериофага Т7.

Изучено влияние способа выделения телец включений на протекание процесса фолдинга белка и предложена схема выделения телец включений, дающая минимальные потери продукта при высоком выходе ренатурирован-ного белка.

Впервые изучена реакция ферментативного гидролиза гибридного белка и фермента Ulp-протеазы, ее зависимость от времени протекания, температуры, концентрации фермента и выбраны оптимальные условия ее проведения.

Научная новизна подтверждена патентом № 2 473 683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения» (приоритет от 15.12.2011).

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производство генно-инженерных лекарственных средств.

Разработанные технологии были использованы для производства субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь на технологической площадке ООО «Фармапарк». Была разработана и утверждена нормативная документация на производство субстанции «Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный безметиониновый». Субстанция была зарегистрирована и внесена в Государственный реестр лекарственных средств.

Полученная субстанция была использованна для получения препарата «ПегАльтевир», представляющего собой пегелированный интерферон аль-фа-2Ь, являющийся пролонгированной формой интерферона альфа-2Ь, который в настоящее время проходит клинические испытания.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по оптимизации штамма-продуцента, отбору штаммов, созданию клеточных банков культур, исследованию ростовых свойств штамма, разрабатывал способ культивирования штамма-продуцента, способ выделения и очистки телец включений, процесс ренатурации и ферментативного гидролиза гибридного белка.

Автор проводил валидацию технологического процесса на этапах создания рабочего банка, культивирования, выделения телец включений, ренатурации и ферментативного гидролиза и осуществлял перенос этих этапов на технологическую площадку ООО «Фармапарк», организовывал работу по анализу конечной субстанции.

Метод биохимической очистки субстанции был разработан к.б.н В. И. Купцовым, сотрудником лаборатории биохимии ОМБ ФГУП «ГосНИИгене-тика», работа по конструированию плазмид и трансформации штамма продуцента была проведена сотрудниками лаборатории экспрессии генов эука-риотических систем ФГУП «ГосНИИгенетика» под руководством к.б.н Д. Г. Козлова, за что выражаю им глубокую благодарность.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2011).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент № 2 473 683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полиме-разы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения» (приоритет от 15.12.2011).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, материалов и ме.

4. ВЫВОДЫ.

1. Обоснован эффективный и рентабельный способ получения интерферона альфа-2Ь и интерферона альфа-2а, не содержащих N-концевой метионин, при котором в клетках штамма-продуцента Е. coli синтезируется гибридный белок, состоящий из слитых последовательностей интерферона и дрожжевого белка SUMO. После процесса биосинтеза в ходе ферментативного гидролиза частица SUMO отщепляется и высвобождается безметиони-новый рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2 без примеси фракции метионинсодержащего интерферона альфа-2.

2. Получен бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2Ь человека с уровнем накопления целевого белка 30% от суммарных клеточных полипептидов, благодаря оптимизации нуклеотид-ной последовательности гена интерферона включением в его состав часто встречающихся в Е. coli синонимических аминокислотных кодонов. Оптимизация нуклеотидной последовательности увеличила выход телец включений с единицы объема ферментера на 57%. По аналогии получен новый промышленный продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2а человека с продуктивностью, составляющей более 25% от суммарных клеточных полипептидов.

3. Разработан универсальный способ культивирования штаммов-продуцентов на основе платформы Е. coli BL21(DE3) и промотора фага Т7. Способ реализован на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека и обеспечивает продуктивность процесса 4,8 ± 0,8 г/л и 3,8 ± 0,8 г/л целевого белка соответственно.

4. Разработан способ выделения и очистки телец включений, процесс ренатурации, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков.

161 предшественников и схема дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека с выходом 875 ± 86 мг и 700 ± 63 мг с 1 л культуральной жидкости соответственно.

5. Показано соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2Ь требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.

6. Внедренный способ производства позволил увеличить эффективность процесса культивирования более чем в 10 раз и снизить себестоимость продукта на 32%, а также более эффективно и экономично использовать уже имеющееся оборудование, увеличить масштабы производства, повысить качество препарата, не меняя существующую технологическую линейку.

7. Разработанный технологический процесс реализован и валиди-рован на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработана и утверждена нормативная документация на производство субстанции «Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный безметиониновый». Субстанция была зарегистрирована и внесена в Государственный реестр лекарственных средств под № ФС 434−151 112.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ.

РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Штаммы-продуценты безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а были депонированы в ВКПМ (Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов) под номером В-10 414 и В-10 700 соответственно.

2. На основании разработанной схемы культивирования был получен патент № 2 473 683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повы.

162 шенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения" (приоритет от 15.12.2011).

3. Разработан и утвержден пусковой регламент на производство субстанции безметионинового интерферона альфа-2, содержащий схему и описание производственного процесса под № ПУР 56 882 590−06−07.

4. Утверждены план и протокол валидациии технологического процесса и аналитических методов, проведены исследования стабильности 3-х серий субстанции в заявленном виде первичной упаковки, результаты исследований утверждены в виде отчетов и таблиц стабильности.

5. Утверждена ФСП (фармакопейная статья предприятия) на субстанцию безметионинового интерферона альфа-2Ь под № ФС 434 151 112.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

1. Рекомендовать использовать разработанную схему промышленного культивирования для новых штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. соН ВЬ21 (БЕЗ).

2. Рекомендовать использовать субстанцию безметионинового интерферона альфа-2Ь для изготовления пегилированных и спреевых готовых лекарственных форм.

включений.

Этап процесса Этап 2 Масса осадка телец включений, г.

Вариант 1 2,9 ±0,1 Вариант 2 3,6 ±0,1 Вариант 3 3,4 ±0,1 Вариант 4 2,2 ±0,1.

Этап 3 2,6 ±0,1 3,4 ±0,1 2,8 ±0,1 3,2 ±0,1.

Этап 4 3,1 ±0,1 4,0 ±0,1 3,6 ±0,1 3,5 ±0,1.

ЯШ яр t.

•ЯШк.

Шт —^^^.

-" ' f J.

Маркер Дез! Суп I Дез11 СупИ ДезШ СупШ ТВ в Н20 Маркер СуперИ ДезШ СуперШ ТВвН20.

Вариант.

Вариант 2.

4,-1.". Ч||"К.

Дез II Супер II Дез III.

Вариант 3 маркеры Супер III ТВ в Н20 маркер ДезШ СупШ.

Вариант 3.

Дез1У Суп IV Дез1У (1/20) ТВ в Н20 Вариант 4.

Рис. 31. Анализ методом электрофореза четырех вариантов отмывки телец включений.

Чистота полученных телец включений по данным электрофореза одинакова. Но нужно отметить, что тельца включения, отмытые по варианту 1, имели специфический запах, что свидетельствовало о неполном удалении небелковых примесей.

Для окончательного выбора схемы отмывки необходимо было провести ренатурацию телец включений и по ее результатам выбрать схему отмывки. Все тельца включения были растворены и ренатурированы. Ренатурацион-ный буфер проанализирован методом ВЭЖХ. Выход во всех вариантах был одинаковым, но белок, полученный в отмывке буфером № 2 (рН=10), имел нестандартную форму хроматограммы, что говорило о модификации белка в процессе отмывки.

Для дальнейшей работы были выбраны вариант 3 и 4.

Как показали дальнейшие эксперименты, критической является стадия дезинтеграции на втором этапе отмывки. Тельца включения, полученные по схеме с дезинтеграцией только на 1 этапе, при растворении давали опалес-цирующий мутный раствор, который практически не фильтровался. Анализ методом электрофореза не показывал различий между тельцами. Видимо, примеси, создающие опалесценцию в растворе, носили небелковый характер. Из-за примесей, оставшихся в тельцах включений, фильтрация раствора была затруднена, выход в ренатурации составил 4% по отношению к сырому весу телец включений.

