Химико-токсикологическое исследование 1, 1 «-этилен-2, 2» — бипиридилийбромида

Актуальность темы

1,1 -этилен-2,2'-6ипиридилиЙдибромид (синонимы: ДИКВАТ, реглон, ФБ-2, приглон) широко применяется в качестве гербицида и десиканта сорных растений, для десикации семенников сахарной свёклы в период побурения 30−40% клубочков. В ряде стран применяется для десикации хлопчатника, картофеля, подсолнечника и ряда других культур. Относится к контактным гербицидам сплошного действия, характеризуется быстрым гербицидным эффектом и уничтожает надземную часть растений даже при использовании малых доз. Дикват обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления данным веществом, в том числе с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, употребления некачественных продуктов питания, содержащих остаточные количества диква-та, а также при суицидных попытках.

ЛД50 диквата для крыс составляет 282 мг/кг, летальная доза для человека, очевидно, равна 90−180 мг/кг. Широкое применение диквата, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении. До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования диквата из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования диквата является актуальной.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка методики судебно-химического исследования 1,1— этилен-2,2'-бипиридилийдибромида.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида.

2. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

3. Изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях 1,1 -этилен-2,2'-бипиридилийдибромида с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала.

4. Изучить особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

5. Исследовать распределение 1,1 -этилен-2,2- бипиридилийдибромида в органах и биологических жидкостях теплокровных животных.

6. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна исследований. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения 1,1 -этилен-2,2'- бипиридилийдибромида в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фазопределены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 1,1'-этилен-2,2'- бипириди-лийдибромида методами ТСХ и хроматоспектрофотометрии.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения 1,1-этил ен-2,2'-бипиридилийдибромида. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров, их первые и вторые производные.

Показана возможность образования окрашенных продуктов при взаимодействии 1,1—этилен-2,2- бипиридилийдибромида с глюкозой в водной и водно-диметилформамидной средах в присутствии гидрокарбоната натрия в условиях нагревания. На основе предложенных хромогенных реакций разработаны методики идентификации исследуемого вещества.

Впервые для изолирования 1,1'-этилен-2,2'- бипиридилийдибромида из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2). На основе применения в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистки в тонких слоях или колонках обращённофазовых сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соедине-ниия в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (кролики) исследованы особенности распределения 1,1—этилен—2,2 — бипиридилийдибромида в организме теплокровных.

Определены сроки сохранения рассматриваемого отравляющего вещества в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы Л}а основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификациии количественного определения 1,1-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида. Методика судебно-химического исследования представлена в виде проекта информационного письма.

Внедрение результатов работы;

— методика определения 1,1 -этилен-2,2'-бипиридилийдибромида хрома-тоспектрофотометрическим методом (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органическй химии Курского государственного медицинского университета с 22.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

— методика идентификации 1,1 -этилен-2,2'-бипиридилийдибромида с применением хроматографии в тонких слоях обращённофазного сорбента (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 22.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

— методика определения 1,1 -этилен-2,2'-брширидилийдибромида в ткани трупных органов (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 15.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

— методика определения 1, Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в биологических жидкостях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 15.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 01.200. 511 193.

Основные положения, выносимые на защиту.:

— результаты исследования хроматографической активности диквата в тонких слоях и колонках сорбентов;

— особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемого вещества в УФи ИКобластях спектра;

— условия взаимодействия диквата с рядом цветореагентов;

— методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;

— результаты исследования очистки диквата в тонких слоях и колонках сорбентов;

— методика изолирования объекта исследования из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ;

— особенности распределения диквата в организме теплокровных животных- .

— сохраняемость диквата в трупном материале и в биологических жидкостях.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на научно-практической конференции с международным участием «Становление, перспективы судебно-токсикологической службы, научные исследования», Харьков, 9−10 ноября 2005 года, на 71 итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН (Курск, 2006), на 71 итоговой межвузовской научной конференции «Молодёжная наука и современность», Курск, 18−19 апреля 2006 года, на Региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвящённой 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», Курск, 15 декабря 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре работы.

Объём и структура диссертации. Диссертационнаяработа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 155 страницах машинописного текста, содержат 5 рисунков, 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 175 источников, из которых 97 — на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Исследован характер поглощения электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК-областях спектра 1, Г-этилен-2,2'-бипиридилийдиб-ромида.

Установлены особенности в поглощении рассматриваемого соединения.

Показана возможность идентификации исследуемого вещества методами электронной и колебательной спектрофотометрии, а также на основе расчёта производных электронных спектров.

