Динамика выживания бактерий в цепи взаимосвязанных природных субстратов

Актуальность проблемы. Исследование путей распространения микроорганизмов в природных средах и их активности, прослеживание судьбы популяций в естественных субстратах, контаминация почвы и других природных местообитаний, определение риска попадания микроорганизмов, в том числе патогенных, в организм человека и животных с пищей, в том числе с овощной продукцией, продолжает оставаться актуальной задачей (Заварзин, 1989; Кожевин, 1989; Добровольская, 2002; McCaig, 2001; Ranjard, 2001; Natvig, 2002; Ingham, 2004; Semenov, 2004; Franz, 2005; Van Bruggen, 2008).

Традиционным методическим приемом исследования выживания микроорганизмов в естественных субстратах является интродукция их в такие субстраты и прослеживание популяционпой динамики в конкретном субстрате. Закономерности поведения сапротрофных микроорганизмов при их интродукции и динамика выживания в одном субстрате исследованы довольно хорошо (Звягинцев, 1987; Звягинцев и Голимбет, 1983; Кожевин, 1989; Семенов, 2005; Ahn, 2001; Zelenev, 2005). Исследования выживания микроорганизмов, а тем более энтеропатогенов, при последовательном перемещении их в другой или третий субстрат все еще редки (Шустрова с соавт., 1992; Semenov A.M., 2004).

В подавляющем большинстве работ, связанных с выявлением динамики микроорганизмов, в том числе патогенных, в природе, исследователи ограничиваются прослеживанием их наличия и численности только в отдельном природном субстрате или местообитании (Wang, 1996; Kudva, 1998; Himathongkham, 1999; Jiang, 2002). Однако существует проблема перемещения микроорганизмов из одного местообитания в другие, а тем более перемещения через несколько разных местообитаний в виде цепи и даже цикла (Семенов, 2005). Такой вариант распространения как сапротрофных, так и энтеропатогенных микроорганизмов остается малоизученным, хотя указания на существование такого цикла высказывались давно, а само явление, несомненно, важнее и интереснее, чем просто выживание микроба в одном субстрате (Мишустин с соавт., 1979; Литвин с соавт., 1997).

В настоящее время в развитых странах широко развернулось движение за производство экологически чистых продуктов, охрану природы от бесконтрольной химизации и, в том числе, от распространения генетически модифицированных организмов. В повседневной практике внесение некомпостированного или недостаточно компостированного навоза в почву — нередкость, особенно при использовании «экологически чистых» технологий производства продуктов. Это несет в себе серьезную опасность для человека быть инфицированным такими штаммами бактерий как Е. coli 0157: Н7, Salmonella spp, Campilobacter jejuni, Listeria monocytogenes и некоторыми другими. Бактерии Salmonella spp., Escherichia coli 0157: H7 являются наиболее распространенными возбудителями пищевых отравлений в мире, связанных с употреблением инфицированных мясных и молочных продуктов, фруктов, овощей и их производных, в частности, соков и пюре (Altwegg, 1998; Brackett, 1999; Rangel et al., 2005).

Резервуарами и распространителями упомянутых энтеропатогеннов традиционно считали животных. Однако последние исследования показывают, что они успешно выживают и вне желудочно-кишечных трактов (ЖКТ) животных (Van Bruggen, 2008). Именно этими фактами вызваны массированные исследования, развернувшиеся в зарубежных научных центрах (Natvig, 2002; Solomon, 2002; Ingham, 2004; Franz, 2005).

Учитывая тот факт, чго энтеробактерии способны проникать и в ткани растений, выживая в них, опасность распространения инфекций существенно возрастает (Люлин, 2007; Solomon, 2002; Klerks, 2007).

Результаты наших исследований могут оказаться полезными для развития традиционных фундаментальных тем, в частности, дальнейшего развития теоретических представлений о миграции микроорганизмов. Распространение микроорганизмов в природе происходит главным образом двумя путяминенаправленной диссипацией и векторным переносом. В этой связи представляется важным выяснить потенциальные возможности одной и той же популяции микроорганизмов выживать в разных природных субстратах. Интересным представляется и решение вопроса о том, что является более важным для микроорганизма: способность максимально долго выживать в одной конкретной нише (нише-фаворите) с поддержанием необходимой популяционной плотности или постепенно, снижая плотность, но быть способным проходить через ряд субстратов. Результаты исследований важны для расширения знаний о последствиях интродукции ГМ микроорганизмов в природные местообитания с целью предотвращения их неконтролируемого распространения.

Таким образом, как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения изучение явления многократного перемещения микроорганизмов через различные, но взаимосвязанные местообитания, способность конкретной популяции проходить через ряд взаимосвязанных субстратов, в том числе в виде цикла и количественные закономерности таких перемещений являются важными и нужными.

Целью работы являлось изучение выживания бактерий, сапротрофных и аналогов энтеропаюгенных, при перемещении в цепи природносвязанных субстратов с образованием цикла: животные — экскременты животных — почварастения и опять животные и выявление количественных закономерностей динамики перемещающихся популяций.

Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. В лабораторных экспериментах изучить закономерности выживания аналогов энтеропатогенных Salmonella Typhimurium МАЕ 110 gfp, Escherichia coli 0157: Н7 gfp и сапротрофных Psendomonas fluorescens 32 gfp бактериальных популяций в краткосрочных экспериментах при интродукции их в экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) и последующем перемещении в серии природных субстратов в зависимости от исходной численности бактерий.

2. Определить длительность выживания исследуемых популяций бактерий в краткосрочных и долгосрочных экспериментах при интродукции их в ЭКРС и после перемещения в почву при циклически изменяющейся и постоянной температуре, а также при дальнейшем перемещении на растения, через ЖКТ животных и в экскрементах животных.

3. Определить способность избранных бактерий расти в комбикорме, используемом для кормления разных сельскохозяйственных животных.

4. Изучить способность исследуемых бактерий проходить через ЖКТ коров при попадании таких бактерий в пищеварительный тракт с кормами, динамику выживания бактерий в экскрементах и при, последующем перемещении бактерий в почву, на растения и через ЖКТ других животных.

5. Исследовать способность бактерий проходить через ЖКТ птиц (кур) при попадании в ЖКТ с кормами, динамику их выживания в экскрементах и в воде при инокуляции воды такими экскрементами.

Научная новизна. Впервые в серии лабораторных и натурных экспериментов на примере представителей энтеропатогенных и сапротрофных бактерий проведены сравнительные исследования возможности перемещений индивидуальных бактериальных популяций через серию природных местообитаний: животные — их экскременты — почва — растения и опять животные с фактическим образованием цикла. Показана возможность существования укороченных цепей и циклов. Результаты дают основание полагать, что циркуляция микроорганизмов может происходить не только в виде замкнутой цепи-цикла, но и в виде замкнутой сети. Выявлена возможность активного роста энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в комбикорме с последующим прохождением этих бактерий через ЖКТ разных животных. Установлено, что циклически меняющаяся температура, соответствующая природному режиму день-е ночь, более негативно действует на выживание энтеропатогенных и сапротрофных бактерий, как в ЭКРС, так и смеси ЭКРС-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо принимать во внимание при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов в природе. В круговороте пли цикле микроорганизмов имеются местообитания, в которых может происходить увеличение численности микроорганизмов. Показано, что на растениях, может происходить «подращивание» популяций патогенных микроорганизмов. Получено подтверждение положению о том, что численность интродуцента, сравнимая или несколько меньшая численности культивируемых аборигенов, является более оптимальной для прохождения по цепи субстратов, чем очень высокая или очень низкая численности. Установлено, что при интродукции микроорганизмов в природные субстраты имеет место не ограниченный акт существования конкретного микроорганизма в том конкретном местообитании, а скорее последовательная многоступенчатая интродукция с возможными отдаленными последствиями для экосистемы.

Практическая значимость. Полученные результаты найдут применение при разработке методик оценки риска распространения энтеропатогенных микроорганизмов в природе, а также для разработки методических пособий и рекомендаций по предотвращению неконтролируемого распространения генетически модифицированных микроорганизмов в природе. Результаты исследований следует направить в органы санэпидемнадзора для использования при разработке мер и правил санитарно-эпидемиологического контроля пищевой продукции и, в первую очередь, для разработки мер и правил выращивания, хранения и переработки овощной продукции.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на конференциях и симпозиумах: «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, 2005; «Автотрофные микроорганизмы», Москва, 2005; «Микроорганизмы и биосфера», Москва, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ: 4 экспериментальные статьи, 3 тезисов конференций, 2 статьи приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, списка литературы, который содержит 222 наименований работ. Материалы диссертации изложены на 141 страницах текста и включают 19 рисунков и 4 таблицы.

выводы.

1. Сапротрофные и энтеропатогенные бактерии способны активно расти в кормах животных и проходить через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) животных, длительно (до 70 сут) выживать и увеличивать численность в экскрементах животных, сохранять популяционную численность при попадании в почву и/или воду и перемещаться на растения, при этом даже увеличивая численность на растениях по сравнению с почвой, повторно проходить через ЖКТ других животных при поедании животными этих растений. Полученные результаты свидетельствуют о способности каждой индивидуальной популяции бактерий к циклическим перемещениям в экосистеме. Циклическое перемещение популяций бактерий возможно через разное количество промежуточных звеньев.

2. Соответствующие суточному циклу изменения температуры в режиме день-ночь более негативны для выживания бактерий в экскрементах животных и смеси экскременты-почва, чем традиционно применяемая в исследованиях постоянная температура. Этот факт необходимо учитывать при оценке риска выживания и распространения микроорганизмов, особенно патогенных, в природе.

