Исследование дофамина как молекулярного инструмента для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках
Цитохимическая визуализация методом Фалька катехоламинов в клетках после воздействия дофамина выявила многократное усиление интенсивности флуоресценции их цитозоля. Установлено, что субстратом флуоресценции являются вновь образованные нити актодофаминового комплекса. В связи со стехиометрическим соотношением дофамин/актин в актодофаминовом комплексе, интенсивность его флуоресценции указывает… Читать ещё >
Содержание
- ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Дофаминовые рецепторы 7 1.1.1. Локализация дофаминовых рецеторов
- 1. 2. Актин: глобулярная и фибриллярная формы
- 1. 2. 1. Динамика актина в клетке
- 1. 2. 2. Ядерный актин
- 1. 3. Актин: содержание катионов
- 1. 4. Полимеризация актина
- 1. 4. 1. Скорость и степень полимеризации актина
- 1. 4. 2. Актин связывающие белки
- 1. 4. 3. Г-актин связывающие белки
- 1. 4. 4. Влияние цитохалазинов и фаллоидина на полимеризацию актина
- 1. 5. Цитоскелет трансформированной клетки
- 1. 6. Существующие микроскопичесике подходы для визуализации актина
- ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45 Объекты исследования
- 2. 1. Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином in vitro
- 2. 2. Культивирование клеток in vitro и оценка их выживаемости
- 2. 3. Культивирование in vivo клеток асцитной карциномы Эрлиха
- 2. 4. Морфологические исследования культур клеток
- 2. 5. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток
- 2. 6. Деполимеризация актина под действием цитохолазина В и глутамата
- 2. 7. Взаимодействие дофамина с выделенным Г-актином в модельных экспериментах
- ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5, а в гене D4 — 3 (гены человека) (Grandy et al., 1989- Sokoloff et al., 1990- Van et al., 1991). Известно, что рецепторы D2 и D3 существуют в нескольких формах, что является результатом альтернативного сплайсинга их пре-мРНК (Giros et al., 1989- Monsma et al., 1989- Giros et al., 1991). Структурно D2-подобные рецепторы отличаются тем, что их С-концевые домены в 7 раз короче, чем у Dl-подобных рецепторов (Rondou et al., 2010).
Предполагается наличие рецепторов D6 и D7, но их существование пока не доказано.
Альтернативная классификация, предложенная в 1983 (Goldberg, Kohli, 1983), подразделяет рецепторы по их эффектам: активация рецепторов группы DA1 вызывает релаксацию мышц и расширение сосудов- для этих рецепторов (Я)-сульпирид является сильным антагонистом, апоморфин — слабым агонистом, а домперидон на них не действует. Активация DA2 рецепторов ингибирует действие норадреналина, апоморфин — их сильный агонист, а сильные антагонисты — (З)-сульпирид и домперидон. Дофаминовые рецепторы центральной нервной системы, по-видимому, относятся к этому классу (Альберт, 1989).
1.1.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ Дофаминовые рецепторы присутствуют как в центральной нервной системе, так в периферических органа. Относительная доля дофаминергических нейронов в головном мозге невелика (менее 1/100 000 всех нейронов) (Rondou et al., 2010). Эти нейроны формируют несколько основных дофаминергических путей: нигростриарный, мезолимбический, мезокортикальный и тубероинфундибулярный (Missale et al., 1998).
Дофаминовый рецептор D1 является самым широко распространённым дофаминовым рецептором в головном мозге, он синтезируется в большем количестве чем другие рецепторы. Он обнаруживается в высокой концентрации в нигростриарном, мезолимбическом и мезокортикальном путях, а именно в лобных долях, полосатом теле, чёрной субстанции, прилежащем ядре, обонятельном бугорке и миндалевидном теле. Также в меньшей концентрации он присутствует в гиппокампе, мозжечке, таламической и гипоталамической областях (Fremeau et al., 1991- Weiner et al, 1991- Hurd et al., 2001- I-Iuang et al, 1992).
Рецептор D2 в высокой концентрации присутствует в полосатом теле, обонятельном бугорке, прилежащем ядре, чёрной субстанции, гипоталамусе, вентральной области покрышки и миндалевидном теле, то есть примерно в тех же участках мозга, где обнаруживается и рецептор Dl (Meador-Woodruff et al, 1989- Le Moine et al, 1990- Missale et al, 1998). Тем не менее, дополнительные исследования помогли установить, что только 5—15% проекционных нейронов дорсальной части полосатого тела экспрессируют оба рецептора одновременно. Остальные нейроны могут быть разделены на две группы, в зависимости от того, какой из рецепторов они содержат (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Рецептор D3 имеет более узкий профиль распространения, чем рецепторы, описанные выше. В наибольшей концентрации он присутствует в прилежащем ядре, обонятельном бугорке и островках Калеха. В существенно более низких концентрациях рецептор D3 обнаруживается в компактной части чёрной субстанции, вентральной области покрышки и мозжечке (Bouthenet et al, 1991- Le Moine, Bloch, 1996- Lovesque et al, 1992).
