Исследование оптических свойств соединительных тканей методами когерентной оптики и оптоакустики

в последние несколько десятилетий в биомедиципе иолучили широкоераеирострапеиие и развитие оигические мегоды, исиользу1оии1е когереитиое, вчастностилазерное, излучение как средство бесконтактной (иеразруи1а1он1ей) микроимакродиагностики биологических сред и ткаией. Толчком к этому иослужило созданиеисгочииков светового излучения иринцииишилю нового гииа — лазеров, Koropi>ieхарактеризуются высокой стеиеиыо моиохроматичиости, времеиной инросфаистве1Н1ОЙ когерентности, низкой расходимостью иучка, а гакже высокойсгенеиью иолярнзации и илотности моннюсти излучеиия. Помимо этого, во Н10гихтипах лазерных источников иредставляется возможным быстрая нерестройка длиныволны генерации в сочетаиии с имнульсиым режимом излучеиия. В часгности, появилась возможность исиользования тех или иных тинов лазеров со сненифнчнымнабором параметров в зависимости от нрнроды и свойств б1ю-югического объекта. Сисклр задач, решаемглх лазерными средствами диагностики в бномедннинечрезвычайно ннфок. Данная работа сфокусирована иа ироблсме лазерной диагностикигютоков биологических жидкостей, изучении и моде-и1роваиии оитических свойствсоедииительных тканей н нх нзменений ири pa3jni4Hbix физиологических ипalOJЮГичecкпx состояниях, а также иа различиых асисктах взaи^юдeйcгвия биоткаис!" ! сдегекгиру1они1м когеретиым излучением прпме1Н1тельпо к задачам ранней днагностнкножогов кожи и мониторинга коннентрапии глюкозы в биотканях и in vitro и in vivoусловпях. В последнее время данные методы эффективио исиользуютея иаучиымсообществом и привлекают всё возрастаюн1сс внима1Н1е медннинских ненгров всегомира вследствие уснетного Н1ирокого нрактического ирименения да1Н1ых средсгвлазерной диагиостики для бесконтактного комнлексного ана1нгза не rojH>KO огде-н>ногооргана нлн участка ткани, ио и состояния организма в нелом. Как извест1ю, при миогих иатологиях нроисходяг измеиения дииамическихиараметров микроциркуляцин крови и лимфы, а также самой структурь1 бионотоков. Иодобиые измеиения иесут в себе важиую диапюетичсскую информацию. Па да1Н1ьн'1момент существует два основных подхода к проблемам днашостнки кровотока понределения его нараметров в условнях ш vivo, а нменно: енекл-ннтерферомегрпя нлазерная донлеровекая флоуметрпя. В спекл-ннтерферометрнн нада1они1Й когерентныйсветовой нучок рассенвается случайным образом на форме1нн, 1х jjieNieinax кровн, формнруя енецпфическую пространственную дннамнческую снекл-кар1нну. ДанныГ! меюд устанавлнвает связь между ширнной снектра MOUIHOCIH флуктуаниГ! нптенспвностн рассеянного лазерного излучення н кннетическнмн характсрнстпкамнкровотока в кагн1ллярах. Интененвность флуктуаннй спекл-картнны п нн1рнна снекгразависят от ряда факторов, такнх как число сосудов, присутствие сосудистыхогветвлсннй, плотность каннллярной сети, структура слоев TKaiHi и г. д. Однако, внастоян|, ее время дан11ая техника может эффективно иснользоваться только длярегистрации относительных измерений скорости потоков биологических жидкостей. Для задач абсолютиого измереиия скорости метод спекл-иптсрферометрии требуетдоно-ннпельного усовершенствования и модификации. Для измерения скоростных характеристик потоков в системе ниркулянии кровииcиoJи, зyeтcя также метод лазерной донлеровекой флоумефнн, в котором донлеровскн!" !снгиал, исиользуемый для аншн1за, оиределяегся ио]юже1И1ем дoнoJHИIгeльнoгoчастотного максимума, возиика1ои1его в сиектре как следствие флукгуациГ! интенсивности расссяииого излучения. Профиль огиба1ОИ1ей часгогного снектраопределяется регулярным дрейфом биологической жидкости в ка1И1лляре. Одиакоимеетея ряд онределёин1>1х ограничс! Н1Й, накладываемглх как на нсслсдуемый объект, гак и на нараметры детектируюи1его лазер1юго нучка, которые еун1еетвенным образомсужают границы ирименимоети данного метода. К пх чнелу следует отнеети, вчасгности, (1) условие ламинарности двнжения нотока крови в исследуемом сосуде, атакже от1юсительно иротиворечивые требования (2) онределённо!" ! орнептацнилазериого нучка отиоеиге-и.ио исследуемого кровеносного сосуда, (3) жёсткойфокусировки зопдируюи1его лазериого иучка иа уедииёипый сосуд, и (4) минимальпогорасхождения детектиру1ои1его луча нри расиространении в биогканн. Кровеноеныесосуды диаметром норядка 40 мкм в достаточной стенени удовлетворяют дан1юмуусловию. Одиако при проведении эксиеримешов с мепьип1ми размерами световогопяпш (порядка 15 мкм) требуется модерпизация дапиого метода. В пастоятее время6ojn>iinincTBo суи1ествую1цих оитических методов диагностики потоков биологпчсскпхжидкостей адаптировано, в осповпом, для определепия CKopocnn. ix и объсм1и.1Ххарактеристик кровотока в микрососудах. Поэтому опенка кииетических нарамсгров: и1мфотока и их измеиеиия ири различиых патологических состояниях на сегодняшнийдень иосит, в осиовном, качсствеиный характер. 