Актуальность темы
.
В последние годы значительно увеличилось производство и импорт трансгенной продукции. Крупнейшими производителями генетически модифицированных организмов (ГМО) выступают такие корпорации, как DuPont Canada Agricultural Product, Bayer CropScience, AgrEvo, Pioneer Hi-Bred, Dekalb Genetics, Northrup King, Rhone-Poulens, Plant Genetic Systems, N. V, Seminis Vegetable Seeds, AstraZeneca, Aventis, Novartis, Asgrow и абсолютный лидер — американская транснациональная корпорация Monsanto. Она же — мировой лидер в производстве и внедрении в сельское хозяйство наиболее продаваемых гербицидов: Раундап и Раундап-био. Фирмой созданы трансгенные устойчивые к этим гербицидам пищевые культуры сои, кукурузы, риса, пшеницы, ячменя, сахарной свеклы, картофеля. Фирма является также разработчиком технологий возделывания трансгенных культур с использованием этих гербицидов.
За десять лет коммерческого использования ГМ-культур объемы потребления, в частности модифицированной сои, составили: в России — 300 тысяч тонн, в странах ЕС — 50 миллионов тонн, в США — 500 миллионов тонн. Список разрешенных для использования в питании и кормах сельскохозяйственных культур на 2005 год, включает более 100 генетически модифицированных продуктов. При этом ежегодный импорт товаров, произведенных с использованием биотехнологии, оценивается в 650 млн долл. США. Внутренний ежегодный объём российского рынка биотехнологических товаров превышает 1 млрд долл. США. В связи с этим увеличивается вероятность поступления пищевой продукции, полученной из ГМИ, или содержащей компоненты из ГМИ, на внутренний рынок Российской Федерации.
Увеличение объемов производства связано с использованием генетически модифицированных источников в пищевой отрасли. В связи с потенциальной опасностью ГМИ, были разработаны правовые документы, регулирующие генно-инженерную деятельность и использование генно-модифицированных продуктов (ГМ-продуктов), которые в обязательном порядке должны подвергаться экспертизе и проходить госрегистрацию, а продукты, содержащие белок или ДНК, затем маркироваться.
Рынок продукции содержащей компоненты животного и растительного происхождения постоянно расширяется (8, 21, 22, 28). В связи с этим проблема контроля содержания в продуктах питания ГМ-компонентов становится актуальнее год от года. Во многом это определяется активным присутствием на рынке импортных пищевых продуктов, и особенно, сырьевых растительных компонентов, количество которых в будущем будет увеличиваться (29). Учитывая, что маркировка ГМ-продуктов не была в России обязательной до июля 2000 года, существуют опасения, что российский рынок переполнен ГМ-продуктами из Северной Америки, которые невозможно продать в Европе.
В настоящее время значительная часть импортируемых в Россию продуктов содержат компоненты из ГМИ (в основном сои). Трансгенные белки сои постоянно возрастающими темпами заменяют в продуктах питания биологически полноценные животные белки и растительные белки традиционных культур. Современные регламенты производства любых продуктов питания не ограничивают содержание в них трансгенных растительных белков, а только требуют их маркировки. Учитывая, что замена трансгенным соевым белком белков животных — сверхвыгодный бизнес, и без того весьма скудных по биологической полноценности, рацион не менее 100 млн. россиян станет на 60−70% еще хуже. Это обострит и без того весьма неблагополучное положение со здоровьем большей части населения России, особенно молодежи. Сейчас средний россиянин съедает в год 32 кг натурального мяса и рыбы, что на 40% меньше медицинской нормы. При продолжающейся замене животных белков соевыми он в 2006;2007 годах уже Будет съедать только 20−25 кг животных белков (20).
В 2005 г. территориальными управлениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по субъектам Российской Федерации, исследовано 18 872 пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов (2004 г. — 12 956, 2003 г. -4300). При проведении исследований выявлено 1443 пробы (2004 г. — 1552, 2003 г. — 511), содержащие компоненты ГМО, что составило 7,6% (2004 г. -12%, 2003 г. — 11,9%). В импортируемых пищевых продуктах компоненты ГМО содержались в 6,5% (2004 г. — 14,51%, 2003 г. -14.8%) (9).
Наиболее часто ГМО встречаются в мясных продуктах — 15,8% (2004г. — 20,5%, 2003 г. — 14,8%), группа продуктов «прочие» (в основном растительные белки) — 10,8% (2004 г. — 16,7%, 2003 г. — 16,4%), птицеводческие продукты — 9,1% (2004 г. -15,4%, 2003 г. — 29,5%).
