Ультраструктурное исследование пластичности клеточных элементов и межклеточных взаимодействий в трансплантатах нервной ткани
В условиях дефицита афферентных синаптических влияний в трансплантатах происходит усиление несинаптических межклеточных взаимодействий в форме протяженных щелевых контактов между соседними нейронами и астроцитами, многочисленных нейроглиальных и нейро-нейрональных коммуникаций посредствдм микропиноцитоза и особой формы микрофагоцитоза (спинулы). Для некоторых синаптических контактов (гигантские… Читать ещё >
Содержание
- 1. Актуальность проблемы
Трансплантаты эмбриональной нервной ткани являются прекрасной моделью для исследования таких фундаментальных проблем современной нейробиологии, как закономерности нейроонтогенеза, механизмы регенерации и пластичности. В отличие от культивирования in vitro трансплантация в иммунопривилегированные области дает возможность наблюдать ткань продолжительное время, соизмеримое с жизнью животного. Изучение дифференцировки нервной ткани в передней камере глаза (ПКГ) в отсутствие нормальных афферентов, эфферентных мишеней и тканевого окружения позволяет подойти к проблемам самоорганизации мозга, выявить генетически обусловленные и зависящие от внешних влияний факторы, управляющие развитием. При исследовании внутримозговых трансплантатов особенно важными являются проблемы структурной реконструкции мозга и функциональной интеграции трансплантированной эмбриональной ткани с мозгом взрослого животного-реципиента. Морфофункциональные аспекты этого обсуждены в ряде обзоров (Полежаев, 1981, 1983- Виноградова, 1984, 1990- Vinogradova, 1988, 1990, 1994- Угрюмов, 1989- Fine, 1990- Fisher, Gage, 1993- Гилерович, 1993 и др.).
Актуальность проведенного исследования определяется также тем, что метод нейротрансплантации можно использовать для восстановления нарушенных функций мозга не только в условиях экспериментальной патологии (Bjorklund, Stenevi, 1979- Freed et al., 1981- Александрова, Полежаев, 1982- Dunnett et al, 1982- Брагин и др., 1984- Отеллин и др., 1985- Лущекина и др., 1988- Victorov, Lyjin, 1990- Полежаев и др., 1993- Ермакова и др., 1996- Семченко и др., 1996 и др.- Ярыгин и др., 1997), но и в клинической медицине (Backlund et al., 1985- Lindvall et al., 1987- Кирпатовский, 1988- Spencer et al., 1992- Савельев и др., 1994- Kopyov et al., 1997 и др.- Kordower et. al- 1997). Во многом возможность включения нейротрансплантатов в интегративную деятельность мозга определяется пластическими свойствами клеточныхэлементов и межклеточных взаимодействий. Компенсаторные и адаптационные морфологические преобразования нейронов и их отростков, наблюдавшиеся еще классиками нейрогистологии при. етовой микроскопии (Cajal, 1928), анализируются современными, в > L числе, и отечественными, исследователями электронно-?фоскопически (Бабминдра, 1972- Попова, 1974- Боголепов, 1975, 'с Косицын, 1976- Манина, 1976- Артюхина, 1979- Лосева, 1982-? iob, Петухов, 1982- Мошков, 1985- Хлудова, 1997- Бабминдра и др., ^ ''%). Представляется важным выяснить, как трансплантированная яная ткань реализует свои пластические свойства при развитии и — Ьвременном функционировании в эктопическом положении.
Дальнейшая разработка проблем нейротрансплантации требует детальных морфологических изысканий для выяснения цитологической организации трансплантатов, степени воспроизведения фенотипических особенностей нервных и глиальных элементов на микро- и ультраструктурном уровне- возможности формирования синаптических взаимодействий между нервными клетками- способности нервных волокон прорастать через границу с мозгом и образовывать функциональные контакты на неадекватных клеточных мишенях- роли глиальных клеток при интеграции. Учитывая, что иммунная привилегированность мозга и, особенно, ПКГ является относительной (Kaplan, Stevens, 1975- Raju, Grogan, 1977- Брагин, Виноградова, 1981- Owens et al., 1994), необходима оценка способности нервной ткани формировать гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) в условиях трансплантации. До сих пор неясно, для нормального функционирования каких областей мозга особенно критично восстановление структурной организации- высказываются противоречивые мнения о степени специфичности устанавливаемых трансплантированными нейронами синаптических связей- неизвестны факторы, способствующие или препятствующие интеграции эмбриональной ткани с мозгом взрослого животного, компенсируется ли дефицит нормальных синаптических взаимодействий усилением нейро-нейрональных и нейроглиальных несинаптических коммуникаций.