13 то же время мегоды KOjni4ecTBennoroапшппа лимфотока, особепгю в лимфатических сосудах малого диаметра, иока иеразработаиы. Разработка и усовери1еиствование таких методов, а также их адаитания кпроблемам измерения скорости кровои ]Н1мфогока в уедппёппых мпкроеосудахявляется одной из задач, рен1аемых в рамках данной работы. Следуюн1еГ1 нроблемой рассмотренпя является пзучеппе оптпческпх свойств ожоговкожп с исиользованнем онгической модели ожогов кожи, разработаииоГ1 в иастоян1ейдиссертапнп. Да1Н1ая моде]н, связывает особенностп квазпупругого рассеяппя свега слпжропиркуляцией крови в кожиых слоях в фпзпологичсскпх п пагологпчеекпхсостояппях (в частности, при повсрхпостных ожогах) п ncnojH/зуегся нрп проведепппдшн, нейн1сго корреляпионого анализа. Как известно, новерхностные ожоги снособнглнриводить либо к значительным иарушеииям, либо к нолио! остагювкемнкроппркуляпип крови в коже. Гочиое оиределепие глубины ожогового гюраженнякожи является проблемой чрезвычайиой важиости для клпиическо1″ '1 мсднпниы. В случаеглубокнх ожогов наличие пиркуляпии крови в коже может 6 °F.ITI. оиределеио путёммехаиичсской инснекцни с исиользованием тонкой мсталлнчееко!'! иглы. Дляскорсйнюго восстановления участков норажёнгюго ожогом кожного нокрованеобходимо точное онределение глубины иоражеиия в целях дши^неГннего удалениямёртвого е-юя кожи. Для этих пелей требуются более гочпые методы пзмерепия, иежелипроцедура пробпроваппя иглой. Таким образом, разрабогка и усовери1енствова1Н1екогерентных онтических методов для диапюстики ожогов кожи иа основе О1ггическихмоделей являегся весьма а1стуальной ироблемой. Лазериые методы диагностики, используемые для этих целей, включают в себялазериые донлеровские методы и LASCA метод (LAser Speckle Contrast Analysis), снеклинтерферометрию, диффузиошю-волновую снектросконию (ДПС), онтнческуюдонлеровекую томографию (ОДТ) и связаиы с анализом процессов мцогокрашогорассеяния в случаЙ11О-неод1юродных мутных средах, а также, во многих случаях, стехникой моделирования данпь1х процессов с использованием методов Монте-Карло.Процедура измерения является схожей для всего мпогообразпя данпых мегодов. Придпфракцпп когерентного свега па движунц1хся частнцах (цацрнмер, ')pnrpoiunax вкровепосной капилляриой сети) в рассеивающих средах (таких, как кожа) наблюдаютсявременные флуктуацнн иитеисивиости рассеяиного света. Скорость движущнхсярасссиватслей определяется посредством измерения Н1иринь1 сиек’гра мониюстифлуктуацпй ипгенсивпостп рассеяппого поля, что лежит в оеиове больпн1истваупомянутых методов. Очевидно, что на нараметры измеряемых сигналов снособны влиять, [юшмоскорости рассеивателей, такие факторы, как оптичеекие свойства мугиых сред, вчастности, нриеутствие в даиных средах неподвижных рассешиггелей (напрпмер, мёртвого ожогового слоя кожи, выстунающего в качеетве негочника С1агическогорассея1Н1я). Таким образом, ироблема влияния структуры тканн н её онгическихиарамегров иа ширину снектра подлежит тнщтельпому и глубокому изучеиию. Киастоян1ему времени пока ие иолучеиы какие-либо значительные pe3yjH. TaTbi вианравлении разработки оптпческих моделей рассся1И1я когсрситиого излучення впатологической (в частности — ожоговой) ткани. Вторая глава иастояи1ей работыиосвян1еиа частичному восиолиеиию этого пробела. И, паконец, заключителыюй задачей, решаемой в рамках даииой диесертации, является изучение оптико-акустическим (ОА) методом высокого времеиногоразрешення онтичсских свойств coeдинитeJи>иыx ткаией и их изменення как функцииконцентрации глюкозы. В иоследиее время бьиш предприияты зпaчитeJи>lн>Ie уешн1я внанравлении иоиска и развития точных и надёжных методов бесконгакгного измереиияоигичееких свойств биотканей и их измеиеиий в зависимое! и отуровия содержащейея вК) ппх глюкозы. Такие методы представляют особый иптерее как для пацпентов, страдаюишх сахарным диабетом, так и нримените-и, но к ситуациям оказаиия первоймедицинской помощи, в которых необходим пепрерыв1н.1Й KoinpojH, содсржанпяглюкозы в крови пациентов. Метод измерения коицентрании гJнoкoзы in vivo, иснользуюпщйся в настоян1се время, нредставляст собой контактный химическийаишн1з крови, который является для нациентов в еун1ественной степени иеириятгнлм иболезне1Н1ым. Использование же оитических методов диагноетнкн HO3BOJHIJIO бы снятьпроблему дискомфорта ири проведении нодобных тестов. Па данный момент разработанцел1лй ряд таких методов, исио-н^зуюн1нх «неразруншюиин» !" npiHHiHH нзмеренняконцентрацин пнокозы в биотканях, включающий в себя ноляриметрню, инфракрасную (ИК) енек1роскопию поглон1е1Н1я, Рамаповскую спектроекоппю, флуоресцентныеметоды, ИК снектросконию рассея1П1Я, фото-акуетическую спектроско1Н1ю нопшн1ення, н онгическую когерентную томографню (ОКТ). Уномянутые методьг HCHOJH. jyioTpa3JHi4Hbie неточники и сиособы светового облучеиия и ехемы дегектироваиия еиоеледуюи1им анализом исходяни1х сигналов. К сожалению, ии один из эгих методовпока пе пангёл нтрокого практического нрнмеиения. Оенов1н, 1 м ограниченнем длябо-н, 111ей части уномянутых методов являетея ннзкое зпачепие отионюиия «сигпал-н1ум"(OCIII) п высокая стоимость аншн1за. Одннм нз наиболее иерепектпвпых ренюннйданноГ! нроблемы являетея ис1ю-н/зованпе ОА мегода высокого времеппого разрснгепня, в основу которого положен эффект глюкозы как фактора, вызываю1цего умепьп1епперасссяпия света в биотканях. В лазерной оптоакуетпке иепользуегея iiNniyjn. eHbH'i режимоблучення нсследуемой среды н детектирование возбуждаемой нрн этом акуетнчеекойволны с высоким временным (и, следовательно, — нространственн1>1м) разреп1е1Н1ем. liэтом