На основе способности к поглощению УФизлучения в среде 1 н. раствора серной кислоты и в среде смеси ацетонитрил — 1 н. раствор серной кислоты (2:8) разработаны методики количественного определения рассматриваемого соединения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата в различных случаях не превышает ±1%.

2. Изучена хроматографическая активность исследуемой дипириди-лиевой структуры в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилиро-ванной и привитой поверхностями с использованием элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования.

Для хроматографирования в тонких слоях сорбента с гидроксилиро-ванной поверхностью (широкопористый силикагель на пластинах «Силу-фол» UV-254) оптимальными подвижными фазами являются системы растворителей диоксан-0,1 н. раствор хлороводородной кислоты (2:8), ацетонитрилОД н. раствор хлороводородной кислоты (2:8). Установлено, что универсальной подвижной фазой для рассматриваемого вещества в тонких слоях и колонках обращённофазных сорбентов (Си.

С is) является система растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (2:8).

Разработана методики количественного определения 1,1—этилен-2,2-бипиридилийдибромида хроматоспектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает ± 1,15%.

3. Показана возможность определения исследуемого соединения на основе применение цветных реакций с восстанавливающими реагентами (водный раствор глюкозы, раствор глюкозы в среде ДМФА-вода).

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации рассматриваемого соединения. Открываемый минимум 0,2−0,3 мкг/мл.

4. Изучены особенности препаративного хроматографирования объекта исследования на колонке с сорбентом «Силасорб» С-18 (размер частиц 30 ц). Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (2:8). Дана оценка потерь анализируемого соединения в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем хроматографической очистки рассматриваемого вещества от соэкстрактивных веществ биологического материала.

5. Проведено сравнительное изолирования исследуемого вещества из биологического материала различными изолирующими агентами. Установлено, что наиболее высокую степень извлечения рассматриваемого соединения удается достичь при использовании в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол—1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2). Процесс изолирования должен осуществляться в условиях проведения по крайней мере двукратного настаивания с объемом изолирующего агента, который как минимум в два раза численно превышает массу исследуемого биоматериала, в условиях нагревания до кипения и кипячения в течение 10 минут с последующим охлаждением и выдерживанием реакционного раствора не менее получаса.

6. Разработаны методики определения 1,1'—этилен—2,2 — бипиридилийдибромида в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистки методами тонкослойной и колоночной хроматографии с использованием обращённофазовых сорбентов.

7. При содержании 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистке методами ТСХ и колоночной хроматографии, позволяют определять в ткани свежей трупной печени 85,54−86,11%, в крови -87,0287,82%, в моче -97,11−97,39% анализируемого соединения.

При таком же содержании 1,1-этилен-2,2-бипиридилийдибромида методика, основанная на изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистке хроматографией на колонке, позволяет определить в ткани гнилостно изменённой трупной печени 82,22%.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) составляет 0,030−0,035 мг в 100 г трупного органа, 0,020−0,025 мг в 100 г крови, 0,010−0,015 мг в 100 г мочи, 0,040−0,045 мг в 100 г трупного органа, подвергшегося гнилостным изменениям.

8. Исследованы особенности распределения 1,1 -этилен-2,2бипиридилийдибромида в организме теплокровных животных при введении яда через желудок.

1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромид в наибольших количествах обнаруживается в моче, селезёнке, почках и тонком кишечнике животных, погибших от отравления.

9. Изучена сохраняемость 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Показано, что в условиях сохранения модельных смесей 1,1—этилен— 2,2'-бипиридилийдибромида с тканью трупной печени при температуре 18−22°С исследуемое вещество может быть обнаружено в трупном материале в течение 4 — 4,5 месяцев после начала эксперимента.

10. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении 1,1 — этилен-2,2'-бипиридилийдибромидом.

Заключение

.

Обзор источников литературы по теме диссертации включает известные сведения о свойствах, применении, токсическом действии на организм диквата, а также о методах его обнаружения, количественного определения и способах изолирования из биологического материала растительного и животного происхождения, а также объектов окружающей среды и продуктов питания.

Идентификация диквата основана, главным образом, на способности образовывать окрашенные соединения в щелочной среде, в том числе восстанавливаться в щелочной среде дитионитом натрия с образованием окрашенного раствора свободных радикалов. Предлагаются спектрофотометрические методики качественного определения, метод ТСХ. Имеющиеся методики определения характеризуются недостаточной селективностью (образование окрашенных соединений в щелочной среде) или высокой трудоёмкостью (спектрофотомет-рия), извлечение должно быть подвергнуто спектрофотометрии в течение пяти минут после обработки дитионитом, иначе результаты исследования станут сомнительными.