3. Популяционная плотность интродуцентов, сравнимая или несколько меньшая плотности выявляемых на средах «аборигенных» бактерий является более подходящей для прохождения интродуцентов по цепи разных природных субстратов, по сравнению с очень высокой или очень низкой популяционной плотностью.

4. При интродукции микроорганизмов в природные местообитания имеет место не краткосрочный и одиночный акт существования микроорганизма в конкретном субстрате или местообитании, а последовательное многоступенчатое внедрение микроорганизма в экосистему. Показано, что генетически модифицированные микроорганизмы (ГММ) способны к длительной циркуляции в разных местообитаниях. Обильное и неконтролируемое применение ГММ в практике может привести к их длительному внедрению в экосистемы с положительными или отрицательными последствиями для компонентов этих экосистем.

Заключение

.

Все природные экосистемы почвенные и водные, а также растения и животные, которые, являясь хотя и компонентами экосистем, но с другой стороны, они, по существу, сами по себе тоже являются экосистемами, обильно заселены разнообразными микроорганизмами. Микроорганизмы, обитающие в экосистемах, экотопах, эконишах и всех других местообитаниях, адаптированы к сосуществованию внутри этих местообитаний, а также и к местообитаниям, а границы таких местообитаний называют еще экологическими барьерами. Однако резких границ между этими экологическими системами не существует, а-обитатели этих систем обладают еще и своими нормами реакции в отношении окружающих их физико-химических и биологических факторов. Микроорганизмы перемещаются, главным образом, пассивно и не направлено, но вместе с тем в существенной степени и направленно перемещаются между разными экосистемами, экотопами, эконишами и просто местообитаниями. Повсеместность обитания микроорганизмов объясняется не только следствием их диссипативного распространения, но и направленной циркуляцией, которая в свою очередь является следствием круговорота вещества в экосистемах, наличием жизненных циклов более высокоорганизованных живых систем и функционированием пищевой цепи в экосистемах. В результате имеет место распространение, расселение и заселение вновь образуемых местообитаний.

Имеется много экспериментального материала о существовании и функционировании микробных популяций в естественных средах и субстратах, динамике их роста и активности. Этот материал был получен, как путем наблюдений за природными популяциями или даже сообществами микроорганизмов и их функционированием в природных средах, так и в экспериментах, в том числе, путем интродукции в среды и субстраты различными способами меченых микробных популяций. Экспериментальный материал в большей или меньшей степени, но обобщен в виде наиболее общих закономерностей, концепций и даже теорий, отражающих рост и развитие микробных популяций и даже сообществ в естественных средах, динамику их развития, трансформацию простых и сложных субстратов, реакции на физические, химические и биологические факторы. Однако подавляющее большинство этого экспериментального материала и его обобщение отражают дискретно полученные результаты. Связи же, необходимые для получения целостного представления о явлениях и процессах, как правило, получают путем реконструирования событий, а такая реконструкция может оказаться далеко неадекватной естеству процессов. В настоящее время разработаны методы, позволяющие аккуратно и довольно долго прослеживать популяционную динамику не только индивидуальных микробных популяций, но даже и созданных ассоциаций в естественных местообитанияхпочве и воде, на растениях и в растениях, на животных и в животных. С этой целью удобно использовать микроорганизмы, несущие гены, кодирующие и синтезирующие внутри клетки белки с разным свечением (Veening et al., 2004). Перспективным является и FISH-метод, хотя его чувствительность не всегда удовлетворительна. Различные варианты микрочипов также являются достаточно эффективными методами, хотя и требуют очень дорого оборудования и квалифицированных специалистов для использования, как оборудования, так и интерпретации результатов.

Прослеживание популяционной динамики при последовательном перемещении интересующей исследователя популяции через несколько местообитаний позволяет получать уже не дискретные результаты и реконструированное представление, а истинно динамическое представление в его целостности, движении и развитии.

Прослеживание за конкретной популяцией микроорганизмов при перемещении ее через несколько разных природных субстратов, по существу, является многоступенчатой интродукцией. Такое явление, и это вполне очевидно, является широкораспространенным и даже повсеместным явлением в природе. Выявление закономерностей такой многоступенчатой интродукции микроорганизмов и получение количественных данных об этом явлении стало важным и актуальным в силу многих причин и, в частности, в связи с использованием генетически модифицированных организмов.

При исследовании циркуляции микроорганизмов через естественные местообитания достоверность и надежность результатов, их практическая значимость в существенной степени зависит от микроорганизмов, избранных в качестве объектов исследований. В связи с этим часто используют микроорганизмы с «широкими» эколого-физиологическими возможностями и более того, стараются проследить за опасными для здоровья человека, животных и растений микроорганизмами, то есть патогенными микроорганизмами. Такой подход, по-видимому, оправдан, так как среди патогенов довольно много космополитов, арезультаты таких исследований представляют не только академический интерес, но сразу же найдут и практическое применение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы.

Микроорганизмы.

