Роль структурной организации хромосом в образовании радиационно-индуцированных хромосомных аберраций

Содержание

Хромосомные аберрации (ХА) считаются одним из наиболее чувствительных индикаторов радиационно-индуцированных генетических изменений. Определение дозовых зависимостей частот хромосомных обменных аберраций (дицентриков, транслокаций) in vitro используется в биодозиметрии для оценок поглощенных доз у людей, пострадавших в результате облучения (ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители загрязненных территорий, космонавты и т. д.) [1,2,3]. Хромосомным аберрациям принадлежит, по современным представлениям, важная роль в злокачественной трансформации клеток [4]. Это связано с нарушением регуляции экспрессии генов, например, вследствие того, что активные гены в результате перестроек хромосом могут оказаться в репрессированном состоянии, удалены от регуляторных участков и/или попасть в гетерохроматиновую область хромосом. ХА могут быть использованы в качестве доклинического маркера канцерогенного риска для выявления онкологических заболеваний.

Определение частот ХА в большинстве случаев производится методом FISH для отдельных хромосом, а затем частоты пересчитываются на геном [5]. При пересчете частот ХА с одной хромосомы на геном предполагается, что вероятность участия хромосом в обменных перестройках пропорциональна количественному содержанию в них ДНК. К настоящему времени накопилось достаточно данных, не согласующихся с этим предположением, что указывает на необходимость исследования механизмов образования ХА, в том числе для объяснения причин неслучайного участия хромосом в обменных перестройках.

Механизмы образования ХА являлись объектом исследования с самого начала развития радиационной цитогенетики. В 1929 году Серебровским была выдвинута гипотеза о механизме образования аберраций «предсуществовавшего контакта» (contact-first) [6]. Согласно этой гипотезе, необходимым условием образования аберрации с участием двух хромосом является контакт этих хромосом в момент облучения. В 1931 году Стэдлером была предложена противоположная концепция, согласно которой сначала под действием радиации образуются разрывы хромосом, а после этого они приходят в контакт и образуют аберрацию (breakage-first)

7].

Эксперименты, выполненные на традесканции в конце 30-х — начале 40-х годов [8,9,10], послужили базисом для создания теории разрывов и воссоединений (Breakage and Reunion). Математический аппарат был создан Ли [11]. Согласно теории разрывов и воссоединений, первичным эффектом действия радиации является разрыв хроматиды (т.н. «первичный разрыв») с образованием свободных концов, которые могут свободно мигрировать в пространстве ядра. Далее возможны три варианта. 1) Концы воссоединяются, образуя неповрежденную хромосому. 2) Если на некотором расстоянии от данного первичного разрыва образовался второй, образовавшиеся свободные концы могут свободно взаимодействовать, образовывая ХА. 3) Часть первичных разрывов могут не восстановиться и не взаимодействовать с другими. Хромосома остается разорванной- при подсчете аберраций в метафазе оставшийся ацентрический фрагмент виден как терминальная делеция.

Первым вариантом теории разрывов и воссоединений является модель «случайных разрывов и воссоединений» (Random Breakage and Reunion) [11]. Согласно этой модели, разрывы распределены случайно по длине хромосомы, и взаимодействие любых двух свободных концов равновероятно, независимо от расстояния между ними в момент их образования и других факторов. На основе модели случайных разрывов и воссоединений была разработана система CAB, позволяющая предсказывать типы и частоты межхромосомных [12] и внутрихромосомных [13] аберраций в зависимости от числа поврежденных хромосом, хромосомных плеч и числа разрывов на этих хромосомах (аббревиатура CAB означает Chromosomes/Arms/Breaks). Количественные предсказания системы CAB основаны а) на равновероятности всех взаимодействий (как правильных, так и неправильных) — б) на пренебрежении вероятностью невзаимодействия двух или большего числа разрывов, т. е. образованием неполных обменов.

Альтернатива теории разрывов и воссоединений, «обменная теория» (Exchange theory), была предложена в 1955 году Ревеллом [14]. В основе обменной теории Ревелла лежат следующие постулаты. 1) Первичным эффектом ионизирующей радиации является не разрыв хроматиды, а нестабильное повреждение (природа которого была не определена) с ограниченным временем жизни. Если поблизости отсутствуют другие повреждения, то данное повреждение исчезнет. При этом никогда не образуются разрывы, наблюдаемые как терминальные делеции. 2) Если, прежде чем исчезнуть со временем, два повреждения окажутся поблизости друг от друга, они могут вступить в обмен, в результате которого образуется аберрация. Взаимодействия повреждений в обменной теории строго парные. 3) Обмен может произойти не до конца, вследствие чего образуется неполная аберрация. Такие аберрации, как правило, наблюдаются как терминальные делеции.