Для количественного определения диквата в источниках литературы предложены физико-химические методы: спектрофотометрический, газохрома-тографический и фотометрии. Кроме этого были предложены методы биофизический и радиоиммунологический. Наиболее часто предлагаемый метод спектрофотометрии основан на той же реакции образования окрашенных радикалов после восстановление диквата дитионитом натрия. Эта методика использует редкий, нестойкий и дорогой реактив дитионит натрия, рабочий раствор которого стабилен не более одного часа, а сам препарат требуется хранить в эксикаторе. Образующиеся свободные радикалы диквата и параквата также нестабильны и количественное определение необходимо провести для диквата в течение пяти минут, для параквата в течение десяти минут. Однако в литературных источниках отсутствуют методики изолирования, очистки и определения диквата в биологических жидкостях, трупном материале. Адаптация данных методик к условиям судебно-химического анализа крайне затруднена. Вызывают сомнения разные подходы к изолированию диквата. Некоторые авторы предлагают кипятить пробу 3−4 часа с концентрированной серной кислотой для полноты извлечения диквата, другой автор ограничивается доведением пробы до кипения в растворе разбавленной серной кислоты.

Имеющаяся информация не даёт представления об особенностях распределения и сохраняемости диквата в ткани трупных органов и биожидкостях в зависимости от ряда факторов окружающей среды.

На основании существующих данных источников литературы можно сделать заключение о необходимости изучения диквата в судебно-химическом отношении и разработки методики его определения в биологическом материале.

ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ.

Объект исследования: 1,1' — этилен — 2,2' - бшшридишшдибромид (стандарт НИИ защиты растений (г. Москва).

Приборы:

1. Спектрофотометр СФ-46 (Производственное объединение ЛОМО, г. Ленинград);

2. ИК-Фурье спектрофотометр «Nikolet Magna 750» (США);

3. Газовый хроматшраф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (Agilent Technologies);

4. Ультрафиолетовый облучатель Л-80;

5. Потенциометр ЭВ-74;

6. Термостат ТС-80 М-2;

7. Вакуумный испаритель;

8. Водяная баня;

9. Электроплитка.

Реактивы:

1. Ацетон о. с. ч. ТУ 6−09−3513−86;

2. Ацетонитрил ч. ТУ 6−09−8534−87;

3. Борная кислота х. ч. ГОСТ 9656–75;

4. Вазелиновое масло фарм;

5. Гексан ч. д. а. ТУ 261−003−5 807 999−98;

6. Гидрокарбонат натрия ч. д. а.

7. Гидрооксид натрия х. ч. ГОСТ 4328–77;

8. Гидротартрат калия.

9. Глюкоза фарм.

10.1,4-диоксан ч. д. а. ГОСТ 10 455–80;

11. Н№диметилформамид (ДМФА) ч. ГОСТ 20 289;

12. Диэтиловый эфир ОСТ 82−2006;88;

13. Пропанол-2 х. ч. ТУ 6−09−402−87;

14. Серная кислота х. ч. ГОСТ 4204–77;

15. Тетраоксал ат калия.

16. ТрилонБ;

17. Уксусная кислота х. ч. ГОСТ 61– —75;

18. Формальдегид;

19. Фосфорная кислота ч. д. а. ГОСТ 6552–80;

20. Хлороводородная кислота х. ч. ГОСТ 3118–77;

21. Хлороформ ч. д. а. ТУ 2631−020−11 291 058−96;

22. Этанол 95%;

23. Эгалацетат х. ч. ГОСТ 22 300–76.

Материалы:

1. Бумага индикаторная универсальная ПНД 50−975−84 («Lachema», Чехия);

2. Сорбент «Силасорб 600» («Lachema», Чехия);

3. Хроматографические пластины типа «Силуфол» UV-254;

4. Фильтры бумажные.

5. Фильтры капроновые с размером пор 0,2 ц.

Посуда:

1. Бюретки стеклянные градуированные на 25 мл;

2. Колбы мерные на 10,25 и 50 мл;

3. Колбы конические на 100 и 200 мл;

4. Камеры хроматографические цилиндрические стеклянные (внутренний объём около 600 см3);

5. Обратный холодильник;

6. Пробирки стеклянные вместимостью 20 мл;

7. Пипетки градуированные на 0,2- 1- 2- 5 и 10 мл;

8. Стеклянные фильтры N 4 (диаметром 2 см);

9. Стаканы химические стеклянные вместимостью 50 и 100 мл.

10. Цилиндры мерные градуированные на 10,50,100 и 250 мл;

11. Чашки выпарительные фарфоровые вместимостью 50,100 и 250 мл.

Методы исследования.

Были использованы методы хроматографии в тонких слоях сорбентов, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, электронной и ИК-спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии.

Статистическая обработка данных.

Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями и с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

Глава 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ 1,1' — ЭТИЛЕН -2,2' -БИПИРИДИЛИЙДИБРОМИДА.

2.1. Идентификация хроматографическими методами.

2.1.1. Идентификация в тонких слоях нормальнофазного сорбента Изучена хроматографическая подвижность 1,1' - этилен — 2, 2' бипиридилий-дибромида в тонком слое силикагеля с гидроксилированной поверхностью (пластины «Силуфол» UV-254).

В процессе исследования на линию старта хроматографической пластины размером 6×10 см наносили по 5 мкг анализируемого вещества в виде 0,02% этанольного раствора в смеси этанол-вода (5:5). Для хроматографирования исо пользовали стеклянные камеры с внутренним объёмом около 600 см. Перемещение подвижной фазы в слое сорбента происходило восходящим методом под действием капиллярных сил. Для проявления хроматограмм их обрабатывали из пульверизатора раствором 10% гидроксида натрия. При этом пятна анализируемого вещества приобретали окраску от светло — жёлтой до оранжевой в зависимости от его концентрации.

Хроматографическая активность рассматриваемого соединения обусловлена различными типами взаимодействий, основные из которых приводят к образованию водородных связей. Данные связи образуются при взаимодействии силанольных групп адсорбента, имеющего гидроксилированную поверхность, и отдельных групп атомов в молекулах адсорбата. Кроме возникающих связей между адсорбатом и адсорбентом на хроматографическую подвижность соединений влияют взаимодействия, которые возникают между поверхностью адсорбента и подвижной фазой, а также подвижной фазой и адсорбатом.

В работе рассмотрена возможность применения одно — и двухкомпонент-ных подвижных фаз при изучении хроматографической активности объекта исследования. В качестве подобных фаз использовались растворители с различной полярностью. Применение в данном качестве как низших предельных алифатических углеводородов (гексан, гептан), обладающих наименьшей диэлектрической проницаемостью, так и органических растворителей с более высокими значениями диэлектрической проницаемости (низшие галогеналканы, диоксан, ацетонитрил, кетоны (ацетон), низшие алифитические спирты и т. д.) не приводило к сколько-нибудь заметным проявлениям хроматографической активности диквата. При этом четвертичный азот структуры настолько сильно взаимодействовал с гидроксилированной поверхностью силикагеля с образованием различного рода связей, в том числе водородных, что рассмотренные однокомпо-нентные элюенты не могли реально конкурировать с молекулами адсорбата за структурные элементы поверхности адсорбента. В итоге пятна вещества на хроматограммах обнаруживались практически на линии старта. К росту хроматографической подвижности анализируемого вещества в тонком слое сорбента с гидроксилированной поверхностью не приводило и использование двухком-понентных подвижных фаз, в каждую из которых включали неполярный или малополярный органический растворитель и органический растворитель со средней или сильной полярностью в различных объёмных соотношениях.

Повысить хроматографическую активность рассматриваемого соединения удавалось при использовании подвижных фаз, содержащих сильнокислотные полярные компоненты (водные растворы неорганических и низкомолекулярных карбоновых кислот, а также смеси данных растворов с гидрофильными органическими жидкостями).

Объяснить это можно тем, что элюенты, включающие сильно-кислотные полярные компоненты, обладают достаточным сродством к анализируемому веществу и способны конкурировать с ним при образовании связей с силаноль-ными группами сорбента. В данных условиях взаимодействие активных групп объекта исследования с поверхностью сорбента ослабляется и происходит увеличение скорости продвижения вещества вместе с подвижной фазой.

Для оценки поведения исследуемых структур при хроматографировании рассчитывались значения величин коэффициента хроматографической подвижности: Rf и условного удерживания в тонком слое сорбента В.

Rfвеличина, которая представляет собой отношение средних скоростей перемещения вещества и фронта подвижной фазы за время получения хромато-граммы.

В — условное удерживаниение в тонком слое сорбента, рассчитанное по формуле:

В = 1/Rf (1).

Результаты хроматографирования диквата в тонких слоях нормальнофа-зового сорбента при использовании одно — и многокомпонентных подвижных фаз представлены в таблице 1.

2.1.2. Идентификация в тонких слоях обращённофазного сорбента.

Исследование хроматографической подвижности 1,1'- этилен- 2,2' бипи-ридилийдибромида осуществляли в тонком слое широкопористого силикагеля (пластины «Силуфол» UV-254), предварительно обработанного вазелиновым маслом. Подобным образом моделировали привитую. фазу С14- С15 в тонких слоях обращённофазного сорбента.

Анализируемое вещество наносили на пластины с тонким слоем обращённофазного сорбента в виде водно-этанольного раствора (5:5).