После введения однократной дезинтеграции на 2 этапе отмывки, снизился вес осадка, получаемого на 2 этапе отмывки. Опалесценция в растворе телец включений исчезла, выход в ренатурации вырос до 6−7% по отношению к сырому весу телец включений.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Т.О., Антропова Г. Ф., Жахов A.B., Ищенко A.M., Мартюшин C.B. и др. Способ получения человеческого интерферона // Патент России № 2 225 722. 2004. Бюл. № 5.
  2. Бумялис В.-A.B., Радзявичюс К. И., Стронгин А. Я., Дебабов В. Г., Стеркин В. Э. и др. Способ получения альфа-2 интерферона человека // Патент России № 1 640 996. 1995.
  3. Ю.Л., Васильев Н. В., Москаленко В. Ф. и др. Эпидемиологические и иммунопатологические аспекты вирусных гепатитов и ВИЧ-инфекции. — Харьков: Изд-во АО «Бизнес Информ», 1997.— 208 с.
  4. С.С., Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. — М., 1996.— С. 147−155.
  5. Д.Г., Яковенко А. Р., Тезов В. А. Гибридный белок (варианты), штамм бактерий Escherichia coli продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека // Патент России № 2 453 604. 2012. Бюл. № 17.
  6. И.Н. Применение индукторов интерферонов в профилактике гриппа и острых респираторных вирусных инфекций // Лечащий врач. 2006. — № 9. — С. 88−89.
  7. Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984. С. 479.
  8. O.E., Попова H.A., Козлов В. К., Карелин М. И. Современные тенденции иммунотерапии злокачественных опухолей / СПб.: изд-во СПб. ун-та, 2001. — 85 с.
  9. М.И., Доманова З. М., Хайбуллина И. И. и др. Способ промышленного получения человеческого лейкоцитарного интерферона-альфа-2 // Патент России № 2 118 366. 1998.
  10. С.Д., Буеверов А. О. Интерфероны в лечении хронических вирусных гепатитов // Терапевтический архив.— М., 1996.— № 11.— С. 74−76.
  11. Н.В., Леонов B.C., Литвинова H.A. Разработка промышленного способа культивирования штамма-продуцента гибридного белка-предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона аль-фа-2Ь // Ветеринарная медицина. 2012. — № 12. — С. 50−54.
  12. Н.В., Леонов B.C., Литвинова Н. А. Способ выделения и очистки телец включений гибридного белка-предшественника безме-тионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь // Ветеринарная медицина. 2013. — № 1. — С. 31−34.
  13. А.Ф., Вовк А. Д. и др. Эффективность рекомбинантного альфа-два-интерферона при вирусном гепатите В // Врачебное дело.— 1990,—№ 9.—С. 105−108.
  14. Д.А., Рябиченко В. В., Акишина Р. И., Глазунов А. В., Честухина Г. Г., Вейко В. П. Способ получения безметионинового интерфе-рона-альфа2Ь человека // Патент России № 2 432 401. 2011. Бюл. № 30.
  15. Ackerman S.K. Biologic activity in a fragment of recombinant human interferon-a / S.K. Ackerman, D. ZurNedden, M. Heintzelman // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1984. Vol. 81 — P. 1045−1047.
  16. Antonelli G. In vivo development of antibody to interferons / G. An-tonelli // J. Interferon Cytokine Res. -1997. Vol. 17 — P. 396.
  17. Alvarez-Mon M. Alpha interferon as an immunomodulator in the treatment of patients with tumors / M. Alvarez-Mon, O.J. Salmeron, L. Manzano //Med. Oncol.-1995.-Vol. 12-P. 15−21.
  18. Ayed A. Hight level production and purification of human interferon alpha.2b in high cell density culture of Pichia pastoris / A. Ayed, I. Rabhi, K. Dellagi // Enzyme Microb. Technol. 2008. — Vol. 42, 2 — P. 173−180.
  19. Bayer P. Structure determination of the small ubiquitin-related modifier SUMO-1 / P. Bayer, A. Arndt // J. Mol. Biol. 1998. — Vol. 280 — P. 275−286.
  20. Baron S. The Interferons: mechanisms of action and clinical applications / S. Baron, S.K. Tyring, W.R. Fleischmann //JAMA. 1991. — Vol. 266 -P.1375−1383.
  21. Ben-Bassat A. Amino-terminal processing of proteins / A. BenBassat, K. Bauer // Nature. 1987. — Vol. March — P.326−315.