случае информацию об онтических евойетвах исследуемой среды несет какамнзнпуда, так и временной нрофши, возбуждаемой BOJHH, I. Эке1юненциа-и>ньн'1 наклоннрофнля ОЛ сигнала, сгенерированного в среде нрн онределёиных условиях облучения, нреднолага1опи1х временное О1раниче1ше давления, оиределяегся зиачениемэффе1сгнвиого оитичеекого оелабле1Н1я в данной ереде. Значение амплитудыакустнческого сигнала определяетея оитичееким иоглон1еннем в TKaini. Гаким образом. I Iисио: и, зуя лазериый ОА метод, возможно исследовать раснределение ноглощённойлазерной энергин в многослоЙ1н.1Х средах с ненулевым показателем иоглои1ения, мгонозволяет в итоге измерить онтические свойства да1нн"1х сред. Лазерная огггоакусгнкахороню зарекомендовала себя как надёжнглй метод измерения онтических свойсгвбиотканей. В отличие от чисто онтических методов, выно: н1якмцнх нзмерення раесея1Н1Яв тканях, ОА метод является более точным и специфичиым. В ходе одцого огггическогоэкснернмеита возможно измерить лини. два зиачения: нада1ОН1у1о иогражённую/црошедшую энергию (иигенснвность) лазерн1лх нмнульсов. С нолюнц^юОА метода высокого разрешения иредставляется возможиым измереиие ио-н1огонрофнля раснределення ноглощённой лазерной энергии (до п=1000 и более зиачений), увеличивая, тем самым ОСШ. Более того, в ньезоэлектрическнх детекторах возможнодостичь значительно меньиюго отноеительного уровия тенлового Н1ума ио сравненню свеличшюй дробового шума в фотодетекторах. Однако, до последнего временииснользование ОА метода ие расиростраиялось на измереиие коицеитрацин rjHOKO3bi вживьгх биоткаиях. В иаетоящей работе даииый метод был адагггирован к задачамизмсреиия эффективного коэффнщшнта ослабления/рассеяния и его изменений! какфункцш! концентрации пнокозы в реальиых биологических ткаиях в условиях in vivo. ••*Таким образом, peHieiHie вышеноставлс1Н1ых нроблем, а также разработка новыхмегодов лазерной диагностики, исиользуюнн1х уиикшиинлс свойства KorcpeirrHoioнзлуче1Н1я, являе1ся чрезвычайно важной н актуальной задачей для био-югни имедицины как с научной, так и с ирактической точек зрения. Целью диесертациошюй работы является изучсиие особенностей меха1Н1змоввзанхюдействия лазериого излучеиия с био-югическимн тканями соедиин1е-ц>ного тина, включая физические, биохимические, биологические и физиологические аснекты, атакже развитие теоретических и эксиеримеитальиых оеиов когереиинлх и лазерногоонтико-акустического методов измереиия в биотканях нрнменительио к задачамбеско1ггактиой диагностики нотоков биологических жидкостей, ожогов кожи игорннга концентрации глюкозы в условиях in vivo.12Задачи исследования1. Развитие метода оитики еиеклов в целях количеетвеииой оценки дииамическиххарактериетик потоков биологических жидкоетей и его адаптация к задачамдиагностики лимфогока.2. Измереиие динамических нараметров V (средиее ио времени зиачсние скоростнбнонотока) и Zv (нространственно-временное раснределение скоростей, ирисутствующих в биопотоке, но диаметру сосуда) а также их измеиений нриразли1чиых натологиях еистемгл микроциркуляции лимфы.3. Разработка оптпчсекой модели ожогов кожи с целью нровсдеция дшц, нейи1егокорреляционого анализа.4. Исследование зависимости статистических свойств донлсровских сигналов ог свойствожоговой ткани, равно как и от скорости иодкожиого кровотока.5. Изучсиие нотсипишп>1п>1х возможностей онтико-акустического метода высокоговременного разрешения как средства бескоитактиого моиигориига копцентрацциглюкозы в модельиых средах и биоткаиях, а также его иеиользова1П1е в измсрсиииоптических свойств модельных сред и еоедигппелыюй биогкани (вюпочаяколлагепосодержащую ткаиь и цельную кровь) как функции коице1гграции глюкозы вусловиях in vitro и in vivo.6. Изучсппе мехапизмов взаимодействия глюкозы с биоло1ическими гкаиямисоединнтельного тина, вюпочая физические, биохимические, био-юп1ческие ифизиологические аспекты. Научная иовизна работы1. Предложеп метод количествеппой оценки скоростиых параметров движеиия крови илимфы в микрососудах.2. Проведеп aHajni3 време1П1Ь1Х измепепий дипамики лимфотока иод влияпиемJПlмфoтpoппoгo фактора.133. Разработана онтическая модель ожогов кожиизмерены автокорреляционныефункции флуктуации иитенсивноети рассеянного когерентного излучеиня в однондвухслойных фантомных мутных средах, моделируюн1нх ожогн кожи-исследованы зависимости статистических свойств доилеровских сигиалов ог свойствожоговой гкаин и скороеги иодкожного кровотока.4. Изучены ногенциальиые возможности онтико-акустического меюда высокоговременного разрешения ирименительно к задачам бесконтактного моннгорингаконцентрации глюкозы в различных вндах соедииительноГ1 биоткаии, вюночая склерун HejH, Hyio кровь, а также нроаналнзированы его нринци1Н1а: н, ные нренмун1ества наддругими онтическими методами при нроведе1И1И даиных нзмерегнн*!.5. Детально цзуче1н>1 физические, биохимические и физиологические аснектывзаимодействия глюкозы с раз-н1чными тннами модельных сред и биологическихгканейнроаналнзнрованы OCO6CIHIOCTH взаимодейсгвий „глюкоза-биоткань“ вусловиях in vitro н in vivo.6. Проведён аншн1з и сравнение эффеюгов, вызываемых глюкозой н манннголом, наонтнческне и физиологические евойетва цельной крови. Достоверность