2. Цель н задачи исследования.
Цель работы состояла в выяснении способности трансплантатов эмбриональной нервной ткани приживаться, дифференцироваться и сохраняться длительное время в ПКГ и мозге взрослых животных, в оценке степени воспроизведения морфологических особенностей и реализации пластических свойств трансплантированной нервной ткани, а также возможности ее функциональной интеграции с соседними структурами. При этом необходимо было определить значение внутренних (генетически детерминированных) и внешних (зависящих от взаимодействия с окружающей тканью) воздействий на рост, развитие и дифференцировку трансплантатов и их клеточных элементов, степень специфичности устанавливаемых синаптических связей как внутри трансплантатов, так и в мозге реципиента, а также значение несинаптических форм межклеточных взаимодействий в функционировании трансплантатов. Для этого нужно было исследовать трансплантаты областей мозга с разной цитоархитекто никой (гиппокамп, зубчатая фасция, септальные ядра, неокортекс), развивающиеся в полной изоляции от мозга (в ПКГ) или в мозге (в гомотопическом и гетеротопическом положении, при трансплантации в паренхиму и в острую полость).
Основные задачи:
1. Изучить цитоархитектонику, микроскопические и ультраструктурные особенности нервных и глиальных клеток, синаптическую организацию в полностью изолированных от мозга (развивающихся в ПКГ) трансплантатах гиппокампа и септальных ядер. Сопоставить выявленные характеристики с таковыми в аналогичных областях мозга in situ. 2. Провести качественную оценку развития нейропиля (соотношение нервных и глиальных элементов, плотность синаптических контактов, степень зрелости и др.), формирующегося в условиях отсутствия нормальных афферентов и адекватных эфферентных мишеней в интраокулярных трансплантатах. 3. Изучить возможность врастания в интраокулярные трансплантаты периферических нервных волокон из радужной оболочки и формирования ими синаптических контактов на нейронах трансплантатов. 4. Выяснить влияние возраста донорской эмбриональной ткани и возраста животного-реципиента на рост интраокулярных трансплантатов, дифференцировку и морфом етрические параметры нервных клеток. 5. Учитывая ограниченность гемато-офтальмического барьера, выяснить влияние иммунологической несовместимости донора и реципиента на приживление, рост и развитие интраокулярных трансплантатов. 6. Определить зависимость выживания тормозных ГАМКергических и не содержащих ГАМК нейронов в гомотопических (интрапаренхимальных и интракавитальных) трансплантатах неокортекса от степени интеграции с мозгом. Сравнить полученные морфометрические данные с таковыми в полностью изолированных от мозга интраокулярных трансплантатах. 7. Оценить степень воспроизведения ультраструктурных характеристик нейронов и синапсов в гетеротопических интракортикальных трансплантатах зубчатой фасции. 8. Используя уникальные морфологические характеристики гигантских синаптических окончаний зубчатой фасции, позволяющие их идентифицировать на электронно-микроскопическом уровне, определить возможность образования функциональных контактов с неадекватными постсинаптическими мишенями как в самом трансплантате, так и в соседних участках мозга реципиента. 9. Изучить компенсаторно-адаптационные пластические преобразования нейронов, нейроглиальных отношений, синаптических связей и несинаптических (в том числе, метаболических) коммуникаций в трансплантатах разных типов и в мозге реципиента. Оценить состояние долгоживущих трансплантатов. 10. Определить роль различных типов глиальных клеток в формировании поверхности трансплантатов и границы между трансплантатом и мозгом. 11. По ультраструктурным признакам оценить состояние гисто-гематического барьера капилляров интраокулярных трансплантатов, получающих кровоснабжение из радужной оболочки с помощью кровеносных сосудов периферического типа.
3. Научная новизна работы.
Работа была начата в период, когда исследования по трансплантации только начали развиваться как в нашей стране, так и зарубежом. Поэтому многие гистологические и ультраструктурные факты, полученные нами, имели приоритетный характер в момент опубликования, а некоторые сохраняют его до сих пор. Например, впервые было показано:
Наличие в интраокулярных нейротрансплантатах капилляров с разной степенью проницаемости — обладающих всеми признаками ГЭБ, со сниженными барьерными свойствами и с проницаемыми, фенестрированными сосудистыми стенками.
Трансформация периферических нервов, врастающих в интраокулярные трансплантаты из радужной оболочки, в центральные типы и формирование ими синаптических контактов с нервными элементами трансплантированной ткани.