Объектами исследований были генетически маркированные бактерии, способные синтезировать зеленый флуоресцирующий белок (GFP). Исследования проводились с антибиотикоустойчивыми и авирулентными штаммами (гены вирулентности удалены).

Salmonella enterica var. Typhimurium МАЕ 110 gfp (далее для краткости S. Typhimurium gfp) получена от д-ра Юты Ремлинг (микробиологический ценгр, Каролевский институт, Стокгольм, Швеция). GFP-кассета интегрирована в хромосому, но без идентификации ее расположения. Для конструирования gfp-штамма была использована плазмида PAG408, включающая участок инициации трансляции,^{-конструкцию,} ген канамицинустойчивости, ген гентамицинустойчивости, а также 5-Т участки, которые используются для встраивания в хромосому.

Escherichia coli 0157: Н7 штамм В6−914 gfp-91 (далее для краткости Е. coli 0157: Н7 gfp) получена из лаборатории проф. А. Ван Бругген, Университет Вагенингена, Нидерланды. Штамм не продуцирует шигаподобных токсинов 1 и 2 типов (Stxl" и Stx2″), содержит ген ампициллинустойчивости. Статистически достоверных различий в выживании между шигатоксин-положительными (Stxl+ и Stx2+) и отрицательными (Stxl" и Stx2″) штаммами Е. coli 0157: Н7 не выявлено (Kudva et al., 1998; Scott et al., 2006).

Pseudomonas fluoresceins 32 gfp получена от Dr. J.M. Raaijmakers, Университет Вагенингена, Нидерланды. Штамм был выделен с корней пшеницы, растущей в почве, обладающей супрессирующей активностью к болезни пшеницы, именуемой «полегание пшеницы», и где до этого выращивали пшеницу на протяжении 27 лет в монокультуре. Этот штамм эффективно контролирует Gaeumannomyces graminis var. tritici (гриб, вызывающий полегание пшеницы) и продуцирует 2,4-диацетилфлороглюцинол. Спонтанный рифампицин-устойчивый штамм 32 был трансформирован плазмидой PVSP61TIR Dr. Sayler R.J. (биологический факультет, университет Арканзаса, США). Плазмида PVSP61TIR была любезно предоставлена Dr. Lindow S. (Университет Беркли, Калифорния,.

США). Эта плазмида содержала конститутивно экспрессируемые гены gfp-конструкции и канамицинустойчивости.

Проявление активности GFP легко детектируется под люминесцентным микроскопом, и объединение генетической информации в штамме подтвердилось с помощью ПЦР ДНК-фингерпринтом дикого штамма P. fluorescens 32 и трансформированного P. fluorescens 32 gfp. Стабильность GFP-пакета была проверена в течение долгого времени культивирования трансформированного микроорганизма на среде без антибиотиков (Vialette et al., 2004; Solomon and Matthews, 2005; Van Bruggen et al., 2008).

Бактерии были сохранены при -80°С и проверены на жизнеспособность перед использованием.

Избранные для исследований бактерии фактически не отличались по физиолого-кинетическим и экологичесим характеристикам от натуральных бактерий и «кастрирование» генов вирулентности не повлияно на них (Durso et al., 2004).

Экскременты крупного рогатого скота (ЭКРС) были собраны на ферме крупного рогатого скота ЗАО «Московский конный завод № 1» Одинцовского района Московской области. Рацион кормления животных включал кг/особь/сутки: зеленая масса — 2,5- сено — 1- комбикорм сухой — 3,0- соль на зеленую массу — 40 г/особь/ сутки. В экспериментах использовали свежесобранные экскременты. Исходная влажность экскрементов в среднем составляла 70%, рН — 7,1.

Почва. Использовали дерново-подзолистую почву, отобранную в Ботаническом саду МГУ имени М. В. Ломоносова недалеко от растений облепихи (Hippophae rhamnoides L.) с глубины 0 -15 см. Почву просеивали через сито (ячейки 2 мм) и хранили в полиэтиленовом пакете при комнатной температуре. Почва содержала: общего углерода — 39,6 мг/г, общего азота — 2,9 мг/г, азота аммонийного — 3,8 мкг/г, азота нитратного — 85,5 мкг/г, фосфора в виде фосфат-ионов — 17,7 мкг/г, рН почвы — 6,6. Фракционный состав почвы был следующим: (среднее в объемных %): глина — 11,7- песок — 31,8 и илистые частицы — 56,5.

Вода. Использовали природную воду, отобранную из пруда вблизи пос. Николина Гора Одинцовского района Московской области. Использовали нестерильную и стерильную воду. Стерилизацию проводили автоклавированием при повышенном давлении в 0,5 атм в течение 30 мин.

Растения. Для выявления способности интродуцентов колонизировать растения использовали кресс-салат {Lepidium sativum L.) сорта Витаминный, производитель «Агрофирма Аэлита», всхожесть семян 92,5% и овес (Avena sativa L.) сорта Горизонт, всхожесть семян 85%.