Обобщенной теорией, позволяющей объяснить многие биологические эффекты радиации, в том числе ХА, является теория дуального действия радиации [15]. Согласно этой теории, эффект обусловлен взаимодействием двух первичных повреждений, образованных в чувствительном объеме. Теория не конкретизирует ни природы повреждений, ни что собой представляет чувствительный объем- предполагается, что повреждения образуются с вероятностью, пропорциональной энерговыделению в объеме, и взаимодействуют случайным образом, т. е. вероятность взаимодействия пропорциональна квадрату величины энерговыделения. На основе этих предположений была выведена линейно-квадратичная зависимость эффекта от дозы, причем линейная компонента определяется взаимодействием повреждений, образованных одним треком, а квадратичная — разными треками. Теория дуального действия не противоречит ни теории разрывов и воссоединений, ни обменной- она обеспечивает математический формализм, позволяющий описывать дозовые зависимости частот ХА на базе как одной, так и другой теории, в предположении о случайности взаимодействий.

При создании теории разрывов и воссоединений и обменной теории не было известно, что собой представляют первичные повреждения. В дальнейшем было предположено (и на сегодняшний день является общепризнанным), что основным повреждением ДНК, ведущим к образованию ХА, являются двунитевые разрывы (ДР) ДНК, и аберрации образуются вследствие ошибочной репарации ДР [16,17,18]. Чедвик и Линхаутс [19] предположили, что для образования обмена необходим лишь один ДР ДНК (чем их теория принципиально отличается от двух предыдущих, согласно которым повреждений обязательно должно быть как минимум два). Этот ДР репарируется на неповрежденной матрице, обладающей микрогомологией с поврежденным участком, по механизму рекомбинации, предложенному Резником [20]. В процессе репарации на неповрежденной матрице образуется т.н. энзиматический ДР- затем в случае ошибочной репарации эти два ДР взаимодействуют с образованием ХА. Эта теория (получившая название «молекулярная теория») позволяет объяснить некоторые факты, не укладывающиеся в рамки теории разрывов и воссоединений и обменной теории, в частности линейную форму дозовых кривых простых ХА, образующихся при действии сверхмягких рентгеновских лучей [21]. Согласно теории дуального 5 новских лучей [21]. Согласно теории дуального действия, линейная форма дозовых кривых объясняется преобладанием внутритрековых взаимодействий повреждений над межтрековыми- однако треки сверхмягких рентгеновских лучей в ткани имеют длину порядка 7 нм, и вероятность образования более чем одного ДР одним треком представляется незначительной.

В то же время молекулярная теория имеет ряд недостатков. Согласно ей, все простые ХА (т.е. образованные одним взаимодействием, одним ДР ДНК) должны образовываться с частотой, пропорциональной дозе, что не всегда верно (например, [22]). Кроме того, репарация по механизму гомологичной рекомбинации, необходимая, согласно молекулярной теории, для образования ХА, в клетках эукариот происходит преимущественно в G2 фазе клеточного цикла [23]. В Go/Gi фазе, где и образуются ХА, преобладает репарация по механизму негомологичного воссоединения концов (Non-Homologous End Joining, NHEJ), которая, по современным представлениям, не требует наличия неповрежденной матрицы для репарации [23,24].

Основываясь на том, что, согласно наблюдениям, ХА образуются в транскрипционно-активных областях хроматина чаще, чем в транскрип-ционно-неактивных [25,26,27], Рэдфорд предложил механизм образования ХА, ассоциированный с транскрипцией [28]. Он предположил, что ДНК-топоизомераза I, входящая в состав транскрипционной фабрики, задерживает ДР на центре транскрипции [29], после чего комплекс ДНК-топоизомеразы I с ДР взаимодействует с участком неповрежденной молекулы ДНК, находящейся на том же центре.

К сожалению, эта модель оставляет неясным вопрос, как происходит образование ХА в транскрипционно-неактивном хроматине. Кроме того, хотя в модели постулируется взаимодействие поврежденного участка ДНК с неповрежденным, взаимодействие двух поврежденных участков в рамках предложенного механизма также возможно.