Уровень экспрессии рецептора D4 в мозге существенно ниже, чем рецептора D2. Доказано, что рецептор D4 присутствует в коре больших полушарий, гиппокампе, полосатом и миндалевидном телах (Rondou et al, 2010).
Рецептор D5 синтезируется в небольшом количестве в разных участках мозга: в пирамидальных нейронах префронтальной коры, поясной коре, энторинальной коре, чёрной субстанции, зубчатой извилине, гиппокампе и гипоталамусе (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Все пять типов рецепторов дофамина встречаются и за пределами головного мозга. Так рецепторы Dl, D2 и D4 были обнаружены в сетчатке, а рецептор D2 — в гипофизе (Goldman, Kebabian, 1984- Cohen et al., 1992- Titeler et al., 1981). Дофаминовые рецепторы синтезируются в разных пропорциях в клетках почек, надпочечников, симпатических ганглиев, кровеносных сосудов, сердца и пищеварительного тракта (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).
Изменение дофаминергической функции отмечается в ряде нейрологических и психических расстройств, а сами рецепторы являются мишенями для множества лекарственных препаратов. Подавляющее большинство антипсихотиков — антагонисты рецепторов дофамина, а психостимуляторы зачастую косвенно их активируют.
На данный момент получены свидетельства того, что помимо специфического взаимодействия с рецепторами, нейротрансмиттеры способны оказывать неспецифическое влияние на клетку.
1.2. АКТИН: ГЛОБУЛЯРНАЯ И ФИБРИЛЯРНАЯ ФОРМЫ Многие структуры цитоскелета могут легко разрушаться и вновь возникать, меняя свое расположение или морфологию. В основе этих особенностей цитоскелета лежат реакции полимеризации-деполимеризации основных структурных цитоскелетных белков и их взаимодействие с другими белками, как структурными, так и регуляторными.
Цитоплазма эукариотических клеток пронизана трехмерной сеткой из белковых нитей (филаментов), формируемых цитоскелет. В зависимости от диаметра филаменты разделяются на три группы: микротрубочки (около 25 нм), промежуточные волокна (около 10 нм) и микрофиламенты (около 7 нм). Все эти волокна представляют собой полимеры, состоящие из субъединиц особых глобулярных белков. Микрофиламенты (актиновые нити) состоят из актина — белка, наиболее распространенного в эукариотических клетках (1015% сухого веса).
Актин — главный компонент системы микрофиламентов клетки
Sheterline et al., 1998- Pollard et al., 2000). Он обнаружен практически во всех типах клеток эукариотов и может составлять более 20% от всего клеточного белка (Cooper, 1991- Korn, 1982).
С актиновыми структурами цитоскелета связано поддержание формы, движение и делении клеток, эндо- и экзоцитоз, передача медиаторов и гормонов, свертывание крови, а также процессы, происходящие в эмбриогенезе (Крутецкая и др, 2003- Павлик JI.JI. 2004- Kopec C.D., 2006- Nishita M., 2006- Goetze В., 2006- Bestman J.E., 2008- Bressloff P.C., 2009Pollard Cooper, 1976- Egea et al., 2006- Malacombe et al., 2006). Предполагается участие цитоскелета в регуляции активности ионных каналов (Negulyaev et al., 1996, 2000- Shumilina et al.- Mazzocci et al., 2006), передаче внутриклеточного сигнала в геном (DeLanerolle, Cole, 2002), транспорте мРНК и транскрипции (Bassell, Singer, 1997- Grummt, 2006- Mirales, Visa- Percipalle, Visa, 2006), в передаче медиаторов (Rosenmund, Westbrook, 1993- Prekeris et al., 1996- Dillon, Goda, 2005) и регуляции активности ферментов (Su et al., 2005). Характерной осебенностью актиновых структур цитоскелета является их динамичность. В отличие от актиновых нитей стабильного сократительного аппарата скелетных мышц, образующихся однократно, микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки. Наиболее ярко это проявляется при распластывании клетки на субстрате (Moreau, Way, 1999- Small et al., 1999- Borisi, Svitkina 2000- Faix, Rottner, 2006), в акросомальной реакции сперматозоидов (Tilney et al., 1973, 1983), при перемещении патогенных бактерий внутри клетки (Cossart, Sansonetti 2004). Нарушение процессов сборки и разборки актиновых структур приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки, в том числе к её опухолевой трансформации (Janmey, Chaponnier, 1995- Prasad, 2005- Yamaguchi, Condeelis, 2007).