Комбикорм. Для определения динамики роста бактерий в суспензии комбикорма использовали комбикорм для сельскохозяйственных животных производства ОАО «Истра-Хлебопродукт», состав: ячмень, отруби, пшеница, шрот рапсовый, жмых подсолнечниковый, с добавлением соли и микроэлементов.

Животные.

Крупный рогатый скот (КРС) {Bos taurus taurus L.). В экспериментах по выживанию исследуемых бактерий при прохождении их через желудочно-кишечный тракт КРС использовали коров-нетелей черно-пестрой породы в возрасте 1 года.

Грызуны. Для проверки вероятности выживания исследуемых бактерий при прохождении их через желудочно-кишечный тракт грызунов использовали лабораторных мышей (Mus musculus cf.) и морских свинок (Cavia aperea L.). В лаборатории животных содержали в емкостях при 18−20°С, кормили специализированными кормовыми смесями с добавлением сочных кормов (морковь, капуста) и сена для морских свинок.

Куры (Gallas gallus domesticus L.). Использовали кур-несушек породы «Московская» в возрасте 1 года.

Беспозвоночные животные. Для выявления выживания исследуемых бактерий при прохождении их через ЖКТ беспозвоночных использовали виноградных улиток (.Helix pomatia L.), собранных в Ботаническом саду МГУ. В лаборатории улиток содержали в стеклянных емкостях при 18−20°С и кормили листьями капусты и тонкими срезами моркови.

Динамика прогревания ЭКРС при циклически меняющейся температуре в зависимости от объема ЭКРС. Экскременты массой 0,1, 0,5 и 2,0 кг помещали в пластиковые горшки, закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой, в каждый горшок в середину субстрата вставляли термометр. Эксперимент проводили в трех повторностях. Режим инкубирования составлял 8 ч при 25 °C и 16 ч при 15 °C.

Выращивание бактерий и подготовка инокулюма.

S. Typhimurium gfp выявляли на среде, содержащей г/л: дрожжевой экстракт — 5, бактопептон — 10, агар — 17, вода дистиллированная. рН среды 7,2 — 7,4. Добавляли антибиотик налидиксовая кислота (50 мг/л). После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик канамицин (50 мг/л).

Е. coli 0157: Н7 gfp выявляли на среде (LB-media), содержащей г/л: дрожжевой экстракт (Difco) — 5, бактопептон (Difco) — 10, NaCl — 10, агар — 17. Вода дистиллированная 1 л. рН среды 7,2 — 7,4. После автоклавирования вносили стерилизованный фильтрацией антибиотик ампициллин (50 мг/л).

P. fluoresceins 32 gfp выявляли на среде, содержащей г/л: бактопептон — 2, К2НР04 — 1,4, MgS04−7H20 — 1,5, глицерин — 15 мл/л, агар — 17. рН среды 7,0 — 7,2. После автоклавирования вносили стерилизованные фильтрацией антибиотики канамицин (50 мг/л) и рифампицин (50 мг/л).

Все среды автоклавировали при 0,5 атм в течение 30 мин.

Биомассу бактерий для интродукции или инокуляции выращивали в тех же, но жидких средах. Бактерии выращивали до достижения начальной стадии стационарной фазы роста (~ 24 часа для S. Typhimurium gfp и 15 часов для Е. coli 0157: Н7 gfp и P. fluorescens 32 gfp). Температура выращивания бактерий составляла 37 °C для S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157: Н7 gfp и 25 °C для Р. fluorescens 32 gfp. Клетки концентрировали центрифугированием (Backman J 6 В) при 5000 об/ мин в течение 20 мин, t° 4 — 5 °C. Биомассу отмывали один раз дистиллированной водой и ресуспендировали в дистиллированной воде.

Для интродукции в ЭКРС и инокуляции коров посевной материал выращивали в колбах объемом 250 мл со 100 мл среды на качалке при 300 об/мин и соответствующей температуре. При интродукции в ЭКРС через ~ 24 часа для S. Typhimurium gfp и 15 часов для Е. coli 0157: И7 gfp и P. fluorescens 32 gfp посевной материал переносили в 3-х литровые колбы с 900 мл среды и соответствующими антибиотиками и также культивировали до достижения начальной стадии стационарной фазы роста.

Методы учета g/^-меченых бактерий.

G/p-мсченые бактерии выявляли прямым учетом под люминесцентным микроскопом (МИКМЕД 2 ЛЮМАМ РПО 11, Санкт-Петербургское ОМО) и посевом на селективные среды с последующим освещением колоний голубым светом лампы (black-light lamp, PL-S, Philips, Eindhoven, The Netherlands).

Для учета численности g//?-бактерий навески ЭКРС весом в 1 г сырой массы разводили в 9 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивали, и делали серию разведений для учета под микроскопом и методом посева.