Сохранение в трансплантатах признаков продолжающегося роста и развития нервных отростков и отдельных глиоцитов на общем фоне высокого уровня зрелости ткани, а в долгоживущих трансплантатах — одновременное присутствие ультраструктурных показателей дегенеративно-регенеративных процессов.
Усиление транспортно-метаболических коммуникаций и внесинаптических взаимодействий между нервными и глиальными клетками в условиях дефицита специфических синаптических влияний в трансплантатах, особенно в интраокулярных.
Возможность образования неспецифических синаптических контактов аксонами гранулярных клеток зубчатой фасции на нейронах неокортекса, с которым в норме эта структура не имеет связей.
В дополнительной серии экспериментов выявлена нормализация уровня сахара в моче и крови у реципиентов с аллоксановым диабетом после трансплантации эмбриональной поджелудочной железы в переднюю камеру глаза и в желудочки мозга. Приоритет этих данных подтвержден авторским свидетельством и патентом.
4. Теоретическое и практическое значение работы.
Полученные данные расширяют представления об особенностях развития и высокой пластичности нервной ткани и могут быть использованы в теоретических курсах по нейроонтогенезу, регенерации и трансплантации. Кроме того, результаты настоящего исследования важны для оценки перспектив нейротрансплантации и должны учитываться при ее клиническом использовании для восстановления поврежденных функций мозга. В частности, наши данные могут быть полезны при разработке оптимальных условий для приживления, роста и интеграции трансплантатов. Показанные нами высокая степень воспроизведения микроскопических и ультраструктурных характеристик трансплантированной ткани и образование межнейрональных связей со всеми признаками функциональных синапсов свидетельствуют о возможности использования трансплантатов в случаях, когда требуется точное восстановление структурной организации мозга. Наши результаты показывают, что возраст пациентов не является препятствием для применения трансплантационной терапии. Однако необходимо учитывать, что способность трансплантированных нейронов в отсутствие их специфических мишений устанавливать синаптические контакты на атипичных нейрональных мишенях может приводить и к нежелательным функциональным взаимодействиям. В условиях недостаточной афферентации трансплантатов или их полной изоляции могут формироваться эпилептические очаги. Для практической медицины могут быть полезными также данные о компенсации экспериментального диабета путем трансплантации эмбриональной поджелудочной железы.
5. Основные положений, выносимые на защиту.
1. Эмбриональная нервная ткань, помещенная в переднюю камеру глаза и в мозг, приживается, дифференцируется и сохраняется длительное время (соизмеримое с жизнью животного-реципиента). При этом трансплантаты воспроизводят основные микроскопические, морфомегрические и ультраструктурные особенности соответствующей области мозга.
2. Нервные и глиальные элементы в трансплантатах в целом демонстрируют высокую степень зрелости. Вместе с тем концевые отделы отдельных аксонов и дендритов, а также отдельные глиальные клетки имеют морфологические признаки незрелости или продолжающегося роста. В долгоживущих трансплантатах на уровне нервных отростков происходят параллельно идущие регенеративно-дегенеративные процессы. Некоторые нейроны и их органеллы проявляют признаки повышенной функциональной активности.
3. Возраст донорской эмбриональной ткани, возраст реципиента и принадлежность донора и реципиента к одной или разным генетическим линиям оказывают влияние на рост, развитие и цитоархитектонику трансплантатов. Степень интеграции трансплантатов с мозгом положительно коррелирует с числовой плотностью нейронов и влияет на соотношение как ГАМКергических, так и не содержащих ГАМК нейронов.
4. Нейропиль трансплантатов в целом характеризуется нормальным соотношением глиальных и нервных элементов, в том числе, и синаптических окончаний- большинство синапсов имеет типичное для исследованных структур мозга строение и распределение по сомадендритной поверхности. Нормальная плотность синаптических контактов свидетельствует об их достаточно высокой степени генетической детерминированности.
5. Вместе с тем в трансплантатах могут формироваться неспецифические синаптические контакты. Многие межнейронные связи в изолированных от мозга интраокулярных трансплантатах являются внутренними (аутентическими) или формируются врастающими из радужной оболочки периферическими нервными волокнами. В интракортикальных трансплантатах (особенно в гетеротопических) часть синапсов также образована несвойственными для нейронов афферентами.
6. Гранулярные нейроны гетеротопических интракортикальных трансплантатов зубчатой фасции формируют неспецифические синаптические контакты на атипичных клеточных мишенях самого трансплантата и соседнего неокортекса. Гигантские синапсы мшистых волокон воспроизводят свои уникальные структурные особенности, но при этом проявляют признаки усиления метаболических, регуляторных коммуникаций.