По существу, актин — количественно превалирующий белок во многих типах клеток. Часть актина в немышечных клетках полимеризуется с образованием микрофиламентов, напоминающих тонкие нити мышечного
Большинство актинов (существует несколько изомеров актина, наиболее распространены а-, р- и у-изомеры состоит из 375 аминокислотных остатков, в том числе одного остатка необычной аминокислоты — 3-метилгистидина (His68), который образуется посттрансляционно. При анализе аминокислотной последовательности актина обращает на себя внимание большое количество отрицательно заряженных групп, особенно на N-конце цепи. Так, из пяти N-концевых аминокислотных остатков четыре содержат в боковых цепях карбоксильные группы, а среди первых 25 аминокислотных остатков отрицательно заряжены 7. Различия в аминокислотной последовательности у разных актинов, как в пределах одного вида, так и межвидовые, крайне незначительны. Они составляют не более 25 аминокислотных замен. Таким образом, актин является одним из наиболее консервативных белков в эволюции эукариотов (Bershadsky et al., 1988), ещё более консервативным, чем гистон Н4 (Vandekerckhove, Weber, 1984).
Структурные исследования актиновой молекулы показали, что Г-актин представляет собой глобулярный белок слегка вытянутой формы с линейными размерами 5,5×5,5×3,5 нм. (Smith et al., 1983). Трехмерная структура актина была определена для актина в комплексе с белками, предотвращающими его полимеризацию — ДНКазой I (Kabsch et al., 1990), гельзолином (McLaughlin et al., 1993- Robinson et al., 1999) и профилином (Schutt et al., 1993), а также для АДФ-актина, модифицированного тетраметилродамин-5-малемидом (Otterbein et al., 2001). По данным рентгеноструктурного анализа комплекса Г-актина с ДНКазой I, молекула актина состоит из двух доменов с глубокой выемкой между ними (рис. 2.). Как N-, так С-конец полипептидной цепи находятся в малом домене. Каждый домен состоит из двух субдоменов. Малый домен в свою очередь состоит из субдомена I (остатки 1−32, 70−144 и 338−372) и субдомена II (остатки 33−69), а большой домен — из субдомена III (остатки 145−180 и 270−337) и субдомена IV (остатки 181−269).
Элементами структуры малого домена являются пять ß--складчатых структур, окруженных пятью a-спиралями (в субдомене I), и три антипараллельных ß--складчатых листа с а-спиралыо, соединяющей концы двух ß--листов (в субдомене II). В субдомене III большого домена имеется пять ß--складчатых структур, окруженных тремя a-спиралями, в субдомене IV — два антипараллельных ?- слоя и четыре a-спирали. Домены разделены глубокой щелью. В щели между доменами расположены одна молекула АТФ (или АДФ) и прочно связанный двухвалентный катион Mg2+ (рис. 2). In vitro Mg обычно замещен на
Ca. Все четыре субдомена расположены относительно компактно и стабилизированы в основном солевыми мостиками и водородными связями с фосфатными группами нековалентно связанного аденин-нуклеотида и с двухвалентным катионом, локализованным в центре молекулы актина (Kabsch et al., 1990).
В условиях, близких к физиологическим, Mg форма актина значительно преобладает над Ca" формой, и мономерный актин имеет в качестве лиганда либо Mg-АТФ, либо Mg-АДФ (Carlier, Pantaloni, 1994).
Важным свойством мономерного актина является его способность к полимеризации с образованием линейного полимера — Ф-актина (Straub, 1942). Электронная микроскопия показывает, что актиновая нить представляет собой упорядоченную двухстартовую (двухтяжевую) спираль, каждый тяж которой является правосторонней спиралью с 13 молекулами актина на 6 поворотов вправо (то есть поворот молекулы актина составляет 166) и шагом 71,5 нм. Тяжи в свою очередь закручены один вокруг другого, образуя левую спираль с 13 молекулами актина на 6 левосторонних поворотов и с шагом 5,9 нм. Таким образом, большой домен каждой молекулы актина находится ближе к центру нити, а малый домен — на ее периферии (Egelman, 1985). В отличие от актина образованного in vivo длина нитей актина, заполимеризованного in vitro, колеблется от 0,2 до 10 — 15 мкм, причем распределение по длинам экспоненциально.
-)-конец
Рис. 2. Пространственная структура молекулы актина.
Показаны триптофановые остатки {красным), тирозиновые остатки {синим), катион Са2+ {желтым) и молекула АТФ {зеленым). 1,11,III и IV — субдомены актина (Поварова О.И. и др., 2005).