На предметное стекло наносили 10 мкл в трех повторностях, раздавливая каплю покровным стеклом 22×22 мм, и просчитывали от 50 до 100 полей зрения. Пересчет клеток на грамм сухого субстрата (ЭКРС, почвы или их смеси) производили по формуле: ((число клеток во всех полях зрения/число просчитанных полей зрения) * 36 482,9 [число полей зрения на одном покровном стекле] * 100 * разведение образца)/сухой вес 1 г субстрата.

При посеве на агаризованную среду на каждую чашку наносили 0,05 — 0,1 мл суспензии. Посев производили в трех повторностях. Чашки с P. fluorescens 32 gfp инкубировали при 25 °C и 37 °C — S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157: Н7 gfp в течение 4−5 дней. Флуоресцирующие колонии обнаруживали и учитывали под темно-голубым светом лампы в темной комнате. Количество колоний образующих единиц (КОЕ) пересчитывали на 1 г сухого субстрата.

Учет аборигенных микроорганизмов.

Учет аборигенов проводили посевом на среду для копиотрофных бактерий. Среда содержала 0.5 г MgS04*7H20, 0.5 г KN03, 1.3 г К2НР04*ЗН20, 0.06 г Ca (N03)2*4H20, 2.5 г глюкозы, 0.2 г гидролизата казеина и 17.0 г агара на 1 л дистиллированной воды. Олиготрофные бактерии учитывали на той же среде при уменьшении концентрации глюкозы и гидролизата казеина в 100 раз. Навески ЭКРС или смеси ЭКРС-почва весом 1 г сырой массы разводили в 9 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивали и делали серию разведений для учета методом посева. После этого 50 мкл суспензии наносили на питательную среду и инкубировали 60 ч при 28 °C, затем производили подсчет колоний и пересчитывали на 1 г сухого субстрата.

Обнаружение хищников в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Для проведения этого эксперимента уже описанным методом была получена биомасса Е. coli в одной 3-х литровой колбе. Плотность клеток в итоговой суспензии составляла 1,2 * 10 10 клеток/мл. Для обнаружения и определения численности хищников (протозоа и нематоды) в субстратах была использован метод предельных разведений: из каждого опыта отбирались пробы субстрата массой 1 г и суспендировались в 9 мл воды. Затем делали ряд разведений (1 мл из раннего разведения на 8 мл воды), и в каждую пробирку вносили по 1 мл суспензии клеток Е. coli (итоговый объем 10 мл). При наличии хищников мутная опалесцирующая жидкость в пробирках должна осветляться, а конечное разведение, в котором происходит осветление, позволяет вычислить их примерную численность. Длительность проведения эксперимента определялась временем, необходимым для развития простейших из цист и вылуплением особей нематод из яиц, которое составляет для простейших от одного до трех и более дней, а для нематод от недели до 3-х недель. В течение этого времени каждые 3−7 дней проводили микроскопирование первых трех разведений с целью обнаружения хищников с использованием объектива х20. Объем пробы 10 мкл. Просматривали всю площадь стекла, отмечая факт обнаружения искомых хищниковпри обнаружении проводился примерный подсчет их количества, которое затем пересчитывали на 1 г субстрата.

Определение водорастворимого органического углерода.

Для этого 1 г субстрата поместили в химически чистую пробирку, добавили 9 мл стерильной воды и тщательно перемешали на вортексе. Полученную суспензию фильтровали через бактериальный фильтр с размером пор 0,22 мкм. К 1,6 мл фильтрата добавили 2,4 мл раствора А. (Раствор, А готовили путем добавления 100 мл концентрированной серной кислоты к 20 мл дистиллированной воды и 1,175 г К2СГ2О7). В качестве контроля вместо фильтрата использовали дистиллированную воду. Смесь перемешивали и оставляли при 140 °C на 20 мин. Затем быстро охлаждали в ледяной бане и измеряли на спектрофотометре (фотометр КФК — 3) при длине волны 590 нм и с оптическим путем 1 см. По калибровочному графику определяли исходное количество растворенного углерода.

Для построения калибровочного графика 2,5 г глюкозы растворяют в 1 л дистиллированной воды, исходная концентрация углерода соответствует 1 г/л. Приготовляются разведения так, чтобы концентрация углерода составляла 10, 50, 100, 200, 400, 500 мкг/мл. В дальнейшем повторяется процедура, описанная выше, и строится калибровочный график.

Постановка экспериментов.

Инокуляция бактериями ЭКРС. Массу ЭКРС помещали в прочный полиэтиленовый мешок с соотношением объема ЭКРС-воздух ~ 1:5. Постепенно 200 мл бактериальной суспензии было добавлено к ЭКРС, чтобы начальная концентрация была приблизительно Ю10 кл/г сухого ЭКРС. Инокуляцию ЭКРС проводили через 4 суток инкубации в термостате при циклически меняющейся температуре. В отдельном эксперименте, другие начальные концентрации бактерий были использованы, от 105 доЮ9 КОЕ/г сух. ЭКРС. Навески ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0,7 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при температуре 18 °C. Объем суспензии подбирали таким образом, чтобы конечная влажность ЭКРС не превышала 90%.