  22. Belagaje R. M. Increased production of low molecular weight recombinant proteins in Escherichia coli / R. M. Belagaje, S. G. Reams, S. C. Ly // Protein Sci. 1997. — Vol. September- 6(9) — P. 1953−1962.
  23. Bowden G.A. Structure and morphology of protein inclusion bodies in Escherichia coli / G.A. Bowden, A.M. Paredes, G. Georgiou // Biotechnology (N-Y). 1991. — Vol. Aug- 9(8) — P.725−730.
  24. Butt T.R. SUMO fusion technology for difficult to express proteins / T.R. Butt // Prot. Expr. Purif. 2005. — Vol. 43- P. 1−9
  25. Chung C.H. Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles / C.H. Chung, S. H. Baek // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -Vol. 266 — P.633−640.
  26. CPMP/SWP/QWP/4446/00 Specification Limits for Residues of Metal Catalysts, 2008.
  27. Dalboge H. In vivo processing of N-terminal methionine in E. coli / H. Dalboge, S. Bayne, J. Pedersen // FEBS Lett. 1990. — Vol. Jun 18−266(l-2) -P.l-3.
  28. Dianzani F. Biological basis for the clinical use of interferon / F. Dianzani // Gut. 1993. — Vol. 34 (suppl 2) — P.76.
  29. European Pharmacopoeia, 5th ed. // European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare. 2004
  30. European Pharmacopoeia, 7.0 // European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare. 2010.
  31. European Pharmacopoeia monograph 01/2005:1483 Products with risk of transmitting agents of animal spongiform encephalopathy // European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare. 2005.
  32. European Pharmacopoeia, 50 208 Minimising the risk of transmitting animal spongiform encephalopathy agents via human and veterinary medicinal products // European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare. -2005.
  33. Garzetti G.G. Interferon alpha 2b treatment of cervical intraepithelial neoplasia grade 2: modulation of natural killer cell / G.G. Garzetti, A. Ciavat-tini, C. Romanini // Gynecol. Obstet. Invest. 1994. — Vol. 37 — P.204−209.
  34. Gelfand J.A. Alterations in body temperature / J.A. Gelfand, C.A. Dinarello // Harrison’s Principles of Internal Medicine. 1998. — P.84−90.
  35. Ghosalkar A. Secretory expression of interferon-alpha 2b in recombinant Pichia pastoris using three different secretion signals / A. Ghosalkar, V. Sahai, A. Srivastava // Protein Expression and Purification 2008. — Vol. 60. — P. 103−109.
  36. Guo, J.T. Apoptosis and regeneration of hepatocytes during recovery from transient hepadnavirus infections / J.T. Guo, H. Zhou, C. Liu // J.Virol. -2000. Vol. 75. — P.8516−8523.
  37. Haque S.J. Signal transduction in the interferon system / S.J. Haque, B.R.G. Williams // Sem. Oncol. 1998. — Vol. 25 (supp 11). — P. 14−22.
  38. Harris E.L.V. Protein purification applications: a practical approach / E.L.V. Harris, S. Angal // Oxford University Press. 2001. — Vol. 23. — P.225−231.
  39. Henco K. Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes / K. Henco, J. Brosius, A. Fujisawa // J. Mol. Biol. 1985. — Vol.185. -P.227−260.
  40. Hermeling S. Structure-immunogenicity relationships of therapeutic proteins / S. Hermeling, Crommelin J.A. Daan, Huub Schellekens // Pharmaceutical Research — 2004. — Vol. 21. P.897−903.
  41. Hirel, P. Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid / P. Hirel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1989. — Vol. 86(21). P.8247−51.
  42. Hochuli E. Interferon immunogenicity: technical evaluation of interferon alfa-2a / E. Hochuli // J. Interferon Cytokine Res. — 1997.— Vol. 17 (suppll). P. S15-S21.
  43. Hochstrasser M. All in the ubiquitin family / M. Hochstrasser. Science. — 2000.— Vol. 289. P. 563−564.
  44. Hosfield T. Influence of the amino acid residue downstream of (Asp)4Lys on enterokinase cleavage of a fusion protein / T. Hosfield, Q. Lu. Anal Biochem.— 1999.— AprlO- 269(1). P. 10−6.