В 1990 году Holmes и др. путём совмещения атомной структуры актинового мономера с рентгенограммой ориентированных Ф-актиновых гелей была построена структурная модель актинового филамента с атомным разрешением. Согласно этой модели основное взаимодействие между мономерами актина вдоль двухстартовой спирали осуществляется за счет контакта между субдоменом IV одного мономера и субдоменом III лежащего выше мономера. В середине нить упакована неплотно. Контакты вдоль левой спирали образуются остатками 195 — 197 субдомена IV и остатками 110 — 112 субдомена I. Кроме того, петля одного тяжа (266 — 269), по-видимому, внедряется в гидрофобный карман, образованный остатками 166, 169, 171, 285, 289, 63 — 64 и 40 — 45 другого тяжа. Предполагается, что мономеры удерживаются в полимере благодаря образованию гидрофобного ядра между соседними субъединицами вдоль двухстартовой спирали, в которое вклинивается «шпилька», состоящая из остатков 269 — 272, принадлежащих мономерам другого тяжа. Кроме того, взаимодействие между мономерами может поддерживаться и солевыми мостиками. Существуют, вероятно, и водородные связи. Таким образом, в атомной модели актинового филамента 24 аминокислоты на субъединицу вовлечены в контакт внутри правосторонней спирали, и только 15 участвуют в более слабых контактах между двумя правыми спиралями. Максимальный диаметр такой модельной нити равен 90−95 ангстрем (Holmes et al., 1990).
Благодаря строго упорядоченному распределению асимметричных субъединиц внутри полимера, Ф-актин является полярной структурой.
Мономер актина, расположенный на одном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими субдоменами I и III, а мономер актина, расположенный на противоположном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими доменами II и IV. Конец актинового филамента, на котором находятся субдомены II и IV, называется острым или минус-концом филамента, а противоположный ему конец, на котором в контакте с растворителем находятся субдомены I и III, называют тупым или плюс-концом. Структурно различить концы актинового филамента можно с помощью субфрагментов мышечного миозина, содержащих головку миозиновой молекулы (Ishikawa et al., 1969- Moshkov et al., 1990). Декорированный S-l фрагментами миозина актиновый филамент образует характерные колосковые структуры: заострённый конец колоска соответствует минус-концу актинового филамента, а «оперенный» — плюс-концу.
1.2.1. ДИНАМИКА АКТИНА В КЛЕТКЕ Динамика микрофиламентов цитоскелета основана на двух фундаментальных свойствах актина. Первое — это способность к обратимой трансформации из глобулярного состояния (Г-актин) в полимер (Ф-актин) и обратно. Второе — это взаимодействие с актинсвязывающими белками, которые могут ускорять или ингибировать полимеризацию, фрагментировать актиновые нити или связывать их в пучки и прикреплять к клеточной мембране (Pantaloni et al. 2001- Dos Remedios et al., 2003- Pollard, Borisy, 2003-
Winder, Ayscough, 2005). Это означает, что динамика разных микрофиламентных структур в значительной степени определяется свойствами самого актина. Актин представлен в клетках разными изоформами. Миофибриллы скелетных мышц и сердца содержат аизоформы актина, микрофиламенты цитоскелета состоят из ?- и у-изоактинов
Vandekerckhove, Weber, 1978). Специфические изоформы актина обнаружены в гладких мышцах, тканях беспозвоночных животных, в растениях и одноклеточных организмах. В клетке поддерживается определенное соотношение между разными изоформами актина. Они компартментализованы, топографически разделены внутри цитозоля и, повидимому, выполняют разные задачи. Сопоставление данных о распределение изоформ актина в разных сократительных системах и разных частях клетки, с одной стороны, с данными о различиях в полимеризации изоактинов — с другой стороны, указывают на то, что свойства изоактинов соответствуют функциональным способностям тех сократительных систем, в которые они входят: мышечный а-актин способен к образованию более стабильных филаментов, в то время как филаменты ?- и у-актинов труднее образуются и легче диссоциируют (Khaitlina, 2001).
Активный край считается основной зоной полимеризации микрофиламентов в клетке. В настоящее время общепризнанной является теория постоянного тока, или круговорота актина в клетке между клеточным краем и эндоплазмой (Dunn G., 1980- Theriot J.A., Mitchison T.J., 1991).
Актиновая сеть формируется на клеточном крае движущейся клетки и перемещается центростремительно, в то время как деполимеризованный актин двигается в обратном направлении к краю клетки. Этот факт нашел свое подтверждение во многих экспериментальных моделях (Abercrombie et al., 1970- Fisher et al., 1988- Forscher et al., 1988- Theriot, Mitchison, 1991).
Активное движение вперед клеток также часто сопровождается центростремительным транспортом внутриклеточного содержимого, а также частиц, расположенных на поверхности клеток и связанных с актиновым цитоскелетом через мембранные гликопротеиновые рецепторы. В экспериментах по визуализации потока актина в клетке часто используют связанные с конканавалином микросферы диаметром 0.5 мкм (Kucik, 1991).