7. Недостаток адекватной афферентации в трансплантатах компенсируется усилением транспортно-метаболических и несинаптических форм межклеточных взаимодействий (микропиноцитоз, микрофагоцитоз, коммуникации через щелевые и десмосомоподобные соединения).
8. Возможность функциональной интеграции трансплантатов с соседними структурами может зависеть от клеточной организации краевой зоны. На поверхности трансплантатов т оси1о и на границе с мозгом реципиента интракортикальных трансплантатов могут формироваться зоны, препятствующие или способствующие проникновению нервных волокон. Прорастающие через границу пучки аксонов и дендритов сопровождаются отростками волокнистых астроцитов.
9. В интраокулярных трансплантатах с нормальным соотношением нервных и глиальных элементов кровеносные капилляры обладают всеми морфологическими признаками гемато-энцефалического барьера. В то же время в местах с преобладанием глиальных элементов барьерные свойства сосудистой стенки снижены, а в скоплениях клеток ретикуло-эндотелиальной системы барьер отсутствует. Нервная ткань является индуктором формирования гемато-энцефалического барьера.
6. Апробация работы и публикации.
Материалы работ по теме диссертации были доложены на: Всесоюзной конференции «Физиология и биохимия медиаторных процессов» (Москва, 1976) — Всесоюзной конференции «Метаболизм белков центральной нервной системы» (Днепропетровск, 1978) — IV Всесоюзной конференции «Память и следовые процессы» (Пущино,
1979) — Рабочем совещании «Ультраструктура нейронов и фармакологические воздействия» (Пущино, 1980) — 2-ом Рабочем совещании «Ультраструктурные исследования пластичности нейрона» (Пущино, 1982) — 1 Всесоюзном симпозиуме «Возбудимые клетки в культуре ткани» (Пущино, 1984) — 1-ом Международном симпозиуме «Transplantation in the mammalian CNS» (Лунд, Швеция, 1984) — Международном симпозиуме «Neuroontogeneticum 4» (Прага, Чехословакия, 1985) — 1-ом Рабочем совещании по трансплантации нервной ткани (Пущино, 1985) — Всесоюзной конференции «Механизмы динамической локализации и компенсации функций ЦНС» (Ереван, 1986) — XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И. П. Павлова (Кишинев, 1987) — Всесоюзном симпозиуме с международным участием «Трансплантация ткани мозга млекопитающих» (Пущино, 1988) — Third International Symposium on Neurai Transplantation (Кембридж, Великобритания, 1989) — Soviet-Indian Symposium on Neurotransplantation and Developmental Neurobiology (Пущино, 1991) — Ежегодной научной конференции
ИТЭБ РАН (1995) — Совещании российской научной школы «Роль межклеточных взаимодействий в протекании основных тканевых процессов» (Пущино, 1997- 1998).
Апробация диссертации состоялась на межлабораторном научном семинаре.
Публикации. По результатам выполненных исследований в отечественных и международных изданиях опубликовано 46 работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Большинство опытов по трансплантации было проведено на крысах породы Вистар. В основном в качестве реципиентов использовали взрослых самцов массой 200−250 г, однако при изучении возрастного фактора сравнительные эксперименты проводили на молодых (21 дн., 150 г.) и старых (18 мес., 300−400 г.) животных. Специальные эксперименты по межлинейной трансплантации были проведены на молодых и старых реципиентах инбредной линии WAG. В качестве донорского материала служили кусочки эмбрионального мозга из септальной области, гиппокампа (без зубчатой фасции), зубчатой фасции и неокортекса, взятых от 16−18 дневных (или 20 дн. для зубчатой фасции) эмбрионов, или мозга крысят первого дня после рождения. 'Большая часть трансплантатов была исследована через 3−4 мес. после пересадки, что соответствует срокам достижения тканью in situ взрослого дифференцированного состояния. Некоторые трансплантаты изучали через 6, 9, 12 и более месяцев. Всего в работе было изучено около 250 трансплантатов. Для сопоставления и сравнения морфологических результатов использовали также соответствующие структуры нормального мозга.