  45. Hubbard S.J. Modeling studies of the change in confirmation required for cleavage of limited proteolytic sites / S.J. Hubbard, F. Eisensenger, J.M. Thornton // Protein Sci. — 1994, — Vol. 3. P.757−768.
  46. Hubbard S. Proteolysis of native proteins as a structural probe / S. Hubbard, R.J. Beynon // Protein Engineering — 1998. — Vol. 11.- P.349−359.
  47. Hunter C.A. Type I interferons enhance production of IFN-gamma by NKcells / C.A. Hunter, K.E. Gabriel, T. Radzanowski // Immunol Lett. — 1997, —Vol. 59.-P.1−5.
  48. Jenny R.J. A critical review of the methods for cleavage of fusion proteins with thrombin and factor Xa / R.J. Jenny // Protein Expr. Purif. — 2003.1. Vol. 31(1). P. l-11.
  49. Jentsch S. Ubiquitin and its kin: how close are the family ties? / S. Jentsch, G. Pyrowolakis // Trends Cell Biol. — 2000. — Vol. 10. P.335−342.
  50. Jhansi Maachupalli-Reddy. Effect of Inclusion Body Contaminants on the Oxidative Renaturation of Hen Egg White Lysozyme / Jhansi Maachupalli-Reddy, Brian D. Kelley, Eliana De Bernardez Clark // Biotechnology Progress.1997. —Vol. 13, Issue 2. P.144−150.
  51. Johnson E.S. The ubiquitin-like protein Smt3p is activated for conjugation to other proteins by an Aoslp/Uba2p heterodimer / E.S. Johnson, I. Schwienhorst, R.J. Dohmen // EMBO J. — 1997. — Vol. Sep 15−16(18). -P.5509−5519.
  52. Isaacs A. Virus interference. The interferon / A. Isaacs, J. Lindenmann // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.— 1957.— Vol. 147. P.258−267.
  53. Itri L.M. Incidence and clinical significance of neutralizing antibodies in patients receiving recombinant interferon alfa-2a by intramuscular injection171
  54. L.M. Itri, M. Campion, R.A. Dennin // Cancer — 1987.— Vol. 59. P.668−674.
  55. Kartasheva et al. Genetic aspects of carbon catabolite repression of the STA2 glucoamylase gene in Saccharomyces cerevisiae / Kartasheva et al // Yeast— 1996.— Vol. 12. -P.1297−1300.
  56. Koths K.E., Thomson J.W., Kunitani M. Purified recombinant inter-leukin-2 and process for recovering and purifying // EP 156 373 — 1985.
  57. Liao Y.D. Removal of N-terminal methionine from recombinant proteins by engineered E. coli methionine aminopeptidase / Y.D. Liao, J.C. Jeng, C.F. Wang//Protein Science — 2004, — Vol. 13.-P. 1802−1810.
  58. Li S.J. The Ulpl SUMO isopeptidase: distinct domains required for viability, nuclear envelope localization, and substrate specificity / S.J. Li, M. Hochstrasser// J. CellBiol. — 2003, — Vol. 160.-P. 1069−1081.
  59. Mariusz Kamionka. Engineering of Therapeutic Proteins Production in Escherichia coli / Mariusz Kamionka // Current Pharmaceutical Biotechnology — 2011,—Vol. 12.-P. 268−274.
  60. Malaguarnera M. Interferon, Cortisone and Antivirals in the Treatment of Chronic Viral Hepatitis: A Review of 30 Years of Therapy / M. Malaguarnera, S. Restuccia, M. Motta // Pharmacotherapy. — 1997.— № 17 (5). P. 998−1005.
  61. M. P., Mattern M. R., Malakhova O. A., Drinker M., Weeks S. D., Butt T. R. // J. Struct. Funct. Genomics. — 2004.— Vol. 5. P. 7586.
  62. Marblestone J.G. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO /172
  63. Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y. // Protein Sci. — 2006. — Vol. 15. -P. 182−189.
  64. McFall E., Newman E.B., Neidhardt F.C. Amino acids as carbon sources, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, 2nd ed. (Chapter 22), American Society for Microbiology, Washington, DC, 1996.
  65. Meinnel T., Mechulam Y., Blanquet S. Methionine as translation start signal: a review of the enzymes of the pathway in Escherichia coli / T. Meinnel, Y. Mechulam, S. Blanquet // Biochimie — 1993. — Vol. 75(12). P. 106 175.
  66. Mogensen K.E. Production and preparation of human leukocyte interferon / K.E. Mogensen, K. Cantell // Pharmacol Ther. — 1977. — Vol. 1. -P.369−381.