Для учета численности g/p-меченых бактерий отбирали образцы сразу после интродукции, на следующий день, через день и далее с частотой 3−7 дней.

В отобранных образцах определяли содержание влаги, путем их высушивания при 105° С. Учет интродуцентов проводили методом прямого учета под люминисцентным микроскопом и методом посева на агаризованную среду с соответствующими антибиотиками.

Смешивание ЭКРС с почвой. Момент смешивания ЭКРС, содержащего интродуцированные бактерии с почвой, в каждом конкретном случае определяли экспериментально, а именнопосле достижения состояния популяционной плотности интродуцента (выход на «плато») в исследуемом субстрате. Как правило, это происходило в течение 2-х — 3-х недель. После этого половину содержимого горшков отбирали и смешивали с почвой в соотношении 1:6 (425 г почвы на 75 г ЭКРС), что составило в пересчете на сухой вес 1:16. Эту часть экспериментов мы называем краткосрочными. Оставшуюся часть ЭКРС продолжали инкубировать в тех же условиях, периодически определяя численность интродуцентов, а смешивание с почвой производили только через несколько недель. Эту вторую часть экспериментов мы называем долгосрочными. Влажность ЭКРС перед смешиванием с почвой составляла около 68%, влажность почвы доводили до 14%. Влажность смеси ЭКРС-почва сразу после смешивания составила около 15%.

В эксперименте с разными начальными концентрациями бактерий смешивание с почвой производили через 10 сут после инокуляции ЭКРС.

Выращивание растений кресс-салата. Семена кресс-салата (0,5 г.) высевали в горшки, содержащие смесь ЭКРС-почва с интродуцентом. Горшки закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой для сохранения водного режима и помещали под лампу дневного света. Через 5 сут, когда проростки достигали ~ 3 см длины, производили подсчет растений в каждом горшке и срезали по 30 растений (надземная часть). Срезанные растения помещали в центрифужную пробирку объемом 40 мл и заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды, плотно закрывали резиновой пробкой обернутой фольгой и энергично встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Извлеченные из пробирок с помощью пинцета растения подсушивали на фильтровальной бумаге (промокнув капельную влагу) и взвешивали сначала во влажном состоянии, а затем после высушивания до постоянного веса. Смыв с каждых 30 растений центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре, затем сливали надосадочную жидкость, а осадок ресуспендировали в 1 мл стерильной дистиллированной воды. В полученной суспензии определяли количество g^b-содержащих бактерий прямым счетом под микроскопом и посевом на селективную питательную среду.

Для выявления бактерий на корнях кресс-салата, 30 корней осторожно извлекали из почвы, аккуратно отряхивали от комочков почвы и три раза отмывали стерильной водой. Для этого корни помещали в центрифужные пробирки со стерильной дистиллированной водой, закрывали пробкой, встряхивали 30 сек на вортексе, жидкость сливали и процедуру повторяли. Отмытые корни после удаления капельной влаги взвешивали сначала во влажном состоянии, а потом после высушивания. В надосадочной жидкости определяли g/р-бактерии описанным выше способом, а количество ризосферной почвы определяли после высушивания.

Скармливание инокулированных g/^-мечеными бактериями растений кресс-салата виноградным улиткам и учет численности g/p-меченых бактерий в их экскрементах. В стерильные пластиковые горшки помещали по одной активно питающейся улитке. Улиток перед проведением экспериментов сутки не кормили. В каждый горшок вносили по 50 растений кресс-салата, срезанных в тех же горшках, в которых определяли численность бактерий в филосфере и ризосфере. Через 24 ч проводили однократный сбор экскрементов. Определяли количество колоний образующих единиц (КОЕ)/г экскрементов. Посев проводили в 3-кратной повторности. Эксперименты проведены три раза в трех повторностях.

Выращивание g/^-бактерий в суспензии комбикорма.

Для определения динамики роста бактерий в суспензии комбикорма 12 г комбикорма смешивали со 100 мл нестерильной водопроводной воды. Суспензии комбикорма инокулировали соответствующими бактериями в размере.

•у приблизительно 10 КОЕ/г сух. вещ. и инкубировали на качалке при 250 об/мин в течение 30 часов при температуре 25 °C для P. fluorescens 32 gfp и 37 °C для S. Typhimurium gfp и Е. coli 0157: Н7 gfp. В динамике отбирали пробы и производили учет КОЕ с пересчетом на грамм сухого комбикорма.

Скармливание коровам инокулированного g/^-бактериями комбикорма.

Проверку вероятности выживания бактерий при прохождении через ЖКТ коров с пищей исследовали путем скармливания им 1.5 кг предварительно «запаренного» (смесь 1 кг комбикорма с 500 г горячей воды) и охлажденного п комбикорма, содержащего 10'КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий.