Методика трансплантации. В стерильных условиях самке-донору под глубоким нембуталовьш наркозом делали кесарево сечение и брали эмбрион. После промывки в растворе Игла извлекали мозг, затем в таком же растворе под стереомикроскопом выделяли эмбриональные закладки необходимых областей мозга. Трансплантацию в переднюю камеру глаза проводили под эфирным наркозом. Перед операцией реципиенту капали в глаз каплю 0.1% атропина для расширения зрачка и одну-две капли дикаина для местной анестезии. В роговице делали небольшой разрез и через него в ПКГ вводили эмбриональную ткань объемом около 1 мм³ с помощью шприца со стеклянным капилляром. Трансплантацию в мозг проводили под общим (иембутал, внутрибрюшинно, 30−40 мг/кг веса) и местным наркозом (0.5−2.0% новокаин, подкожно). Животное закрепляли в стереотаксическом аппарате. С помощью бормашины в черепе делали ответстие диаметром 2−3 мм над первичной соматосенсорной корой, снимали твердую мозговую оболочку и, используя вакуумный насос, отсасывали небольшой объем серого вещества коры. В полученную ямку помещали трансплантат и закрывали пористой кровоостанавливающей губкой. При интрапаренхимальной трансплантации эмбриональную ткань вводили в мозг реципиента с помощью микрошприца. Большинство операций по трансплантации было проведено совместно с А. Г. Брагиным.
Морфометрический анализ. Прижизненные измерения объема внутриглазных трансплантатов и определение их формы производили транскорнеально под бинокуляром, ограничивая движения животных слабым эфирным наркозом, через каждую неделю и окончательно при взятии материала для гистологического анализа. Для компьютерного анализа площадей тел и ядер пирамидных нейронов проводили микросъемку клеток на гистологических препаратах и объектмикрометра при одинаковом увеличении микроскопа (объектив 40х, окуляр 7х). Негативные изображения анализировали на вычислительном комплексе системы «Image analysis». Программа обработки, составленная В. И. Хачко, позволяла получать параметры площадей каждого поперечного сечения тела и ядра нейронов в истинных размерах (мкм2) и их средние статистические значения по каждой серии экспериментов. На основании данных строились гистограммы распределения индивидуальных размеров. Достоверность различий во всех морфометрических исследованиях оценивали по критерию Стьюдента.
Для гистологических исследований интраокулярные трансплантаты вместе с участком радужной оболочки фиксировали смесью спирта, формалина и уксусной кислоты в соотношении 17:2:1 или жидкостью Карнуа- заливали в парафин или полиэтиленгликоль с целлоидином. Гистологические срезы окрашивали крезилвиолетом по
РОССИЙСКАЯ. ГОСУДАРСТВЕННАЯ: БИБЛИОТЕКА Нисслю или раствором галлоцианина с хромовыми квасцами по Эйнарсону (Роскин, Левинсон, 1957).
Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали 2.5% раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере при рН 7.2. Дня фиксации интраокулярных трансплантатов крыс-реципиентов анестезировали эфиром, разрезали роговицу и суперфузировали фиксирующим раствором ПКГ с находящимся в ней трансплантатом в течение 20−30 мин. Животных с интракортикальными трансплантатами после предварительного введения гепарина (2500 ед. в 0.5 мл, внутрибрюшинно) под эфирным наркозом перфузировали через сердце сначала физиологическим раствором, а затем глутаровым альдегидом (30 мин.). В том и другом варианте после выделения трансплантатов их дополнительно дофиксировали погружением в тот же фиксатор (2−3 часа), разрезали на маленькие кусочки (или 500 мкм срезы) и постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия. Далее проводили стандартную обработку материала и заливку в эпон 812. Ориентацию блоков и выбор участка для ультрамикротомирования производили на полутонких срезах, окрашенных смесью метиленовой сини и буры. Срезы, полученные на ультратоме фирмы LKB, контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца. Препараты просматривали и фотографировали в электронных микроскопах Tesla BS 513, Tesla BS 613, JEM-7A и JEM-100B.
Цитохимическое выявление моноаминергических синапсов проводили с помощью хромаффинной реакции (Tranzer, Richards, 1976). Маленькие кусочки ткани фиксировали смесью равных объемов 1% раствора глутаральдегида и 0.4% раствора параформальдегида на 0.1М хромат-бихроматном буфере (рН 7.2), инкубировали в течение суток в 0.2М растворе того же буфера (рН 6.0) и дофиксировали 2% раствором четырехокиси осмия на 0.1 М хромат-бихроматном буфере (рН 7.2). Все операции проводили на холоду. Затем материал по обычной методике дегидратировали и заливали в эпон для электронно-микроскопического исследования. Контрольные эксперименты по отработке метода были проведены на хвостатом ядре мозга и надпочечнике in situ.