результатов теоретического аиализа иодтверждеиа -)кеиеримеигалынлмирезультагамн. Экснериментальные данные аг1шн1знровалиеь н coHoeraBj^jHieb сизвестиыми даннымн других эксиеримеитши, иых исследованнй. Достовер1юетьэкснернментальных результатов нодтверждаетея сведеннямн из лнтерагуры. Практическая значимость работы1. Полученные результаты экснериментшн, ных иеследоваиий екоросги бионотоков invivo методом онтики сиеклов ноложены в основу детального нзучения не-н1нейно1» 1динамики в лимфатической и кровсиосиой системах живых организмов енрос1ранстве1НН)1м разренюнием норядка размеров лазерного нучка (5−10 мкм) нвремен1н>1м разрен1еиием норядка 10″ ^ сек.142. Результаты экснерименгальных исследований, 11олуче1П1ые с использованиемкорреляционной техники рассеяния евета, иреднолагается нснользовать в основе новоголазерного мегода диагностики микроциркуляции крови в коже, а также для нростой игочной оценки толщины ожогового слоя кожи в условиях in vivo.3. Высокая снснифичность и селективностг, лазерной оптоакустпкп к измереппямкопцепграции глюкозы в модел1>пых средах п бпоткапях соедииигсльного TiHia, нродемонетрнрованные в экснсриментах в условиях in vitro и in vivo, свидетельетвуют овысоком иотенциале дан1юго метода как бееконтактного средства диапюстикибиотканей с CHJH>HI, IM рассеяннем и ненулевым ноглощением. Основные нринцнны ОАметода, адантнрованного для генерации и детектирования акустичееких сигналов вбиосредах в условиях in vivo, нредгюлагается исиользовать ири создании сенсора11р1И1цигн1алыю нового тина, снособ1юго осун1ествлять бысгрый и надёжныйбееконтактный мониторинг глюкозы у диабетических нацией гов. Исследования, описаииые в дайной работе, бьши выполнены в рамках совмеегпойросспйско-американской нрограммы U.S. Civilian Research & Development Foundation (СК01*')-РФФИ «Новые возможности для молодых учёных» (1998), российскоГ! федеральной нрограммы «Интеграцня '2000», Государе гвенного контракта № 02.442.11.7243, шифр 2006;РИ-19.0/001/028, федеральной целевой научно-техннчеекойнрограммы «Исследовання и разрабогки, но нриоритетиым направлениям развитнянауки и техники» на 2002;2006 годгл, а также поддержаны программой InternationalSoros Scientifie Education Program для аенирантов вузов (1996 и 1997), амернканекнмфондом CRDF для независимых государств бывн1его Советского Союза носредегвомгранта No. RBl-230 (1997), фондом U.S. Air Force Office of Scientific Research (2002), aгакже грантом РФФИ № 04−04−48 279-a «Изучение ироцеееов взаимодействиядинамических биоснеююв с жнвыми системами» (2005;2006).Основные научные ноложсння, выноснмыс на занщту1. Разработай новый метод, оеиова1И1ый на дифракции ефокуеированных лазершлхпучков (епекл-микроскония), иозволяюищй с высоким иросфанственным разренюннем15измерять скорость нестационарных нотоков лимфы и крови в уединённых мнкроеоеудахв условиях in vivo.2. Вклад ненодвижных рассеивателей приводит к сун1ественному уме1н.1пени1о ннфиныснекгра донлеровского сигиала.3. Лазериый онтико-акустичеекий метод адантирован к задачам измеренияконцентрацин глюкозы в соедииительных тканях (склера, кровь) in vivo. Установлено, что влияние глюкозы иа оитические свойства биотканей выражается ие только вуменьшенин эффективного коэффициента ослабления в ткани, ио и в измеиении слененнгндратацнн соединнге-нл1ой TKaFiH и ее морфологии, нронеходяни1х вследствиеадаитации к гинеросмотичееким условиям.4. С исиользоваиием электронной микроскоиии установлено, что глюкоза снособнаизменять морфологию эритроцитов в крови, что выражается в их траиеформации издвояковогнутых дисков в дегндратирова1шые сфероиды с иоверхиост1н>1мнннпюобразными выстунами. Апробация результатов и публикацииРезуди. гаты днссертациотюй работы обсуждшн1сь н докладывалнсь на следуюнн1ХМеждународных конференциях:1. International Conferenee SPIE on I Iolography and Coherent Optics, Chernovtsy, Ukraine, 1993.2. 5th International Conference SPIE on Laser Applications in Life Sciences, Minsk, Belarus, June 28 — July 2, 1994.3. International Symposium on Biomedical Optics BiOS Europe' 1994, Lille, France, Sept.6−10, 1994.4. 5th Congress of the Asian-Pacific Association for Laser Medieine and Surgery, Tel Aviv, Israel, Nov. 20−25, 1994.5. International Congress on Laser in Medieine and Surgery «Laser — 95», Munehen, Germany, June 21−23, 1995.166. International Conferenee SPIE on Light & Biological Systems, Wroclaw, Poland, July 37, 1995.7. International Conferenee «BiOS Europe' 95», Barselona, Spain, Sept. 12−16, 1995.8. International Workshop on Nonlinear Dynamies and Struetures in Biology and Medieine: Optical and Laser Technologies, Saratov, Russia, July 8−14, 1996.9. Coherence Domain Optical Methods in Biomedieal Seience and Clinical Application, International Conference SPIE BiOS'97 San Jose, CA, USA, Feb. 8−14, 1997.10. International Conference on Laser Physics, Berlin, Germany, July 6−10, 1998.11. 17″ ' Annual Houston Conferenee on Biomedieal Engineering Research, Univ. of Houston, Houston, Texas, USA, Feb. 11−12, 1999.12. International Conference on Advances in Opties for Bioteehnology, Medicine andSurgery, Kailua-Kona, Hawaii, USA, 1−6 August 1999.13. International Conference SPIE BiOS'2000, San Jose, CA, Jan. 20−26, 2000.14. 