Тяжелая форма печеночной недостаточности (ТГШ) является одним из грозных осложнений многих заболеваний (перитонита, хронического гепатита, цирроза печени, механической желтухи и др.). Так, по данным ВОЗ, общая смертность от хронической печеночной недостаточности занимает 5-е место в мире среди других нозологии, смертность от острой печеночной недостаточности (ОПН) достигается 80%, и даже 100% при фулминантном течении ОПН (Гальперин Э.И. и др., 1978, В. И. Шумаков и др., 1981, 1990).
Эффективность лечения ТПН, несмотря на совершенствование терапевтических и хирургических (гемосорбция, лимфосорбция, плазмаферез) методов ее лечения все еще остается неудовлетворительной.
Не получили широкого применения и методы временного органозамещающего подключения аллогенных гепатоцитов и гетеротоиического подключения печени (Э.И. Гальперин и др., 1978 г., Ю. М. Лопухин, М. С. Маргулис и др., 1984 г.). Малоэффективными оказались установки плазмообмена и гемоперфузии без подключения к ним биологически активных клеток при ТПН (B.C. Репин, Г. Т. Сухих, 1998).
Пересадка гистосовместимой донорской печени, которая стала клинической реальностью в развитых странах мира является единственным радикальным методом лечения этих больных. Однако из-за большого дефицита донорских органов, чрезвычайно высокой себестоимости самой операции, сложности и травматичности операции, трансплантация печени остается эксклюзивным методом лечения больных с печеночной недостаточностью. Лишь 1/10 часть больных нуждающихся в пересадке печени, подвергается спасительной операции в США, а остальные больные умирают без адекватной хирургической помощи из-за отсутствия донорского органа (B.Moden, O. Shpilerg, 1995).
В связи с этим, поиск более эффективных и экономически доступных методов лечения ТПН остается чрезвычайно актуальным и сегодня.
Альтернативным методом лечения ТПН является трансплантация фетальных гепатоцитов, которые способны активизировать регенерацию поврежденной печени, стимулировать заместительную функцию, сохранившихся клеток печени в организме реципиента, и соответственно улучшать функцию печени.
В 1994 впервые индийские хирурги (С.М Habibullah и др, 1994) успешно имплантировали культуру фетальных аллогенных гепатоцитов пациенту с летальной формой ТПН, а в 1997 году американские хирургии (Strom S. C et.al., 1997), также провели лечение больных с ТПН, трансплантацией фетальных гепатоцитов в селезенку.
Несмотря на позитивные результаты применения клеток фетальной печени, работы, в которых анализируется клинический опыт трансплантации аллогенных фетальных гепатоцитов при ТПН у хирургических больных, малочисленны (N.Matsumura и др., 1987, И. М. Шадин, 1993, В. В. Сачко, 1993, В. И. Шумаков, Н. А. Онищенко, 1994, А. М. Велигоцкий, 1994, В. С. Репин, Г. Т. Сухих, 1998, В. И. Кулаков, Т. Сухих, 1998, А. Я. Величко с соавт., 2005).
Мы полагаем, что это в значительной степени связано с имеющимися этическими проблемами использования абортного фетального материала — главного источника получения клеток фетальной печени.
Поскольку фетальная печень 8−12 недель гестации содержит не более 1% дифференцированных гепатоцитов, а основную массу клеток составляют стволовые и бластные клетки гемопоэтического ряда, то можно полагать что позитивный эффект от трансплантации клеток фетальной печени обусловлен индукционным механизмом, т. е. связан с продукцией этими клетками регуляторных пептидов и ростостимулирующих факторов, которые и способствуют реализации восстановительных процессов в поврежденной печени.
Для избежания этических проблем использования тканей и органов плода в клинической медицине, мы считали важным для целей регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах изучить возможность восстановительной индукции репаративных процессов в печени с помощью околоплодных тканей, в частности хориона, который для плода выполняет функцию плаценты на ранних сроках гестации (5−12 нед) и который выделяет чрезвычайно богатый арсенал биологически активных веществ (Маркушев В.М., 1970, Мингазов Г. Г., 1988, Рябчиков О. П. с соавт., 1998), которые могли бы способствовать активной регенерации поврежденной печени.