  67. Morikawa K. Recombinant interferon-alpha, -beta, and -gamma enhance the proliferative response of human B cells / K. Morikawa, H. Kubagawa, T. Suzuki // J. Immunol. — 1987. — Vol. 139. P.761−766.
  68. Mossessova E. Ulpl-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast / E. Mossessova, C.D. Lima // Mol. Cell. — 2000. — Vol. May 5(5). -P.865−76.
  69. Muller S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin / S. Muller, C. Hoege, G. Pyrowolakis // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. — 2001. — Vol. 2. P.202−210.
  70. Muller S. Conjugation with the ubiquitin-related modifier SUMO-I regulates the partitioning of PML within the nucleus / S. Muller, M.J. Matunis, A. Dejean//EMBO J. — 1998.—Vol. 17.-P.61−70.
  71. Nagabhushan T.L., Trotta P.P., Gerhartz W., Yamamoto Y.S., Campbell F.T., Pfefferkorn R., Rounsaville J.F., eds. Interferons. Weinheim, Germany: VCH Verlagsgesellschaft mbH. — 1989. P.365−380.
  72. Nambiar K.P. Expression of bovine pancreatic ribonuclease A in Escherichia coli / K.P. Nambiar, J. Stackhouse, S.R. Presnell, S.A. Benner // Eur. J. Biochem. — 1987.— Vol. Feb 16−163(1). P.67−71.
  73. Neus Ferrer-Miralles, Joan Domingo-Espinl, Jose L Corchero, Esther Vazquez, Antonio Villaverde // Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Ferrer-Miralles. — 2009.
  74. Ortaldo J.R. Effects of several species of human leukocyte interferon of cytotoxic activity of NK cells and monocytes / J.R. Ortaldo, A. Man-tovani, D. Hobbs // Int. J. Cancer. 1983. — Vol. 31. — P. 285−289.
  75. Paul P. Trotta. Approval standards for alfa interferon subtypes / Paul P. Trotta, Guido Antonelli, James Bausch // Drug Information Journal. 2000. -Vol. 34. — P.1231−1246.
  76. Pawelec G. Relative roles of natural killer- and T cell-mediated anti-leukemia effects in chronic myelogenous leukemia patients treated with inter-feron-a / G. Pawelec, P. Da Silva, H. Max // Leuk Lymphoma 1995. — Vol. 18.-P. 471−478.
  77. Pestka S. Interferons and their actions / S. Pestka, J.A. Langer, K.C. Zoon // Ann. Rev. Biochem. 1987. — Vol. 56. — P. 727−777.
  78. Pestka S. The human interferon-a species and hybrid proteins / S. Pestka // Sem. Oncol. 1997. — Vol. 24 (suppl 9). — P. S9^I-S9−17.
  79. Pestka S. The interferon receptors / S. Pestka // Sem. Oncol. 1997. — Vol. 24 (suppl 9). — P. S9−18-S9−40.
  80. Powrie F. Cytokine regulation of T-cell function: potential for therapeutic intervention / F. Powrie, R.L. Coffman // Trends Pharmacol. Sci. -1993. —Vol. 14. -P.164−168.
  81. Rabbani S.F. Recombinant human parathyroid hormone synthesized in Escherichia coli / S.F. Rabbani // J. Biol. Chem. 1988. — Vol. 263. -P.1307−1313.
  82. Radhakrishnan R., Walter L.J., FIruza A. Zinc mediateddimerof human interferon-a revealed by 2b x-ray crystallography / R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hruza // Structure. 1996. — Vol. 4. — P.1453−1463.
  83. Rehermann B., Lau D., Hoofnagle J.H., Chisari F.V. Cytotoxic T lymphocyte responsiveeness aftere solution of chronic hepatitis B virus infection / B. Rehermann, D. Lau, J.H. F.V. Hoofnagle // J. Clin. Invest. 1996. — Vol. 97. — P.1655−1665.
  84. Revel M., Chebath J. Interferon-activated genes / M. Revel, J. Che-bath // Trends Biochem. Sci. 1986. — Vol. 11. — P. 166−170.
  85. Salunkhe S., Soorapaneni S., Prasad K.S. Strategies to maximize expression of rightly processed human interferon alpha2b in Pichia pastoris / S. Salunkhe, S. Soorapaneni, K.S. Prasad // Protein Expr. Purif. 2010. — Vol. 71. -P.139−46.
  86. Shapiro R. Expression of Met-(-l) angiogenin in Escherichia coli: Conversion to the authentic less than Glu-1 protein / R. Shapiro, J.W. Harper, E.A. Fox // Anal. Biochem. 1988. — Vol. 175. — P. 450−461.