2002 Gordon Researeh Conferenee on Lasers in Medieine and Biology, July 14−19Kimball Union Academy, Meriden, NH, 2002.15. International Conference SPIE BiOS'2003, San Jose, CA, Jan. 25−31, 2003.16. International School for Junior Scientists and Students on Opties, Laser Physics andBiophysics, Saratov I-all Meeting (SFM'O5) Saratov, Russia, Sept. 27−30, 2005. Публикации: Основные результаты диееертании опубликованы i? 19 работах, написанных совместно с другнмн авторами:1. Bednov А.А., Ul’yanov S.S. Investigation of dependenee of dynamic partially developedspcckle-llelds contrast on rough surfaces statistieal characteristies // Proc. SPIE. 1993.Vol.2008. P.273−279.2. Ul’yanov S.S., Tuchin V.V., Bednov A.A. Investigation of spatial-temporal eorrelationfunctions of dynamic spatially inhomogeneous speckles and their applications in blood flowdiagnostics//Proe. SPIE. 1995. Vol.2326. P.452−458.173. Bednov A.A., Brill G.E., Tiichin V.V., Vl’yanov S.S., Zakharova E.I. Blood and lymphflow measurements in microvessels using foeused laser beam diffraetion phenomenon // Proe.SPIB. 1995. Vol.2370. P.379−383.4. Ul’yanov S.S., Kiizmin S.Yu., Bednov A.A., Tiichin V.V. Praetieal works in the speckleoptics for the subspccialitics: physics of laser measurements and biomedieal opties // Proc.SPin. 1995. Vol.2525. P.427−432.5. Ul’yanov S.S., Tiichin V.V., Kiizniin S.Yu., Bednov A.A. Teaching of optical diffractionmethods in biomedicine to undergraduates specializing in optics // Proc. SPIH. 1995. Vol.2525.P.I 17−122.6. Bednov A.A., Zakharova E.I., Tiichin V.V., Brill G.E., Ul’yanov S.S. Lymph flowdiagnostics using speckle-microscopy//Proc. SPIE. 1996. Vol.2630. P.134−141.7. Bednov A.A., Ul’yanov S.S., Tiichin V.V., Brill G.E., Zakharova E.I. Speckle diagnosticsof shuttle-stream lymph and blood flows // Proe. SPIE. 1996. Vol.2678. P.416−422.8. Bednov A.A., Ulyanov S.S., Tuchin V.V. Brill G.E., Zakharova E.I. In-vivo lasermeasurements of blood and lymph flow with a small number of scatterers // Proc. SPIT. 1996.Vol.2732. P.27−33.9. Бедное A.A., Ульянов С, Тучин В. В., Бршль Г. Е., Захарова Е. И. Исследованиединамики: и1мфотока методами сиекл-иитерферометрии // Изв. вузов. Прикл. иелинейиая динамика. 1996. Т.4, JSTi'6. 45−54.И). Bednov А.А., Galanzha E.I., Tuchin V.V., Ulyanov S.S., Brill G.E. Investigation ofstatistical properties of lymph-flow dynamies using speckle-microscopy // Proc. SPIH. 1997.Vol. 2981. P.181−190.11. Bednov A.A., Ul’yanov S.S., Tuchin V.V., Brill G.E., Galanzha E.I. Investigation of lymphflow dynamics using methods of speckle-interferometry // Proc. SPIH. 1997. Vol. 3177. P. 8996.12. Ul’yanov S.S., Tuchin V.V., Bednov A.A., Brill G.E., Zakharova E.I. The application ofseckle-interferometry for the monitoring of blood and lymph flow in microvessels // Lasers inMedical Seience. 1997. Vol.12. P.31−41.1813. Zinmyakov D.A., Mishin A.B., Bednov A.A., Cheung C, Tuchin V.V., Yodh A.G. Timcdcpcndcnl speckle contrast measurements for blood microcireulation monitoring // Proc.SPIB.1999. Vol.3599. P. 157−166.14. Bednov A.A., Cheng C, Ul’yanov S.S., Yodh A.G. Coherent diagnostics of burned skin: experiments with phantoms // Proc. SPIE. 2000. Vol.3915. P.275−284.15. Bednov A.A., Karabutov A.A., Savateeva E.V., March W.F., Oraevsky A.A. Monitoringglucose in vivo by measuring laser-induced acoustic profiles // Proc. SPIB. 2000. Vol.3916.P.9−18.16. Bednov A.A., Tuchin V.V., Brill G.E., Galanzha E.I., Ul’yanov S.S. hivcstigation of lymph (low characteristics using speckle-interferometrical method // Proc. SPIE. 2001. Vol.4515.P. 177−184.17. Bednov A. A., Savateeva E.V., Oraevsky A.A. Opto-acoustic monitoring of blood opticalproperties as a funetion of glucose concentration // Proc. SPIB. 2003. Vol.4960. P.21−29.18. Bednov A.A., Ulyanov S.S., Cheng C, Yodh A.G. Correlation properties of multipleseattered light: Implication to coherent diagnosties of burned skin // J. Biomed. Opt. 2004.Vol.9, JVi'2. P.347−352.19. Ulianova O.V., Ulyanov S.S., Sazanova E.V., Zhang Zh., Zhou S., Liio Qi., Zudina /., Bednov A.A. Inaetivation of baeterial eells by dynamie low-coherent speckles: mathematicalmodel of photoprocessing// Proc. SPIH. 2005. Vol.5771. P.357−364.Личный вклад автора заключался в разработке и создании эксиеримеитальиыхуегаиовок для бескоитактиого мопиториига глюкозы в модельиых средах ибиологических ткаиий в условиях in vitro и in vivo ОА методом, а также в еоздаиги! усгаиовки для проведсиия иеследоваиий с фантомными моделями ожогов кожиметодами оитики спеклов. Пее экенеримеитальные исследования вьпюлиеиы: и1боавтором личио JHI6O ири содейетвии д.м.и. Е. И. Галанжа (исследоваиия динамикилимфотока в брыжейке белых крыс методами онтики сиеклов в условиях in vivo) а такжед.ф.-м.н., ироф. А. А. Карабутова и к.ф.-м.и. В. В. Саватеевой (ОА мо1ипорииг19коицеиграции глюкозрл в склере кроликов в условиях in vivo). Автором б|.1ли выиолиеиывсе вычислеиия и расчёты, а также статистичеекий анализ да1ин.1х.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключеиия и сниска литературы. Объем диссертации: 145 страниц, в том числе 31риеуиок и одиа таблица. Снисок литературы включает 196 иаимеиоваии!!.