Однако вопрос использования клеток хориона в медицине остается практически не изученным, т.к. такие исследования единичны. Кроме того, в медицине обычно используются свежевыделенные культуры клеток, в том числе клеток фетальной печени, тогда как в клинической (практической) медицине более удобно было бы использовать криоконсервиро ванный донорский материал. Остается также не изученной возможность потенцирования терапевтической эффективности биоматериала при комплексном (комбинированном) применении клеток фетальной печени и хориона.
Актуальность данной работы обосновывается также необходимостью дальнейшего совершенствования биотехнологических методов лечения ТПН и поиска доступных и легитимных источников донорского биоматериала, способного улучшить функцию поврежденной печени и снизить летальность при этой тяжелой патологии.
Цель исследования:
Сравнительное изучение в опытах на экспериментальных животных эффективности раздельного и сочетанного применения криоконсервированного биоматериала — клеток фетальной печени и хориона, с целью повышения терапевтической активности указанных клеток при тяжелой печеночной недостаточности.
8. , .
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Воспроизвести экспериментальные модели тяжелой печеночной недостаточности путем резекции больших объемов печени и затравки животных четыреххлористым углеродом, пригодные для изучения влияния клеточной терапии на процессы регенерации печени.
2. Оценить иммунологическую толерантность организма взрослого реципиента к трансплантации фетального нативного и криоконсервированного биоматериала.
3. На травматической и токсической моделях тяжелой печеночной недостаточности изучить отдельно динамику восстановительных процессов в поврежденной печени при изолированной трансплантации клеток фетальной печени и клеток хориона.
4. Изучить динамику восстановительных процессов в поврежденной печени при сочетанной трансплантации криоконсервированных клеток фетальной печени и клеток хориона.
Научная новизна Впервые изучена эффективность трофобластических клеток хориона и клеток фетальной печени при двух разных моделях тяжелой печеночной недостаточности в эксперименте. Установлено, что одномоментная резекции 3/5 объема печени и курсовая затравка ССЦ (в дозе 0,4/ 100 г массы 40% масляного раствора) создают адекватные патогенетические модели острой печеночной недостаточности, пригодные для изучения эффективности клеточной терапии. Двухэтапная резекция печени (сначала резекция 2/5 спустя 3 недели резекция 3/5 объема печени) повышает резистентность печени к травматическому повреждению и поэтому не должна использоваться для моделирования острой печеночной недостаточности и изучения эффективности клеточной терапии. Впервые установлено что:-внезародышевые клетки стимулируют восстановительные процессы в поврежденной печени так же, как и клетки фетальной печени. В частности, клетки хориона являются одним из перспективных материалом в трансплантационной регенерации печени;
— процессы восстановительной регенерации могут быть потенцированы при сочетанном применении клеток фетальной печени и хориона- -трансплантация аллогенного фетального нативного и криоконсерви-рованного биоматериала под кожу экспериментальных животных не подвергается иммунному отторжению и этот эффект сопровождается высоким уровнем митотической активности фетальных клеток- -при стимуляции репаративной регенерации токсически поврежденной печени фетальными клетками, важная роль принадлежит ядерному аппарату гепатоцитов. Уменьшение количества гепатоцитов с внутриядерными липидными включениями происходит на фоне снижения интенсивности жировой дистрофии клеток печени и постоянно нарастающего увеличения двуядерных гепатоцитов.
Практическая значимость работы Фетальные клетки по своей доступности и экономической выгодности могут быть использованы как самостоятельный метод для лечения больных, находящихся на «листе ожидания» для пересадки печени. Однократная доза клеток печени и хориона (6×104 / 100 г массы тела в 1 мл) способны инициировать процессы восстановительной регенерации в печени при острой печеночной недостаточности.
Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации. Автором освоены методы морфологического и биохимического контроля эффективности корригирующей терапииусовершенствована технология выделения и криоконсервации ФК с помощью аппарата для механического диспергирования фетального материала, на который получен патент. Эксперименты и анализ полученных данных проводились лично автором.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Экспериментальные модели с резекцией больших объемов печени у собак и с токсической затравкой CCL4 у крыс, являются адекватными воспроизводимыми моделями тяжелой острой печеночной недостаточности, пригодными для изучения эффективности клеточной терапии.
2. Клетки хориона являются одним из перспективных видов клеточного материала, способные стимулировать регенерационную активность клеток печени.
3. Комбинированное применение клеток хориона и фетальных клеток печени способно более эффективно стимулировать восстановительные процессы в печени, чем при их раздельном применении.