Иммуногистохимическое выявление ГАМКергических клеток производили после транскардиальной перфузии реципиентов фиксатором, состоящим из 2,5% параформальдегида и 1% глутаральдегида на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2). Ткань с помощью вибротома разрезали на 500 мкм срезы и дофиксировали сначала в том же растворе (12 час., 4 С), а затем в четырехокиси осмия (1,5 час., 4°С), дегидратировали и заливали в эпон 812. Иммуногистохимическое окрашивание проводили на полутонких эпоновых срезах с использованием первичных антител к ГАМК, согласно метода Somogyi et al., (1985). Реакцию и компьютерную морфометрическую обработку этого материала с помощью специализированной установки «Нфагс!
§-кагег" (определение числовой плотности и диаметра ГАМК (-) и ГАМК (-) нейронов) проводили в лаборатории проф. Й. Хамори (Венгрия, Семмелвейский университет). «Коэффициент интеграции» трансплантатов с мозгом вычисляли как отношение длины участков полного слияния (без глиапьного рубца) трансплантированной ткани и мозга реципиента к общей протяженности их гистологического контакта.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Характеристика трансплантируемой эмбриональной ткани мозга.
Исследованы эмбриональные закладки септальной области, гиппокампа и соматосенСорной коры 17−18 дневных эмбрионов крысы. Светомикроскопический анализ проведен на полутонких (1−2 мкм толщиной) срезах с образцов, залитых в эпон, после окраски метиленовым или толуидиновым синим. Во всех трех структурах ткань имеет идентичный вид. Она плотно заполнена клетками с большими округлыми или слегка вытянутыми ядрами, некоторые из которых глубоко рассечены инвагинациями ядерной мембраны. Часть клеток имеет ядра неправильной угловатой или бобовидной формы. Кариоплазма слабо базофильна, но на ее фоне четко выделяются интенсивно окрашенные контуры ядер и ядрышки, количество которых в некоторых клетках достигает 5−7 штук. Многие ядрышки располагаются по периферии ядра. Цитоплазма очень светлая, Нисслевских тел не содержит. Объем ее несколько варьирует в разных клетках.
При электронно-микроскопическом анализе эмбриональной ткани гиппокампа и септума, используемой для трансплантации, показано, что популяция нейробластов неоднородна и различается по степени дифференцировки цитоплазмы. Одни клетки имеют светлую цитоплазму с малым количеством органелп, которая узким ободком окружает ядро. Они тесно прижаты друг к другу или разделены одиночными элементами нейропиля. Другие клетки имеют более обширную цитоплазму и друг от друга отделяются значительными нейропильными зонами. Эти клетки содержат разнообразные органеллы, в том числе и микротрубочки. Синтетический аппарат клеток состоит в основном из свободных и собранных в розетки рибосом. Шероховатый эндоплазматический ретикулум развит слабо и представлен лишь отдельными цистернами. Хорошо различаются места отхождения цитоплазматических отростков, имеющих неровные контуры. Наблюдается еще одна разновидность клеток, отличающихся более электронноплотной цитоплазмой, хорошо развитым аппаратом Гольджи и содержанием многочисленных лизосом.
Нейропиль состоит из разнообразных отростков, однако большинство из них еще нельзя квалифицировать как глиальные, дендритные или аксональные. Все они имеют полупустую цитоплазму, включающую в себя какой-то волокнистый материал и отдельные вакуоли. Только в отдельных профилях можно различить микротрубочки или группы везикул, по размеру соответствующие синаптическим. Настоящих синаптических контактов не наблюдается ни на соме, ни на дендритах. Однако в отдельных случаях по характерному расположению соседних отростков можно определить начало формирования функциональной связи. Изредка обнаруживаются профили, содержащие по несколько крупных везикул с электронноплотным центром, и не имеющие специализированных контактов.
В эмбриональной ткани неокортекса произведен морфометрический анализ общей плотности клеток в 1 мм³ ткани, а также определено соотношение ГАМКергических [ГАМК (+)] и не содержащих ГАМК [ГАМК (-)] элементов. Эмбриональная ткань содержит в среднем 710 526±185 260 ГАМК (-) и 62 542±25 010 ГАМК (+) клеток, т. е. число ГАМК (+) элементов составляет 8.8% от общей клеточной популяции. ГАМК (+) клетки распределены неравномерно, их максимальная плотность наблюдается в поверхностной зоне кортикальной пластинки. По сравнению с этим во взрослом неокортексе число ГАМК (-) нейронов в 1 мм³ составляет 41 708±7816, а ГАМК (+) — 5605±1353, что соответствует 11.8% общей плотности нейронов. Далее эти показатели использованы для сравнения числовой плотности тех и других клеток в трансплантатах разных типов (см. табл. 2).
