Особенности апоптоза и его регуляция в различных опухолевых клетках человека

Актуальность проблемы. Апоптоз представляет собой программированный процесс гибели клетки, с помощью которого многоклеточный организм без повреждения окружающих тканей освобождается от ненужных и поврежденных клеток. Поэтому апоптоз играет важную роль в регуляции эмбрионального развития и поддержания гомеостаза тканей. Нарушение регуляции апоптоза в различных тканях приводит к тяжелым патологическим последствиям. В частности, ингибирование процессов апоптоза лежит в основе злокачественной трансформации клеток и в возникновении опухолей невосприимчивых к химиотерапевтическим препаратам, так как практически все известные препараты вызывают гибель опухолевых клеток через индукцию апоптоза.

В процессе апоптоза происходят сложные морфологические и биохимические изменения: уменьшение объема клетки, вакуулизация цитоплазмы, конденсация хроматина и фрагментация ядра (Kerr, Will, 1972). Условно выделяют три стадии апоптоза. Первая фаза — фаза индукции — связана с передачей сигнала и активацией каспаз. Следующая фазафаза разрушения — представляет собой последовательность событий, приводящих к деструкции клеточного аппарата. Фаза элиминации связана с удалением апоптотических клеток макрофагами или клетками окружающих тканей. Апоптоз может быть блокирован при участии белков семейства Вс1−2 на стадиях, предшествующих активации каспаз и кроме того, семейством ингибирующих апоптоз белков (IAP) после их активации. Семейство Вс1−2 состоит из антиапоптотических белков, таких как Вс1−2 и Вс1-Х1, и проапоптотических, таких как Вах и Вак и др. и насчитывает более 25 членов. Члены этого семейства способны образовывать гомои гетеродимеры, что регулирует их активность наряду с процессами фосфорилирования. Усиление активности проапоптотических белков в клетке приводит к индукции апоптоза, гиперэкспрессия антиапоптотических белков блокирует этот процесс. Вс1−2 является наиболее хорошо изученным среди названных выше белков. Открытие гена 5.

Ьс1−2 связано с обнаружением хромосомной транслокацией (14ql8q) в клетках фолликулярной лимфомы, которая сопровождалась гиперэкспрессией этого белка (Твирп^о У., Сгосе С. 1986). Вс1−2 экспрессируется в клетках-предшественниках костного мозга и зрелых В-лимфоцитах, но его уровень в В-клеточных опухолевых линиях изучен недостаточно. Молекулярная масса Вс1−2 составляет 26 кДа. Он локализован в мембранах митохондрий, эндоплазматического ретикулума и ядра клетки. Согласно различным экспериментальным данным, Вс1−2 может действовать как антиоксидант, регулировать транспорт ионов и блокировать открытие пор в митохондриях, ингибируя тем самым развитие ранних стадий апоптоза до момента активации каспаз.

Уровень экспрессии Вс1−2 в опухолевых клетках может в значительной мере предопределять их высоко резистентный или высокочувствительный фенотип. Поэтому актуальной задачей является изучение прогностической значимости уровня экспрессии Вс1−2 в клетках для выбора стратегии химиотерапии и разработка возможных подходов по преодолению лекарственной устойчивости, обусловленной гиперэкспрессией Вс1−2.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение уровня экспрессии Вс1−2 в опухолевых клетках различных В-клеточных линий человека для оценки его значимости в формировании лекарственной устойчивости и поиск путей ее преодоления.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: сравнить и выбрать наиболее адекватные методы детекции апоптоза в зависимости от особенностей этого процесса в различных клеточных линиях- - исследовать уровень экспрессии гена Ьс1−2 в различных В-клеточных линиях человекаизучить взаимосвязь уровня индукции апоптоза с уровнем экспрессии Вс1−2 в различных В-клеточных линиях человека- 6.

— исследовать устойчивость В-клеточных линий человека с разным уровнем экспрессии Вс1−2 к препаратам с различным механизмом действияисследовать устойчивость опухолевых клеток к цитотоксическим препаратам после трансфекции гена bcl-2- исследовать возможность снижения устойчивости опухолевых клеток человека с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к гену bcl-2- разработать методические рекомендации для определения уровня экспрессии Bcl-2 в биопсиях опухолей человека. Научная новизна работы. Впервые обнаружена корреляция устойчивости опухолевых клеток В-клеточных линий человека к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия, таким как этопозид, доксорубицин и митомицин с уровнем экспрессии Bcl-2, и отсутствие такой корреляции устойчивости клеток к препаратам, таким как винкристин, винбластин, таксол — препаратам, ингибирующим митоз, действие которых направлено на инактивацию веретена деления.