Внедрение результатов исследований в клиническую практику и учебный процесс Основные положения диссертации и результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре факультетской хирургии № 2 ГОУ ВПО «Дагтосмедакадемия ФАЗ СР».
Апробация основных положений работы: Материалы исследования представлены на Республиканской научно-практической конференции «Новое в хирургии Дагестана» (Махачкала, 2000) — Первой Республиканской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы детской хирургии» (Махачкала, 2001) — научно-практической конференции, посвященной 70-летию ДГМА (Махачкала, 2002) — 56-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов (Махачкала, 2002) — XIV съезде хирургов Дагестана (2002) — Республиканской научно-практической конференции, посвященной 70-летию АК ДАН и ААН, д.м.н. А. З. Магомедова (Махачкала, 2003) — на III-й Республиканской научно-практической конференции «Новые клеточные технологии в хирургии» (Махачкала, 2003) — на Всероссийской конференции, посвященной 75-летию Б. Г. Брискина (Москва, 2003) — первом съезде врачей железно-дорожного транспорта России (Москва, 2004) — I, II, III Всероссийских ежегодных конференциях «Стволовые клетки и перспективы их применения в здравоохранении» (Москва, 2004, 2005, 2006 гг.) — на X Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гепатологии: новое в диагностике и терапии» (Махачкала, 2005).
Апробация диссертации состоялась иа межкафедральной научной конференции в Дагосмедакадемии (12.05.2006 г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 работ (1 статья — в рекомендованном ВАК МОН РФ рецензируемом журнале «Южнороссийский медицинский журнал»). Получен 1 патент на изобретение — «Аппарат для механического диспергирования эмбриональных и фетальных тка-ней"№ 2 275 864 от 10.05.06.
Объем и структура диссертации — Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы (глава I), материала и методов исследования (глава И), трех глав, посвященных результатам собственных исследований и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 232 источника, из которых 123 отечественных и 109 иностранныхработа иллюстрирована 18 таблицами и 35 рисунками.
ВЫВОДЫ:
1. Резекция 3/5 объема печени у собак и курсовая затравка крыс четырех-хлористым углеродом создают адекватные модели острой печеночной недостаточности, пригодные для изучения эффективности клеточной терапии и тяжелого поражения печени т.к. воспроизводят структурные и функциональные признаки печеночной недостаточности сроком до 3-х недель.
2. Развитие токсического гепатита, вызванного курсовым введением че-тыреххлористого углерода сопровождается жировой инфильтрацией паренхимы печени и характеризуется постепенным снижением интенсивности поражения печеночных долек от перипортальной зоны к центру.
3. Срезы нативного и криоконсервированного фетального биоматериала обладают достаточно высоким уровнем приживления, что подтверждает иммунологическую толерантность взрослого реципиента к фетальным клеткам.
4. Однократное введение клеток фетальной печени собакам и крысам в дозе 6×104/100г массы в 1 м при тяжелой печеночной недостаточности ускоряет темп восстановительной регенерации печени.
5. Клетки хориона, введенные собакам и крысам однократно в количестве 6×104/100гмассы в 1 мл, так же как и клетки фетальной печени ускоряют процесс восстановительной регенерации печени и могут служить биоматериалом выбора, при проведении клеточной терапии.
6. Сочетанное введение клеток фетальной печени и хориона достоверно ускоряет на 7 дней темпы восстановительной регенерации печени по сравнению с раздельным применением этих клеток. Это свидетельствует о потенцировании их биорегуляторной активности, обусловленного более богатым спектром биологически активных веществ, поступающих из указанных клеток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Для создания травматической модели тяжелой острой печеночной недостаточности следует использовать метод одномоментной резекции 3/5 объема печени, а создании токсической модели проводить курсовую затравку четыреххлористым углеродом.
2. При необходимости ускорения репаративной регенерации печени клетки хориона могут заменять клетки фетальной печени по своему биорегуляторному эффекту.
3. Для лечения тяжелой острой печеночной недостаточности может использоваться не только интрапортальное введение, но и внутримышечное введение фетальных клеток.
4. Для индуцирования восстановительных процессов в печени при тяжелой острой печеночной недостаточности достаточно однократное интрапортальное или внутримышечное введение клеток печени и клеток хориона в количестве 6×104 /100г массы в 1 мл. При сочетанном применении фетальных клеток доза клеток составляет 6×104 /ЮОг массы каждого типа в 0,5 мл.