Эксперимент проводили 3 раза с разными коровами, то есть всего 9 коров для каждой бактерии. Животных кормили утром, комбикорм давали в кормушки для каждой коровы. Во время проведения экспериментов не выявлено отклонений в физиологическом состоянии коров.

Мониторинг популяций g/^-бактерий в ЭКРС и смеси ЭКРС-почва.

Через 24 ч после инокуляции собирали образцы ЭКРС и учитывали в них искомые бактерии посевом на селективные питательные среды.

Для определения динамики выживания бактерий в ЭКРС навески собранных ЭКРС в количестве 500 г вносили в пластиковые емкости объемом 0.7 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при постоянной температуре +18°С.

Момент смешивания ЭКРС, содержащих тест-бактерии, с почвой определяли экспериментально, а именно после достижения квазистационарного состояния популяционной плотности интродуцентов (выход на «плато») в исследуемом субстрате.

Выращивание растений овса. Семена овса по 5 г высевали в емкости со смесью ЭКРС-почва, содержащими соответствующую тест-бактерию. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой для поддержания влажности и помещали под лампу дневного света. Через 7 сут после появления всходов производили подсчет растений в каждом горшке и срезали по 1 г растений (надземная часть растений была 5−6 см). Срезанные растения помещали в центрифужную пробирку объемом 40 мл и заливали 10 мл стерильной дистиллированной воды, плотно закрывали резиновой пробкой обернутой фольгой и энергично встряхивали на вортексе в течение 30 сек. Извлеченные из пробирок растения подсушивали на фильтровальной бумаге (промокнув капельную влагу) и взвешивали сначала во влажном состоянии, а затем после высушивания до постоянного веса. В полученной суспензии определяли количество g/р-содержащих бактерий посевом на питательную среду.

Для выявления интродуцента на корнях овса, корни осторожно извлекали из почвы, аккуратно отряхивали от комочков почвы и с 1 г смывали ризосферную почву стерильной водой. Корни помещали в центрифужные пробирки, закрывали пробкой, встряхивали 30 сек на вортексе, жидкость сливали, и процедуру повторяли. Отмытые корни после удаления капельной влаги взвешивали сначала во влажном состоянии, а потом после высушивания до постоянного веса. Ризосферную почву отделяли и определяли ее количество после высушивания. В надосадочной жидкости определяли g/р-бактерии методом посева.

Скармливание инокулированных g/p-мечеными бактериями растений овса грызунам и учет численности g/^-меченых бактерий в их экскрементах.

Для скармливания растений овса мышам и морским свинкам в стерильные пластиковые емкости помещали по три особи в эксперименте с мышами и по одной особи в эксперименте с морскими свинками. Мышей и морских свинок перед проведением экспериментов сутки не кормили. В каждую емкость вносили по 1 г растений овса, срезанных в тех же емкостях, в которых определяли численность интродуцента в филосфере и ризосфере. Через 4−5 ч проводили однократный сбор экскрементов в эксперименте с мышами и через 24 ч в эксперименте с морскими свинками. Определяли количество КОЕ/г экскрементов методом посева, который проводили в 3-кратной повторности.

Скармливание инокулированного бактериями корма курам.

Использовали «запаренный» (смесь 1 кг комбикорма с 500 г горячей воды) и охлажденный комбикорм. Комбикорм инокулировали мечеными бактериями до конечной концентрации.

10' КОЕ/г сух. комбикорма соответствующих бактерий и скармливали пяти особям кур. Сразу после скармливания кормушки убирались, а пол в помещении, где содержались куры, застилали чистой пленкой.

Определение динамики выживания бактерий в экскрементах кур. Сбор экскрементов проводили приблизительно через сутки после скармливания. В свежесобранных экскрементах сразу учитывали исследуемые бактерии и после этого подвергали их инкубации в течение 8 сут, в динамике определяя выживание бактерий. Навески экскрементов делили на три равные части в количестве 50 г и вносили в пластиковые емкости объемом 0,1 л. Емкости закрывали пищевой полиэтиленовой пленкой и инкубировали в темноте при постоянной температуре +18°С. Влажность экскрементов после сбора составляла в среднем 42%, рН 6,3.

Смешивание экскрементов кур с водой и прослеживание динамики меченых бактерий в воде. Момент смешивания экскрементов, содержащих тест-бактерии, с водой определяли экспериментально, а именно, после достижения квазистационарного состояния популяционной плотности интродуцента (выход на «плато»). Влажность экскрементов перед смешиванием с водой составляла в среднем 40%. Смешивание экскрементов с водой производили в соотношении 1:10, то есть 10 г экскрементов смешивали с 90 мл воды и инкубировали в темноте при температуре +18°С.

Статистический анализ.

Эксперименты проведены три раза в трех повторностях. Результаты представлены усредненными значениями. Сравнение выживания бактерий, в том числе в экспериментах при постоянной и циклической температурах, проводили с использованием t-теста. Статистический анализ проводили с помощью программ в Excel.