Частицы, спонтанно или при помощи лазерной ловушки прикрепленные к поверхности клетки, двигаются центростремительно. Скорость движения частиц коррелирует со скоростью центростремительного транспорта актинсодержащих структур в цитоплазме (Fisher et al., 1988). Подобное движение наблюдается только у клеток, способных к локомоции. Эти наблюдения показывают особую функциональную роль активного края ламеллы. Если частица прикреплена к какой-либо другой части ламеллы за пределами активного края, ее движение ограничивается медленным диффундированием на одном месте. Использование латексных частиц для исследования оказалось очень продуктивным, т.к. таким образом можно оценивать направление сил натяжения в актиновом цитоскелете, а также их изменения во время различных процессов, таких как, например, установление межклеточного контакта.
Хорошо известно, что мигрирующая или изменяющая форму клетка постоянно формирует различные динамичные структуры на своей поверхности. Так, культивируемые клетки часто образуют множество жёстких выступов плазматической мембраны толщиной около 0,1 мкм и длиной 5−10 мкм, называемых микрошипами. Более длинные микрошипы -филоподии — могут достигать в длину до 50 мкм. Тонкие пластинчатые выросты плазматической мембраны на поверхности клетки, достигающие толщины 200 нм и ширины 5−15 мкм (Small and Resch, 2005), называются ламеллоподиями и могут рассматриваться как двумерный вариант филоподии (Блиох, Смолянинов, 1977). Обе эти структуры образованы актиновыми филаментами, направленными своими «+" — концами к плазматической мембране (Svitkina et al, 2003).
Как правило, мигрирующая клетка имеет удлиненную поляризованную форму с плоским ведущим передним краем, адгезивным к субстрату, и стабильным задним краем. На активном крае формируются псевдоподии различных форм: от нитеобразных филоподии до плоских ламеллоподии. Все псевдоподии весьма подвижны и действуют подобно щупальцам, которыми клетка исследует окружающее пространство. Те псевдоподии, которые прикрепляются к субстрату, направляют клетку к этому наиболее адгезивному участку, а те, которым не удалось прикрепиться, перемещаются по верхней стороне клетки назад и там втягиваются. Этот процесс напоминает движение волн по поверхности в сторону, противоположную направлению перемещения клетки, и называется раффлингом (Блиох, Смолянинов, 1977- Small, 1988- Bray, White, 1988- Lee et al, 1994- Oliver et al, 1994).
В восьмидесятые годы рядом исследователей было показано, что молекулярный механизм описанной клеточной подвижности сводится к строго упорядоченной и регулируемой полимеризации актина в клетке. Так, было продемонстрировано, что движение ламеллоподии может быть парализовано цитохалазином, в то время как блокаторы микротрубочек не оказывали никакого эффекта на формирование псевдоподий и движение клетки (Malawista, De Boisfleury, 1982).
С использованием флуоресцентно-меченого актина было выяснено, что в ламеллоподии клетки происходит быстрый круговорот актина. При этом новые актиновые субъединицы встраиваются преимущественно в передний край ламеллоподии шириной менее 1 мкм, а затем перемещаются к её основанию, где имеет место деполимеризация филаментов (Wang 1985- Symons, Mitchison, 1991). Было показано, что большинство актиновых филаментов в ламеллоподии ориентировано своими плюс-концами по направлению к плазматической мембране клетки (Small et al., 1978), формируюч ортогональную сеть (Small et al. 1995), при этом градиент актина падает с конца к основанию ламеллоподии.
В 1996 году Александр Могильнер и George Oster предложили модель, позволяющую объяснить, каким образом вставочная полимеризация актина может создавать механическое усилие, толкающее вперёд ламеллоподию клеток эукариотов. Согласно этой модели, названной авторами «Elastic Brownian Ratchet», филаменты в ламеллоподии эукариотической клетки заякорены своими минус-концами в ортогональной актиновой сети, в то время как их свободные плюс-концы находятся в непосредственном контакте с поверхностью плазматической мембраны.
Вставочная полимеризация актина на быстро растущих плюс-концах филаментов становится возможной благодаря тепловым колебаниям актиновых филаментов, отклоняющихся от своего равновесного положения на углы, достаточные для вставки мономера актина в пространство между плюс-концом отклонившегося филамента и мембраной клетки. Обратное движение удлинившегося на один мономер филамента и создаёт механическое усилие, толкающее мембрану вперёд. Отсюда максимальная скорость движения ламеллоподии близка к скорости полимеризации актина на плюс-конце филаментов переднего края актиновой сети (Mogilner, Oster, 1996).
Таким образом, на сегодняшний день считается, что движение клеточной мембраны вперёд обусловлены процессом тредмиллинга, обеспечиваемым ростом актиновых филаментов на плюс-конце, организацией их в механически прочную сеть и последующей регулируемой разборкой филаментов на минус-конце (Wang, 1985). Типичная скорость тредмиллинга актина в клетке составляет около 5 мкм/мин (Symons, Mitchison, 1991), что на два порядка превышает скорость оборота чистого актина in vitro (Korn et al., 1987- Amann, Pollard, 2000). Этот факт является следствием того, что в клетке существуют механизмы контроля динамики актина, поддерживающие стационарную концентрацию мономеров на уровне, значительно превышающем критическую концентрацию чистого актина. Так, во многих клетках концентрация мономерного актина может доходить до 200 мкМ, что составляет 50% от всего актина клетки и превышает содержание актина in vitro (Korn et al., 1987).