2. Развитие и дифференцировка трансплантатов эмбриональной нервной ткани в условиях изоляции от мозга — в передней камере глаза.
Для выяснения значения эндогенных и экзогенных факторов в развитии нервной ткани проводили исследование интраокулярных трансплантатов, развивающихся в полной изоляции от мозга. В этой серии экспериментов сравнивали развитие трансплантатов гиппокампа (ТГ) и септума (ТС), которые in situ имеют принципиально разную цитоархитектонику: гиппокамп — слоистая структура, с четко выявляемым слоем пирамидных нейронов- септум организован по ядерному типу, в котором мультиполярные нейроны распределены диффузно.
Приживление и общая организация трансплантатов гиппокампа и септума в ПКГ. В первые 2−3 суток после пересадки эмбриональной ткани в ПКГ наблюдается реакция глаза на трансплантат, выражающаяся в помутнении внутриглазной жидкости. Затем внутриглазная жидкость становится прозрачной- на 4−5 сутки края у трансплантатов становятся ровными и к ним начинают прорастать сосуды от радужки. Форма и размеры большинства трансплантатов стабилизируются к 1.5−3 месяцам после пересадки. Однако некоторые из них (в основном ТГ) изменяют свою форму в течение 6 месяцев. ТС имеют преимущественно округлую форму, а ТГ — вытянутую (рис.1). Некоторые ТГ удивительно напоминают форму гиппокампа крысы, развивающегося в нормальных условиях, хотя значительно меньше по размерам. У 70% ТС отношение длины к ширине равно единице, а в 92% ТГ оно достигает 2.0 и более. Различия формы ТС и ТГ статистически достоверны (р<0.01).
Рис. 1 Общий вид трансплантатов гиппокампа и септума в передней камере глаза крысы. Масштаб 2 мм.
ТГ имеют ббльшую площадь контакта с радужной оболочкой. Они всегда контактируют с ней своей вогнутой (in situ связанной с фимбрией) поверхностью, в то время как их выпуклая поверхность ориентируется в сторону роговицы. По всей границе с радужной оболочкой многочисленные кровеносные сосуды почти параллельными рядами врастают внутрь ТГ, а также оплетают его сверху. Сферические ТС обычно прикрепляются к радужке ограниченной зоной в виде соединительного стебелька, по которому в ТС врастают -2 крупных кровеносных сосуда, далее разветвляющиеся без особой ориентации.
Цитоархитектоника ТГ и ТС. Клеточный состав трансплантатов исследовали через 3−4 месяца развития в ПКГ. Распределение и соотношение нервных и глиальных клеток в ТС и ТГ различны. В ТС нейроны имеют мультиполярную форму и обычно располагаются диффузно, без какой-либо ориентации. Однако в некоторых трансплантатах выявлена отчетливая тенденция к формированию небольших плотных нейронных скоплений.
Во многих ТГ большинство нейронов имеет пирамидальную форму и образует слой, как в гиппокампе in situ. Слой клеток располагается параллельно плоскости радужки, причем пирамидные нейроны всегда ориентированы апикальными дендритами к радужке, а базальными — к роговице. Более крупные и более мелкие пирамидные нейроны, соответствующие полям СА3 и CAi гиппокампа, пространственно разделены. Однако плотность нейронов в клеточном слое значительно ниже, чем в гиппокампе in situ. Области, занятые разветвленными апикальными и базальными дендритами, содержат лишь разбросанные корзинчатые и смещенные пирамидные нейроны, которые в целом не нарушают слоистой организации ТГ. В результате этого на гистологических срезах, сделанных перпендикулярно радужке, выявляются типичные для гиппокампа цитоархитектонические слои: str. pyramidale, состоящий из тел пирамидных нейронов- str. radiatum, образованный слоями апикальных дендритов, которые затем разветвляются на первичные и вторичные ветви, формируя str. lacunosum-moleculare- базальные дендриты размещаются в str. oriens. Однако в ТГ не воссоздается str. alveus, который в нормальном гиппокампе представляет собой зону упорядочений расположенных аксонов пирамидных клеток. Нейроны, находящиеся вне слоя, имеют неправильную, многоотросчатую форму.
В обоих видах трансплантатов нейроны располагаются в более центральных частях. Плотность глиальных клеток, наоборот, несколько возрастает на периферии и снижается в облаетях, занятых нейронами.