  87. Shi et al. Efficient expression and purification of human interferon alpha2b in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / Shi et al. // Protein Expr. Purif. 2007. — Vol. 54.-P. 220−6.
  88. Solbiati, J. Processing of the N-terminal of nascent polypeptide chains requires deformylation prior to methionine removal / J. Solbiati, A. Chapman-Smith, J. L. Miller // J. Mol. Biol. 1999. — Vol. 290. — P. 607−14.
  89. Spiegel R.J., Jacobs S.L., Treuhaft M.W. Anti-interferon antibodies to interferon-alfa: results of compar-2b ative assays and clinical perspective / R.J. Spiegel, S.L. Jacobs, M.W. Treuhaft // J. Interferon Res. 1989. — Vol. 9 (suppl 1). — P. S17-S24.
  90. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. How cells respond to interferons / G.R. Stark, I.M. Kerr, B.R. Williams // Ann. Rev. Biochem. 1998. — Vol. 67. — P. 227−264.
  91. Stewart W.E.I. Distinct molecular species of interferons / Stewart W.E.I. // Virology 1974. — Vol. 61. — P. 80−86.
  92. Streuli M., Nagata S., Weissmann C. At least three human type ainterferons: structure of a2 / M. Streuli, S. Nagata, C. Weissmann // Science -1980, —Vol. 209. P.1343−1347.
  93. Studier F. William. Protein production by auto-inductionin high-density shaking cultures / Studier F. William // Protein Expression and Purification 2005. — Vol. May 41(1). — P.207−34.
  94. Sztein M.B., Steeg P. S., Johnson H.M. Regulation of human peripheral blood monocyte DR antigen expression in vitro by lymphokines and recombinant interferons / M.B. Sztein, P. S. Steeg, H.M. Johnson // J. Clin. Invest. -1984. — Vol. 73. P.556−565.
  95. Taylor J.L., Grossberg S.E. The effects of interferon-a on the production and action of other cytokines / J.L. Taylor, S.E. Grossberg // Sem. Oncol.- 1998. — Vol. 25. P.23−29.
  96. Trotta P.P., Spiegel R.J. Interferon: current concepts of mechanisms of action // Muggia FM, ed. Concepts, Clinical Developments, and Therapeutic Advances in Cancer Chemotherapy. Boston: Martinus Nijhoff Publishers. 1987.- P.141−159.
  97. Valax P., Georgiou G. Molecular Characterization of Protein Inclusion Bodies in Escherichia coli: I. Composition / P. Valax, G. Georgiou // Biotechnology Progress. 1993. — Vol. 9. — P.539−547.
  98. Wanner B.L., Cellular and Molecular Biology, 2nd ed., (Chapter 87) // American Society for Microbiology, Washington DC. 1996.
  99. Walsh Biopharmaceutical benchmarks 2010 // Nat Biotechnol. -2010. — Vol. Sep 28(9). P.917−24.
  100. Wetzel R. Assignment of the disulphide bonds of leukocyte interferon / R. Wetzel // Nature. 1981. — Vol.289. — P. 606−607.
  101. Wenner C.A., Guler M.L., Macatonia S.E. Roles of IFN-gamma and IFN-alpha in IL-12-induced the percell-development / C.A. Wenner, M.L. Guler, S.E. Macatonia//J. Immunol. 1996. — Vol.156. — P. 1442−1447.
  102. Wilkinson K.D. Regulation of Ub-dependent processes by deubiq-uitinating enzymes / K.D. Wilkinson // FASEB J. 1997. — Vol. 11. — P. 12 451 256.
  103. Yamamura M., Modlin R.L., Ohmen J.D. Local expression of anti inflammatory cytokines in cancer / M. Yamamura, R.L. Modlin, J.D. Ohmen // J. Clin. Invest. 1993. — Vol. 91. — P. 1005−1010.
  104. Zimmermann J., Voss H., Schwager C. Sanger dideoxy sequencing reaction protocol / J. Zimmermann, H. Voss, С. Schwager // FEBS Lett. 1988. — Vol. Jun 20−233(2). — P.432136.
  105. Zoon K.C., Bekisz J, Miller D. Human interferon alpha family: protein structure and function / J. Bekisz, D. Miller // Interferon: Principles and Medical Applications. 1992 — Vol. 95. — P. 105.
  106. Zoon K.C., Arnheiter H. Studies of the interferon receptors / K.C. Zoon, H. Arnheiter // Pharmacol. Ther. 1984. — Vol. 24. — P.259−278.
  107. Патент US № 5 665 566, 09.09.1997.
  108. База данных NCBI Электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения: 23.08.2010).
  109. Патент US № 6 872 551, 29.03.2005.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?