1.2.2. ЯДЕРНЫЙ АКТИН Наличие и роль актина в ядре долгое время оставалась неясной. Однако после идентификации мономерного актина как ключевого компонента ремоделирующих хроматин-комплексов (Papoulas et al., 1998- Zhao et al.,
1998- Shen et al., 2000), a также обнаружения в ядре актиноподобных и актинсвязывающих белков (Blessing et al., 2004) ситуация изменилась.
Использование спецефических антител к определённым участкам молекулы актина позволило выявить различные, в том числе нетрадиционные, конформации ядерного актина (Gonsior, 1999- Schoenenberger et al., 2005-
Jockusch et al., 2006). Применяя несколько вариантов моноклональных антител, способных связываться с различными эпитопами (часть макромолекулы антигена, распознаваемая иммунной системой) молекулы актина (Milankov, De Boni, 1993- Gonsior et al., 1999), показало, что антитела по-разному распознают ядерный и цитоплазматический актин. В последнее время появляется все больше публикаций, свидетельствующих о том, что актин в ядре существует не только в виде мономеров (Боголюбова, 2009), но и в олиго- и полимерной формах (Pederson, Aebi, 2005- Percipalle, Visa, 2006- Vartiainen, 2007- Pederson, 2008- Бенкен, Сабанеева, 2011). Помимо этого, актин в соматических клетках, видимо, формирует новые, ранее не наблюдавшиеся олигомерные структуры, которые не распознаются фаллоидином (de Lanerolle et al., 2005). В силу своих размеров (42 кДа) мономерный актин, не имеющий сигнала ядерной локализации, может проникнуть в ядро путём диффузии через ядерные поровые комплексы. Наличие у актина двух сигнальных последовательностей экспорта, с которыми связываются экспортины, препятствует его накоплению в ядре (Wada et al., 1998). По-видимому, степень полимеризации актина в ядре, так же как и в цитоплазме, зависит от его концентрации и активности ряда связывающих актин белков. Их присутсвие в ядре было показано неоднократно (Nowak et al., 1997- Gettemans et al., 2005- Dingova et al., 2009).
Представления о функциях актина в ядре также претерпели существенные изменения. Первоначально предполагалось, что этот белок является компонентом ядерного матрикса и выполняет исключительно структурную функцию, однако к настоящему времени перечень функций ядерного актина существенно расширился. Мономерный актин учавствует в модулировании структуры хроматина (Zhao et al., 1998), а в виде олигомера необходим для эффективной транскрипции РНК-полимеразами 1 (Fomproix and Percipalle, 2004, Philimonenko et al., 2004- Kisela et al., 2005), 2 (Hofmann et al., 2004- Kukalev et al., 2005) и 3 (Hu et al., 2004). В частности, предполагается, что актин играет роль в сборке комплекса инициации транскрипции (Miralles, Visa, 2006) и на стадии элонгации (Hofmann et al., 2004), а также формирует и поддерживает структуру ядра (Krauss et al., 2002- Bohnsack et al., 2006).
1.3. АКТИН: СОДЕРЖАНИЕ КАТИОНОВ Молекула актина содержит также один прочно связанный ион двухвалентного металла. В природном актине это, по-видимому, В процессе выделения актина
§ 2+ обычно замещается на Са2+, так как сродство актина к Са2+ в 3 — 5 раз выше, чем к
§ 2+ (в интервале рН 7,0 — 8,0 КБ = 2−8 нМ и 10−30 нМ для ионов Са2+ и соответственно). Кроме того, молекула актина имеет 5−9 центров слабого связывания катионов (КБ = 0,15 мМ для ионов Са2+ и
§ 2+ и 10 мМ для ионов К+). Ион Са24, обнаруженный на карте электронной плотности Г-актина, находится в глубоком гидрофильном кармане, образованном фосфатными группами АТФ и остатками А^-11, С1п-137 и Азр-154. Предполагается, что этот Са2+ является прочно связанным ионом, локализованным в высокоаффинном центре связывания катионов. Один из центров слабого связывания катионов, по-видимому, локализован в Ы- концевом сегменте полипептидной цепи молекулы актина. Локализация остальных центров слабого связывания неизвестна.
Показано, что замещение прочно связанного Са~ на вызывает конформационные изменения в субдомене I и субдомене II малого домена молекулы актина. Однако являются ли эти изменения локальными или трехмерная структура
§--актина в целом отличается от структуры актина, содержащего Са24, неизвестно.