Развитие представлений о механизмах образования ХА тесно связано с развитием экспериментальных методов исследования ХА. До конца 80-х годов XX века основным методом изучения ХА являлось однородное окрашивание хромосом плюс фиксация метафаз с помощью колхицина спустя определенное время после облучения. Этот метод позволяет наблюдать лишь некоторые типы ХА: дицентрики (а также мультицентри-ки), кольца, ацентрические фрагменты. Другие типы простых (инверсии, транслокации) и комплексных (инсерции и др.) ХА с помощью этого метода не видны. Кроме того, поскольку все хромосомы окрашиваются одним цветом, нельзя различать ХА, образованные более чем двумя хромосомами (за исключением трицентриков) и, соответственно, исследовать относительное вовлечение тех или иных хромосом в образование ХА. Как следствие этого ограничения, все теории образования ХА, существовавшие в то время (теория разрывов и воссоединений, обменная теория, теория дуального действия), подразумевали взаимодействие двух повреждений при образовании аберрации и не рассматривали возможность более сложных взаимодействий.

Несмотря на низкую информативность окрашивания хромосом с помощью Giemsa, в исследованиях, не требующих детальной информации о типах и частотах ХА, этот метод часто применяется до сих пор. Так, для исследования зависимости частот ХА от временного интервала между облучением и подсчетом ХА в настоящее время используется методика FPG (fluorescence plus Giemsa) с одновременным мечением хромосом бромде-зоксиуридином (BrdU) [30].

В 80-х годах был разработан метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), позволяющий метить флюоресцентным красителем отдельные хромосомы или участки хромосом [31]. Появление метода FISH позволило наблюдать аберрации, которые невозможно было детектировать ранее: транслокации, а также сложные (комплексные) ХА с участием меченой хромосомы. Именно с появлением метода FISH были сформированы представления о комплексных аберрациях [32,33] и впервые поставлен вопрос о механизмах их образования.

Стандартный метод FISH с окрашиванием отдельных хромосом, однако, давал ряд неопределенностей. Во-первых, он позволял наблюдать ХА только с участием меченых хромосом, причем только межхромосомные. Во-вторых, в случае комплексной ХА не было однозначного соответствия между типом аберрации и ее экспериментально наблюдаемым проявлением. Так, в работе [12] было продемонстрировано, что одна и та же ХА с участием трех хромосом может выглядеть в эксперименте по-разному в зависимости от того, какая из этих трех хромосом была окрашена- в свою очередь, одна и та же экспериментальная картина может соответствовать разным типам ХА.

Отчасти эти неопределенности были сняты с появлением в 2001 году метода FISH с одновременным окрашиванием всех хромосом (mFISH) [34]. Поскольку все пары хромосом окрашены в индивидуальные цвета, проблема различного визуального представления одних и тех же аберраций была в значительной мере снята (не полностью, т.к. гомологичные хромосомы по-прежнему окрашены одинаково). В то же время неопределенность, связанная с тем, что одна и та же экспериментально наблюдаемая картина может быть вызвана различными типами ХА, по-прежнему осталась, что было продемонстрировано в работах [34,35].

Все вышеприведенные методы не позволяют детектировать существенную часть внутрихромосомных аберраций — инверсии, комплексные аберрации. Первый (и до недавнего времени — наиболее точный) метод, нацеленный на детекцию внктрихромосомных перестроек — разработанный в 1996 году метод CAP-FISH (Chromosome Arm Painting FISH) [36]. В этом методе осуществляется дифференциальное окрашивание обоих плеч и одной хромосомы и центромеров всех хромосом. Метод CAP-FISH позволяет детектировать межплечевые внутрихромосомные перестройки (как простые, так и комплексные) и благодаря этому получать значительно больше информации о внутрихромосомных аберрациях, чем предыдущие методы. В то же время внутриплечевые перестройки (инверсии) детектировать этим методом по-прежнему невозможно.

Наиболее современным методом детекции внутрихромосомных аберраций является метод mBAND [37]. В этом методе осуществляется дифференциальное окрашивание всех бендов (полос) индивидуальной хромосомы, что позволяет не только детектировать все внутрихромосомные перестройки (за исключением самых маленьких, в пределах одного бенда), но и с большой точностью определять, по каким участкам хромосом эти перестройки произошли. К сожалению, в настоящее время этот метод не получил распространения в силу дороговизны.