Впервые обнаружена корреляция продолжительности клеточного цикла В-клеточных линий с уровнем экспрессии Bcl-2, а также ингибирование скорости пролиферации клеток после трансфекции гена bcl-2.

Полученные данные позволили оценить прогностическую значимость уровня экспрессии Bcl-2 для выбора схемы химиотерапии и разработать практические рекомендации по определению этого белка в биопсийном материале с помощью RT-PCR и Western blot анализа.

Практическая значимость. На основе полученных данных разработаны методические рекомендации для определения уровня экспрессии Bcl-2 в биопсийном материале опухолей и рекомендации по выбору противоопухолевых препаратов для лечения опухолей с высоким уровнем экспрессии Bcl-2. 7.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной школе молодых ученых «Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации: от мембранных рецепторов к транскрипционным факторам» (1998, Греция) — на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функция клеточного ядра» (1999, Санкт-Петербург) — на школе молодых ученых «Горизонты физико-химической биологии» (2000, Пущино) — на Международной школе молодых ученых «Белковые модули в клеточной сигнализации» (2000, Франция) — на Международной научной конференции «Сигнальные нейропептиды и конформация макромолекул» (2000, Москва) — на совместном семинаре ВНЦМДЛ и МНИМЭ (12 октября 2000). 8.

Заключение

.

Резюмируя полученные результаты, хочется остановиться на особенностях проявления апоптоза в опухолевых клетках. Прежде всего, следует еще раз отметить, что даже в клеточных линиях, имеющих общее происхождение — в В-клеточных линиях — они крайне разнообразны. Так, сравнивая две линии, полученные от больных лимфомой Беркитта — Raji и Namalva, и две линии, полученные от больных миеломной болезнью — IM9 и U266BL — необходимо отметь, что даже В-клеточные линии, полученные от больных с одним и тем же заболеванием, различались по характеру фрагментации ДНК в процессе апоптоза: в апоптотических клетках линии Namalva и IM9 наблюдалась типичная.

93 межнуклеосомная фрагментация ДНК, а в клетках линий Raji и U266BL она отсутствовала, также, как она отсутствовала в обеих линиях, полученных при трансформации В-лимфоцитов периферической крови EBV. Следует отметить, что такое событие апоптоза, как деградация ДНК до межнуклеосомных фрагментов рассматривается многими авторами как один из наиболее типичных признаков апоптоза и его предлагают использовать для идентификации апоптоза, т.к. этот процесс легко регистрируется по накоплению низкомолекулярных фрагментов ДНК размером 180 п.о. и кратных (х2, хЗ и т. д.) этой величине фрагментов, образующихся под действием эндогенных эндонуклеаз [179, 180], в то время, как на ранних стадиях апоптоза (в течение 30 мин — 4 часов после индуцирующего воздействия) образуются гораздо более крупные фрагменты ДНК размером 50 — 300 т.п.о. [179, 180, 182, 32].

В то же время в литературе уже накоплено достаточное количество наблюдений, когда апоптоз в различных клетках не сопровождался накоплением межнуклеосомных фрагментов ДНК, а удавалось зарегистрировать либо только крупные фрагменты ДНК [180, 181], либо появление однонитевых разрывов в ДНК [179, 32]. По-видимому, образование межнуклеосомных фрагментов ДНК, которые до последнего времени было принято считать одним из характерных признаков апоптоза, в значительной мере определяется наличием в клетке специфических нуклеаз или соотношением ингибитора и нуклеазы, или активностью каспазы 3, которая вызывает расщепление ингибитора специфической эндонуклеазы (см. обзор литературы). Этот терминальный этап апоптоза, как следует из полученных результатов, может существенно варьировать при злокачественной трансформации В-лимфоцитов как под действием EBV, так и под действием канцерогенных факторов иной природы (миеломная болезнь). Поэтому межнуклеосомная фрагментация ДНК может использоваться для регистрации апоптоза только в тех клетках или тканях, которые генетически способны осуществлять этот процесс.