Так же, как АТФ, прочно связанный катион легко обменивается со средой. При удалении катиона уменьшается константа связывания нуклеотида с актином, что приводит к быстрой диссоциации АТФ. Диссоциация Са2+ происходит медленнее, чем диссоциация АТФ, и лимитирует скорость всего процесса. При замещении прочно связанного Са2+ на обмен нуклеотидов ускоряется.
Потеря катиона и нуклеотида приводит к инактивации актина, т. е. к потере его способности к полимеризации. Инактивации можно избежать, если АТФ и Са2+ удаляются из раствора актина в присутствии сахарозы.
Поэтому предполагается, что прочно связанные нуклеотид и катион необходимы для поддержания нативной структуры актина.
Инактивация актина сопровождается изменением спектра его собственной флуоресценции и увеличением количества реакционноспособных SH-групп. Кроме того, происходит агрегация мономеров, поэтому инактивация актина необратима.
1.4. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ АКТИНА Важным свойством актина является его способность к полимеризации с образованием линейного полимера — Ф-актина (Bershadsky et al., 1988- Korn et al., 1987). In vitro мономерный актин может существовать в растворе с низкой ионной силой. Полимеризация индуцируется добавлением 1 мМ кальция или магния или повышением ионной силы за счет добавления 100 мМ КС1 (Хайтлина, 1985- Pollard, 1982- Craig, 1982). Способность актина полимеризоваться in vitro позволяет детально изучить условия этого процесса.
Процесс полимеризации актина включает в себя две стадии: нуклеацию и элонгацию (Хайтлина, 1985- Bershadsky et al., 1988). На первой, более медленной стадии — нуклеации, происходит объединение небольшого числа мономеров в агрегат, называемый затравкой или зародышем, имеющим глобулярную форму. Затравками обычно служат тримеры или тетрамеры актина (Barden et al., 1982). Вторая, более быстрая стадия — элонгация, заключается в присоединении новых мономеров к образовавшимся затравкам с образованием нитчатых структур.
Полимер актина является полярной структурой благодаря упорядоченному распределению асимметричных единиц. Два противоположных конца актинового филамента различаются по скорости присоединения к ним новых субъединиц (Pollard, Craig, 1982). Структурно различить концы актинового филамента можно с помощью субфрагментов мышечного миозина, содержащих головку миозиновой молекулы (Ishikawa et стабильным, поэтому на (-)-конце идёт деполимеризация. После этого молекула АДФ, связанная с мономером актина, заменяется на АТФ и цикл повторяется (рис. 4) (Pollard, 1986- Wegner, 1982). barbed end pointed end
Xjw л,. л Г' j l—L^j^-./
Lj «S
ZZ7 y^ ZZZ/^
ATP ADP /~~7 ATP-actin
7 ADP.P.-actin y ADP-actin
Рисунок 4. Цикл полимеризации-деполимеризации актина (Pollard, 1986- Wegner, 1982).
Описанный выше цикл является результатом различия критических концентраций G актина для двух концов: 0,1 мкМ для (+)-конца и 0,7 мкМ для (-)-конца. Между этими концентрациями система находится в стабильном состоянии, когда скорости полимеризации и деполимеризации равны, а концентрация свободного актина остаётся близкой к 0,1 мкМ. (Pollard, 1986, 2000, 2003).
1.4.1. СКОРОСТЬ И СТЕПЕНЬ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АКТИНА Скорость полимеризации актина на разных концах нитей различна. Быстро растущим является конец нити, соответствующий «оперенному» концу стреловидных структур, образованных Ф-актином и фрагментами миозина. Конец, соответствующий основанию стрелы, является медленнорастущим. Используя в качестве зародыша полимеризации пучок актиновых нитей, с помощью электронной микроскопии измеряют скорость
Различия в константах скорости реакции означают, что при концентрации актина 0,5 мг/мл в физиологических условиях на «быстром» конце нити за секунду добавляется 70 молекул, а диссоциирует 2, на «медленном» конце добавляется 20 мономеров, диссоциирует 1. При концентрации актина 4−5 мг/мл нить длиной 3 мкм может образоваться за 10 — 12 секунд.
Предполагается, что транслокационный характер полимеризации актина связан с гидролизом АТФ, который сопровождает полимеризацию, но происходит медленнее, чем добавление мономеров. При высокой концентрации мономеров скорость удлинения нити намного превышает скорость гидролиза АТФ, в результате чего на обоих концах нити накапливается значительное количество субъединиц, содержащих АТФ или сравнительно долго живущий промежуточный комплекс АДФ-Ф. В равновесном состоянии концентрация мономеров и соответственно скорость их добавления резко падают, субъединицы, содержащие АТФ или АДР-Ф остаются только на «быстром» конце нити. Критическая концентрация полимеризации актина на концах нити, содержащих АТФ, снижается, причем на «быстром» конце сильнее, чем на «медленном», и такая «блокировка» «быстрого» конца нити создает условия как для деполимеризации на «медленном» конце, так и для регуляции динамики полимеров. Возможно, молекулярной основой подобной регуляции являются конформационные изменения актина при превращении АТФ в АДФ.