3.7. Выводы.

В данной главе были изучены потенциальные возможности оптико-акустического метода высокого временного разрешения проводить бесконтактные измерения оптических свойств модельных сред и биотканей как функции концентрации глюкозы. В основе данного принципа измерения был положен эффект глюкозы как фактора, вызывающего уменьшение рассеяния света в биотканях. Здесь следует отметить, что в отличие от чисто оптических методов, выполняющих измерения рассеяния в тканях, ОД метод является более точным. В ходе одного оптического эксперимента возможно выполнить лишь два измерения: значений падающей и отражённой/прошедшей энергии (интенсивности) лазерных импульсов. OA метод высокого разрешения позволяет проводить измерения полного профиля лазерной энергии, поглощённой в каждом отдельном слое биоткани, с последующим восстановлением профиля распределения поглощённой энергии, увеличив, таким образом, величину OCIII. Таким образом, с помощью OA метода представляется возможным проводить до 1000 значений оптического ослабления (что определяется характеристиками цифровых осциллографов) послойно, но всей толщине ткани практически с любым требуемым пространственным разрешением.

Более того, в пьезоэлектрических детекторах возможно достичь значительно меньшего относительного уровня теплового шума по сравнению с величиной дробового шума в фотодетскторах. OA биосепсор глюкозы используется для проведения точных измерений оптико-акустических профилей поглощённой лазерной энергии в биосредах. Экспоненциальный наклон OA профиля, сгенерированного в среде в определённых условиях облучения, предполагающих временное ограничение давления, определяется значением эффективного коэффициента оптического ослабления в данной среде. Путём проведения OA измерений величины светорассеяния и её изменений как функции концентрации глюкозы возможно осуществление мониторинга глюкозы в реальных биологических тканях. В целях точного сопоставления изменений в наклоне OA профиля с абсолютными значениями уровня глюкозы в крови необходима калибровка OA метода, в результате которой определяется соотношение изменений величин тканевого светорассеяния и абсолютной концентрации глюкозы.