Вся поверхность трансплантатов, обращенная в ПКГ, покрыта сплошным слоем глиальных клеток, который обычно толще в ТС. Глиальная оболочка трансплантатов соединяется с передним эпителием радужки, а если трансплантат разрастается до роговицы, то и с эпителием задней поверхности роговицы. Глиально-эпителиальное покрытие прерывается в областях прикрепления трансплантатов к радужной оболочке, где ее сосудистый слой непосредственно соединяется с трансплантированной нервной тканью.
В трансплантатах всегда присутствует незначительное количество клеток соединительной ткани — макрофаги, фибробласты, лимфоциты, зернистые и незернистые лейкоциты, тучные клетки. Они образуют небольшие агрегаты на границе с радужной оболочкой, а также в кровеносных сосудах и их периваскулярных пространствах. Единичные клетки наблюдаются в паренхиме транспланатов и в самой ПКГ.
Иммуногистохимическое выявление ГАМКергических нейронов в интраокулярных трансплантатах неокортекса. Для определения степени воспроизведения нейрохимического паттерна трансплантированной ткани проведен сравнительный количественный анализ ГАМК (+) и ГАМК (-) нейронов в трансплантатах соматосенсорной коры in oculo и соответствующей области неокортекса in situ. Иммунопозитивные нейроны обычно распределены равномерно, лишь иногда образуя небольшие скопления. Форма их перикарионов чаще овальная, хотя встречаются и мультиполярные или пирамидоподобные клетки. У многих нейронов видны отходящие ГАМК (+) отростки- большое количество таких отростков, перерезанных в разных направлениях, находится между клетками. Подсчет числа нейронов в единице объема трансплантированной ткани (1 мм3) показывает сниженное количество как ГАМК (+), так и ГАМК (-) клеток по сравнению с неокортексом in situ. Так, плотность иммунопозитивных клеток в трансплантатах равна лишь 296±96, а иммунонегативных — 33 272±5428, что соответствует 6% и 79% от нормы. Диаметр ядер ГАМКергических нейронов в интраокулярных трансплантатах составляет 11.8±2.3 мкм, а тел — 25.3±2.0 мкм, что достоверно больше, чем в интактном неокортексе (9.5±1.5 мкм и 16.7±1.6 мкм, соответственно). Увеличенные размеры в интраокулярных трансплантатах имеют также и ГАМК (-) клетки- средний диаметр их ядер, составляющий 10.4±0.6 мкм, превышает таковой в контрольном неокортексе (8.6+0.5 мкм- р<0.001).
Таким образом, морфометрический анализ показал, что в трансплантатах сомато-сенсорной коры, развивающихся в ПКГ, изолированно от мозга, плотность ГАМК (-) и особенно ГАМК (+) нейронов значительно ниже, чем в нормальном неокортексе. В то же время размеры тех и других нервных клеток гипертрофированы. Эти данные свидетельствуют о том, что при развитии нервной ткани в условиях изоляции от мозга, сопровождающимся формированием аномальных функциональных связей, происходит нарушение соотношения возбуждающих и тормозных нейронов.
3. Факторы, влияющие на морфометрические характеристики интраокулярных трансплантатов и их нейронов.
Эта серия экспериментов проведена для выявления возможных стимулирующих или угнетающих влияний на приживление, развитие и дифференцировку трансплантатов как со стороны самой эмбриональной ткани, так и со стороны организма, получающего трансплантат. Эмбриональная ткань, обладая в целом высоким содержанием нейротрофических факторов, отличается по потенциям к росту в разные возрастные периоды и в разных отделах мозга. В свою очередь, организм реципиента также оказывает трофические и гуморальные влияния, а из-за ограниченности гисто-гематических барьеров и иммунологические воздействия на трансплантат.
Влияние эмбрионального возраста трансплантируемой ткани на объем трансплантатов гиппокампа и септума. Морфометрические измерения проведены на трансплантах, развивающихся в ПКГ в течение 3−4 мес. Максимальный прирост объема ТС (400%) происходит в том случае, если он берется на 16-е сутки развития. Размеры трансплантатов из ткани, взятой на 18-е сутки эмбрионального и 1-е сутки постнатального периодов развития, меньше соответственно на 37 и 63%. Максимум прироста ТГ наблюдается при его взятии на 16-е и 18-е сутки эмбрионального развития (до 800%), но даже у трансплантатов, взятых на 1-е сутки постнатального периода, объем увеличивается на 75%. В целом в любой из исследованных сроков при одинаковом объеме исходного материала ТГ всегда больше, чем ТС. Таким образом, конечные размеры трансплантатов зависят от возраста эмбриона-донора, однако для разных структур эта зависимость, по-видимому, устанавливается в соответствии со сроками пролиферации основных клеточных элементов.