Значительные различия обнаружены также для различных В-клеточных линий в точках контроля клеточного цикла, что также может приводить, как показано в нашей работе, к неадекватному количественному определению доли клеток в состоянии апоптоза в тех случаях, когда имеет место блок клеточного цикла в Sи 02/М-фазах, а идентификация апоптотических клеток ведется по доле клеток, содержащих гиподиплоидное количество ДНК. Поэтому при наличии блока клеточного цикла в Sи вг/М-фазах для количественного определения апоптотических клеток целесообразно использовать морфологический метод или сочетание разных методов, но не те, методы, которые основаны на оценке доли клеток, содержащих гиподиплоидный набор ДНК.

Среди исследованных нами клеточных линий только в клетках линии IM9 наблюдали блок клеточного цикла уже в фазе Go/Gi и развитие апоптоза в течение нескольких часов после воздействия. Это позволяет полагать, что в клетках этой линии активен белок р53. В то же время в остальных исследованных линиях наблюдали блок клеточного цикла в Sи Ог/М-фазах и развитие апоптоза только через 24 или даже 48 часов после воздействия. По-видимому, в этих клеточных линиях белок р53 отсутствует или имеет место мутантная форма этого белка.

Весьма неожиданным оказался диапазон колебаний уровня белка Вс1−2 в исследованных В-клеточных линиях и его полное отсутствие в двух из исследованных линий. При этом довольно близкое содержание белка Вс1−2 обнаружено в обеих линия, полученных от больных лимфомой Беркитта. В то же время при трансформации лимфоцитов периферической крови одна из полученных линий — МК — не содержала белка Вс1−2 (или содержала крайне низкое его количество), а другая содержала очень высокий уровень этого белка — линия 35. Аналогичные данные получены и при анализе содержания белка Вс1−2 в клетках, полученных от больных с миеломной болезнью — линия IM9 не содержала белка Вс1−2, а линия U266BL содержала самое большое его количество по.

95 сравнению с другими исследованными клеточными линиями. При этом четко прослеживается корреляция устойчивости клеточных линий к таким препаратам как этопозид, доксорубицин, митомицин с уровнем белка Вс1−2 — клеточные линии с высоким содержанием белка Вс1−2 однозначно устойчивы к действию цитотоксических препаратов. В то же время клетки, в которых белок Вс1−2 отсутствует — МК и 1М9 — могут быть либо чрезвычайно чувствительны к любым повреждающим воздействия, как линия 1М9, либо оставаться высоко устойчивыми, как линия МК. Высокая устойчивость линии МК, по-видимому, определяется другими (одним или несколькими) механизмами, определяющими лекарственную устойчивость клеток. Это может быть высокий уровень экспрессии гена тс1г1, других антиапоптотических белков семейства Вс1−2, например, Вс1-Хь, белка, получившего название «зшлфлп», или белков семейства 1АР. Кроме того, нельзя исключить возможность быстрой индукции этого белка при действии цитотоксических препаратов в случае клеточной линии МК, т.к. в клетках этой линии, в отличие от линии 1М9, регистрируется мРНК Вс1−2. Таким образом, низкий уровень содержания белка Вс1−2 не предопределяет высокую чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам, но трансфекция таких клеток геном Ьс1−2 однозначно приводит к повышению их устойчивости к цитотоксическим воздействиям. Сказанное выше свидетельствует о необходимости включения исследования уровня белка Вс1−2 в биопсийном материале опухолей для выбора адекватной схемы лечения. Поэтому в качестве приложения к представленной работе, основываясь на полученных результатах, мы разработали методические рекомендации по определению белка Вс1−2 в биопсийном материале с помощью иммуноблоттинга, в которых мы рекомендуем в качестве стандарта использовать полученные нами данные о содержании этого белка в клетках исследованных линий. Это, с нашей точки зрения, позволит более правильно дифференцировать низкий и высокий уровень этого белка в ткани, и, соответственно, дифференцированно выбирать схему противоопухолевой терапии. Для.

96 этого, с нашей точки зрения, весьма полезными представляются полученные нами данные об отсутствии корреляции устойчивости клеток с высоким уровнем экспрессии белка Вс1−2 к винкристину, винбластину и таксолу. Уже сейчас можно полагать целесообразным включение этих препаратов в схему терапии опухолей с высоким содержанием белка Вс1−2. В последующем, после проведения доклинических испытаний, для этих целей, по-видимому, можно будет дополнительно рекомендовать включение терапии, основанной на подавлении экспрессии гена Ьс1−2 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов к этому гену. Таким образом, особенности апоптоза и его регуляции в клетках опухоли следует всесторонне учитывать в каждом индивидуальном случае и столь же индивидуально, с учетом выявляемых особенностей, разрабатывать стратегию химиотерапии для каждого конкретного больного.