В первоначальных сериях экспериментальных исследований были исследованы возможности и продемонстрирован высокий потенциал OA метода проводить точные измерения оптических свойств модельных сред. Помимо этого, была изучена зависимость эффективного коэффициента оптического ослабления в среде как функция концентрации глюкозы. В модельных средах данный эффект выражался в 0.05-процептпом уменьшении величины д^на 1 мМ добавленной глюкозы, что находится в хорошем соответствии с количественными данными подобных экспериментов, проведённых другими научными группами.

Далее, экспериментальные исследования, проведённые в кроличьей склере in vitro, продемонстрировали высокие возможности OA сенсора выполнять падёжные измерения концентраций глюкозы в реальных биотканях. Согласно результатам экспериментов, 1 мМ увеличение концентрации глюкозы индуцирует 0.5-ироцентпое уменьшение эффективного коэффициента оптического ослабления в склере кроликов in vitro, что так же хорошо коррелирует с численными оценками, проведёнными другими исследователями для данной гкапи при тех же условиях.

Более того, OA измерения, выполненные в живой склере, подтвердили уникальные возможности и высокую чувствительность метода лазерной оптоакустики при проведении мониторинга глюкозы в биотканях в условиях in vivo, при которых величина эффекта глюкозы па уменьшение эффективного коэффициента оптического ослабления составила до 5% мМ." 1 Такой значительный эффект заслуживает более детального анализа и интерпретации.

Эксперименты по мониторингу глюкозы в склере живых кроликов продемонстрировали, что разброс значений эффективного коэффициента оптического ослабления в тканях in vivo может достигать ~20%, даже в пределах одного и того же органа любого, произвольным образом выбранного животного, вследствие естественных флуктуаций физических и оптических свойств. Для того, чтобы исключить/минимизировать данные вариации, необходимо обеспечить определённые условия эксперимента, в частности: полную иммобилизацию экспериментального животного па время эксперимента и запись OA сигналов, осуществляемую с максимально локализованной площади исследуемой биоткани.

В ходе экспериментальных исследований была продемонстрирована высокая специфичность OA метода при измерении оптических свойств как функций концентрации глюкозы в модельных средах и биотканях соединительного типа. Специфичность обусловлена тем фактом, что эффект глюкозы как воздействующей субстанции является более существенным, а её концентрация значительно выше, чем те же свойства и тканевые концентрации других осмотических веществ, которые, подобно глюкозе, способны в той или иной степени вызывать уменьшение светорассеяния/оптического ослабления в данной ткани. Таким образом, за исключением небольшого ряда физиологических условий и патологических состояний (болезней), при которых могут возрастать концентрации других эндогенных осмолитов, способных, в силу своих осмотических свойств, конкурировать с глюкозой, метод оптико-акустической томографии обладает высоким потенциалом, необходимым для проведения точного и специфичного мониторинга глюкозы в живых тканях.

В заключительной части исследований было проведено изучение оптических свойств цельной крови и их изменений под воздействием глюкозы с использованием OA метода. Данные экспериментов продемонстрировали, что на протяжении первых 5−10 мип после добавления в кровь глюкозы величина эффективного коэффициента оптического ослабления возрастает, вследствие адаптации эритроцитов к гипергликемическим условиям, при которых красные кровяные тельца постепенно трансформируются из двояковогнутых дисков в сфероиды/многогранники уменьшенных размеров, что было детально изучено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Показано, что па поверхности данных частиц наблюдается появление, а развитие аитепп/шипов, природа появления и развития которых пока пе изучена. В результате таких морфологических изменений происходит существенное изменение геометрии рассеяния в цельной крови, приводя к кратковременному увеличению светорассеяния. Полный же эффект глюкозы заключается в уменьшении коэффициента рассеяния/ослабления в цельной крови, численно выражающийся в -0.02% мМ," 1 который сравним по величине с подобным эффектом в коллагеповых тканях. Так же была изучена кинетика эффективного оптического ослабления в крови как функция концентрации добавленной в кровь глюкозы. Было показано, что эффекты па оптические свойства цельной крови (в частности, — па оптическое просветление), оказываемые глюкозой и маппитолом, сравнимы по величине. Однако, так как маннитол пе способен транспортироваться внутрь эритроцитов, пе происходит выравнивания концентраций маппитола по обе стороны степки эритроцита. Таким образом, осмотический эффект маппитола является более существенным по сравнению с таким же эффектом, вызываемым глюкозой. Здесь следует также отмстить, что при добавлении равных количеств глюкозы и маппитола в кровь морфология эритроцитов (и, как следовательно, геометрия рассеяния) также различается. Маннитол вызывает лишь сферуляцию красных кровяных телец, в то время как глюкоза стимулирует уменьшение диаметра и дегидратацию эритроцитов, что наглядно наблюдается па микроснимках, сделанных с помощью сканирующего электронного микроскопа.