Критическая концентрация актина при полимеризации и степень полимеризации, или длина нитей, зависят не только от условий в растворе, но и от особенностей структуры актина.
Показано, что при неоптимальных условиях полимеризации критическая концентрация полимеризации (3- и у-изоактинов выше, чем критическая концентрация полимеризации а-актина. Кроме того, полимеры, образованные и у-актином, менее стабильны, чем полимеры а-актина. Причиной разной стабильности полимеров могут быть различия в С-концевой части полипептидной цепи актина и в области «шпильки».
В отличие от ситуации in vitro, в клетке регулируются не только скорость и степень полимеризации актина, но и переход от одной стадии полимеризации к другой. Эта регуляция осуществляется с помощью ряда актинсвязывающих белков.
1.4.2. АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ Более 50 белков в цитоплазме связываются с актином выполняя различные функции: регулируют объем Г-актинового пула (профилин), влияют на скорость полимеризации (виллин), стабилизируют концы нитей фрагин, а-актинин), сшивают филаменты друг с другом, или с другими компонентами (виллин, а-актин, спектрин, MARCKS, фимбрин), разрушают двойную спираль Ф-актина (гельзолин). Кроме того, специальные актинсеквестирующие белки связывают мономеры актина, высвобождая их для полимеризации по мере необходимости. В отсутствии таких белков концентрация Г-актина в клетке составляла бы 100 мкМ, что значительно превышает критические концентрации (Kiuchi et al, 2011). Активность белков 2+ регулируется Са и протеинкиназами (таблица 2).
Таблицы 2. Белки, связывающие F-актин
Белок M, kD Локализация и действие на Е-актин
Фасцин 55 филлоподии, ламелоподии, стресс-фибриллы, микроворсинки, акросома
Тропомиозин 2×35 стабилизирует Б-актин, предотвращая фрагментацию
Миозин 2×260 скольжение нитей
Минимиозин 150 движение пузырьков
Профилин 15 запасение в-актина
Скруин 102 Акросома
Вилин 92 микроворсинки
Дематин 48 кортикальная сеть эритроцитов
Фимбрин 68 адгезион. контакты, микроворсинки связ в пучки
Актинин 2×102 адгез контакты, микроворсинки связ в пучки
Спектрин 2×265+2×260 кортик сеть эритроц прикрепление к ПМ
Дистрофии 427 корт. сеть мыш волокон
АВР 120 92 Псевдоподии
Фмламин 2×280 Псевдоподии, стрессфибриллы сшивает в сети
Имеется пять мест действия белков: с мономером актина, с (+)-концом (оперенный), с (-)-концом (заостренный), с боковой поверхностью. Актин-связывающие белки могут быть чувствительны или нечувствительны к Са
1. Белки связывающиеся с мономером актина — подавляют нуклеацию (профилин, фрагментин — чувствительны к Са). Профилин с мономером способны надстраивать Б-актин, а фрагментин нет, блокируя и нуклеацию и
2"Ь ТТ о элонгацию. Не чувствительные к
Са ДНКаза и белок связывающийся с витамином Д — функционируют вне клетки.
2. Кепирующие (закрывают концы актиновых филаментов, предотвращая полимеризацию-деполимеризацию, способствуют прикреплению филамента к мембране) (+)-конец может быть блокирован кепирующими белками -блокирование элонгации и стыковки, способствуют нуклеации — появление укороченных филаментов (гельзолин, виллин, фрагмин). Кэпирующие-фрагментирующие белки — фрагментируют Ф-актин, вызывая переход геля в золь (гельзолин 90Ш. активируясь Са2+ 10−6М разрывает Ф-актин и связывается с его концами).
3. (-)-конец — инициирование нуклеации, подавление стыковки и элонгации -увеличение числа и уменьшение длины фрагментов. Акументин в макрофагах, бревин — сывороточный белок вызывает быстрое снижение вязкости раствора Ф-актина. Оба белка не чувствительны к Са2+. профиллином фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2) один из ключевых участников фосфатидилинозитольного пути передачи сигнала с поверхности клетки. Связывается с прфиллином и PIPI. Эти взаимодействия, по-видимому, обеспечивает связь между трансмембранной передачей сигнала и актиновым цитоскелетом. Важная роль профиллина в жизнедеятельности клетки следует из резкого нарушения клеточных функций в Saccharomyces cerevisiae, искусственно дефектных по профиллину (Haarer et al., 1990).
Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I): ДНКаза I представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Мп расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.