Появление новых методов экспериментального исследования ХА приводит к получению информации, недоступной ранее. Это, в свою очередь, часто приводит к необходимости пересмотра существовавших представлений о механизмах образования ХА. В частности, внедрение метода mFISH позволило обнаружить, что частоты комплексных ХА намного выше, чем предполагалось ранее [22]. Все существовавшие на тот момент теории образования ХА не могут объяснить столь высокие частоты и сложность межхромосомных комплексных обменов. Следовательно, необходимо предложить новый механизм образования ХА (как простых, так и комплексных), позволяющий объяснить весь комплекс имеющихся данных.

Независимо от того, какая из теорий образования ХА верна, для образования обменных аберраций требуются контакты поврежденных участков хромосом (или поврежденного с неповрежденным) либо в момент облучения, либо со временем после него. Поэтому одной из важнейших проблем при изучении ХА является проблема внутри- и межхромосомных контактов. Это приводит к необходимости учета структуры и динамики хромосом в интерфазном ядре, что было принципиально невозможно на основе всех существующих на сегодняшний день моделей образования ХА.

О важной роли крупномасштабной структуры хромосом и их упаковки в интерфазном ядре при образовании ХА свидетельствует ряд фактов. Межплечевые внутрихромосомные обменные аберрации в хромосоме 1 лимфоцитов человека образуются в 7.4 раза чаще (рентгеновское излучение в дозе 3 Гр), чем предполагается на основе случайных взаимодействий повреждений (в модели случайных взаимодействий вероятность участия повреждения в обмене не зависит от того, где находится это повреждение, т. е. без учета структуры хромосом) [38]. Соотношение между частотами ацентрических фрагментов и центрических колец составляет 5−12 (в зависимости от типов клеток и качества излучения), что существенно выше, чем предсказывает модель случайных взаимодействий (около 2.5) [39]. Распределение точек (мишеней), участвующих в обменных аберрациях (breakpoints), неслучайно по длине хромосомы- R-бенды хромосом (богатые генами) участвуют в обменах чаще, чем G-бенды (содержащие мало генов) [25,26,27]. Частота образования дицентриков при у-облучении лимфоцитов в Gi-фазе выше, чем в Go, где хроматин более конденсирован [26].

В 90-х годах было предположено, что роль структуры хромосомы в образовании ХА сводится к т.н. «эффекту близости» (proximity effect). Суть эффекта близости заключается в том, что повреждения (в терминах обменной теории) или свободные концы (в терминах теории разрывов и воссоединений), образовавшиеся поблизости друг от друга, должны взаимодействовать с большей вероятностью, чем образовавшиеся на большом расстоянии [40]. В работах [39,41] влияние эффекта близости на выход внутрихромосомных аберраций было вычислено на базе теории разрывов и воссоединений для хромосом, имеющих структуру идеального гауссова клубка. Было показано, что учет эффекта близости приводит к увеличению соотношения частот ацентрических фрагментов и центрических колец с 2.5 (рассчитанного для случайных взаимодействий) до примерно 33.5, что, однако, по-прежнему меньше экспериментально наблюдаемых величин. Есть и другие факты, ставящие под сомнение применимость представлений об интерфазной хромосоме как о полимерном клубке. Так, экспериментально было показано, что хромосомные территории в интерфазном ядре практически не перекрываются [42]. Деконденсированное состояние интерфазных хромосом (состояние клубка) приводит либо к сильно перекрывающимся хромосомным территориям, либо к очень большим размерам клеточных ядер.

В 80-х годах было сформировано представление о физических принципах организации интерфазной хромосомы в виде полимерной глобулы [43,44,45]. Позже было показано, что концепция глобулярной структуры интерфазных хромосом согласуется с рядом экспериментальных данных, полученных с помощью лазерной конфокальной микроскопии, как качественных (морфология хромосом), так и количественных (распределение расстояний между флюоресцентными зондами на хромосоме) [46].

Данная работа представляет собой первую попытку исследовать влияние крупномасштабной структуры интерфазных хромосом на образование ХА с использованием информации о структуре (в частности о внутри- и межхромосомных контактах), полученной методами статистической физики полимеров. Для этого необходимо в первую очередь разработать методы биофизического моделирования образования ХА, позволяющие проводить компьютерные эксперименты по измерению количественных характеристик ХА для различных структур хромосом и различных механизмов образования ХА, воспроизводя различные экспериментальные методы детекции ХА (в первую очередь CAP-FISH, mFISH).