В условиях in vivo не наблюдается таких значительных изменении в размерах и форме эритроцитов, поскольку при возрастании концентрации глюкозы в крови запускается и интенсифицируется механизм эффективной переработки данного сахара особым ферментом — инсулином, приводя к уменьшению уровня глюкозы в крови. Таким образом, эффект глюкозы па оптические свойства крови в живом организме сводится к уменьшению светорассеяния за счёт выравнивания показателей преломления плазмы крови и стенки эритроцита. Данные изменения могут быть надёжно измерены с помощью оптико-акустической техники высокого временного разрешения. В данной части исследований цельная кровь была выбрана в качестве модельной среды в перспективе вероятного использования OA детектирования глюкозы в тканях с интенсивным кровоснабжением (высоким удельным объёмом крови). Данное применение может сделать OA томографию неоценимым средством мониторинга глюкозы, особенно для пациентов, страдающих диабетом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящая диссертация посвящена изучению особенностей взаимодействия лазерного излучения е модельными средами и биологическими тканями соединительного типа, включая кровь, лимфу и склеру. В работе развит метод лазерной доплеровской спекл-флоумстрии в целях количественной оценки динамических характеристик потоков биологических жидкостей. Впервые была предпринята попытка адаптации данного метода к задачам диагностики лимфотока. Показано, что потоки лимфы в микроеосудах характеризуются пространственно-временной неоднородностью. При воздействии стафилококкового токсина динамика лимфотока изменяется. Были введены и измерены дипамическе параметры, характеризующие среднюю скорость бноиотока и пространственно-временное распределение скоростей, присутствующих в нём, но диаметру сосуда, а также их изменения при различных патологиях системы микроциркуляции лимфы. Результаты исследований положены в основу метода изучения нелинейной динамики в лимфатической и кровеносной системах живых организмов методом оптики епеклов, использование которого позволяет достигать значения пространственного разрешения порядка размеров лазерного пучка (-5−10 мкм) и временного разрешения порядка I0″ 2 сек.

В диссертации разработана оптическая модель ожогов кожи с цслыо исследования их оптических свойств и точного измерения толщины ожогового слоя. Проведено исследование зависимости статистических свойств доплеровских сигналов от свойств ожоговой ткани и от скорости подкожного кровотока. Показано теоретически и экспериментально, что время корреляции автокорреляционных функций флуктуаций интенсивности рассеянного света монотонно уменьшается с возрастанием числа рассеивающих событий в среде. Изучена зависимость величины доплеровского уширепия сигнала от рассеивающих свойств неоднородных двухслойных фантомных срсд — моделей ожогов. В частности, ноказапо, что неподвижные рассеиватели, моделирующие ожоговый слой, способны существенно влиять па спектральную ширину донлеровского сигнала.

Были изучены потенциальные возможности и продемонстрированы преимущества оптико-акустического метода высокого временного разрешения в проведении бесконтактных измерений оптических свойств модельных сред и биотканей как функции концентрации глюкозы. Изучена зависимость эффективного коэффициента оптического ослабления в среде как функция концентрации глюкозы в модельных средах, в склсралыюй ткапи в условиях in vitro и in vivo, а также в цельной крови.

Изучены особенности взаимодействия глюкозы с модельными средами и биотканями соединительного типа (склера и кровь), включая физические, биохимические, биологические и физиологические аспекты. Проанализированы особенности взаимодействий «глюкоза-биоткань» в условиях in vitro и in vivo. Комплексный эффект глюкозы на оптические свойства крови интерпретирован с позиций конкуренции двух одновременно протекающих процессов, приводящих к противоположным последствиям, а именно: увеличению рассеяния вследствие изменения морфологии и размеров эритроцитов в условиях гиперосмотичсского воздействия и одновременному уменьшению рассеяния света за счёт выравнивания показателей преломления стенки эритроцита и плазмы крови.

В заключительной части исследований показано, что эффекты глюкозы и маппптола на оптические свойства крови близки по характеру и величине. Однако сравнение эффектов, вызываемых данными моносахаридами па морфологию эритроцитов цельной крови показало, что привнесение маппитола в кровь вызывает сферуляцию эритроцитов по, в отличие от эффекта глюкозы, не приводит к их дегидратации.

Таким образом, основные принципы OA метода, адаптированного для генерации и детектирования акустических сигналов в биосрсдах в условиях in vivo, могут быть положены в основу при создании сенсора принципиально нового типа, способного осуществлять быстрый и падёжный бесконтактный мониторинг глюкозы у диабетических пациентов.