В связи с этим необходимо идентифицировать продукцию содержащую примеси ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения. На сегодняшний день это является одной из актуальнейших задач биотехнологии. Для этого необходимо разработка и создание высоко эффективных диагностических методик для выявления трансгенных растений в пищевых продуктах, продовольственном сырье, семенном материале, кормах животных, лекарственном сырье. Основой современных методик служат качественные и количественные методы. Данные методики должны позволять проводить определение ГМИ как термообработанных продуктах так и нативных.
Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлось совершенствование методов идентификации примесей ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.
В задачи исследований входило:
— разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения ГМИ;
— сравнительная характеристика методик выделения ДНК;
— совершенствование методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;
— разработка модифицированной методики качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
— совершенствование методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
— проведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
Научная новизна.
Разработаны модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02). Разработанные методики позволяют получать свободную от ингибирующих примесей и в необходимых количествах ДНК из различных продуктов, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. ДНК пригодна для качественного и количественного анализа. Методики могут использоваться для экстракции и очистки ДНК как многокомпонентных смесей, так и однокомпонентных.
Усовершенствованы методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (Si02) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов.
Проведены исследования по совершенствованию методик определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени, включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (SiC^) или использование ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), амплификации ДНК с мечеными ДНК-зондами (представляющие собой олигонуклеотид, несущий флуоресцентный краситель и флуоресцентный гаситель), используемые для качественной и количественной оценки продукта.
Разработана модифицированная методика качественного обнаружения ГМИ с использованием 35S промотора, NOS терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающую ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени.
Показана высокая чувствительность и специфичность разработанных количественных методик модифицированных методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40−3-2, кукурузы линии MON 810), позволяющих обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1% как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных. Время анализа сокращается в 1,5−2 раза.
Проведены мониторинговые исследования в сырье и продуктах питания с использованием разработанных методик, показавших возможность использования их для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
Практическая ценность.
На основании результатов исследований разработаны:
— Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения.» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
— V Международной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции» (Москва, 2004 г.).
— заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2005 г.);
— межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2006г.);
— V Международной научной конференции «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва, МГУ ПБ, 2006 г.
Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.
Положения, выносимые на защиту.
— разработка и оптимизация методов выделения и очистки ДНК из продукции животного и растительного происхождения для качественного и количественного определения искомой ДНК;
— совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР с электрофоретической детекцией ампликонов;
— совершенствование методик качественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
— совершенствование методик количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени;
— сравнительная оценка методов по специфичности, чувствительности и быстродействиюпроведение мониторинговых исследований по выявлению фальсифицирующих примесей из ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
выводы.
1. Разработанные модифицированные высокоэффективные методики выделения ДНК с использованием ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), а также с использованием сорбента Silica (Si02), позволяют получать свободную от ингибирующих примесей ДНК и ускоряют время выделения ДНК в 1,5−2 раза.
2. Предложенные методики используются для экстракции и очистки ДНК как однокомпонентных, так и многокомпонентных смесей животного и растительного происхождения в целях последующего качественного и количественного анализа.
3. Усовершенствованные методики качественного определения ГМИ (сои и кукурузы), включающие экспрессное выделение ДНК с использованием сорбента Silica (БЮг) или ионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромида), постановку ПЦР с использованием праймеров на лектин и крахмальную синтазу и последующим электрофоретическим разделением ампликонов, ускоряют определение ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения.
4. Разработанная модифицированная методика с использованием 35S-промотора, NOS-терминатора и внутреннего положительного контроля в одной реакционной смеси, включающая ускоренную пробоподготовку и оценку результатов на основе ПЦР в реальном времени, сокращают время качественного определения ГМИ в продуктах растительного и животного происхождения до 4 часов.
5. Модифицированные методики количественного определения ГМИ на основе ПЦР в реальном времени (сои Roundup Ready линии GTS 40−3-2, кукурузы линии MON 810), высоко специфичны и позволяют обнаруживать в образце ГМИ менее 0,1% как в сырье, так и в продуктах питания, в том числе термообработанных.
6. Разработанные методики определения и идентификации ГМИ по основным характеристикам не уступают зарубежным аналогам, имеют более низкую стоимость и сокращают время анализа в 1,5−2 раза.
7. Проведенные мониторинговые исследования продукции животного и растительного происхождения с использованием разработанных методик показали возможность их использования для скрининговых и количественных тестов выявления недекларированных ГМИ в продуктах животного и растительного происхождения.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.
На основании результатов исследований разработаны: — Методические рекомендации «Качественное определение ГМИ в продуктах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения» (утверждены отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.10.2006 г.).
