Процесс взаимодействия полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ последние десятилетия изучают на примере очень широкого круга синтетических реагентов. Показано, что формирование в результате таких реакций полимер-коллоидных комплексов имеет много общего с процессами самоорганизации в биологических системах [1,2]. Поэтому сравнительно недавно для исследования комплексообразования стали применять природные биополимеры — ДНК и РНК и природные поверхностно активные вещества — липиды [3,4]. В основном такие работы посвящены изучению реакций, протекающих в водной фазе [5], и лишь в последние годы появились работы [6,7], в которых предприняты попытки к переводу продуктов таких реакций в неводные среды.
В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование комплексов природного жесткоцепного биополимера ДНК с синтетическими катионными поверхностно-активными веществами в малополярных органических растворителях, изучены их физико-химические свойства и морфология. Эти исследования имеют двойное значение. Во-первых, перевод подобных комплексов в неводные среды позволяет применять к их изучению широкий спектр физико-химических методов исследования растворов полимеров, в то время как в водной среде большинство таких методов неприменимы вследствие нерастворимости комплексов в воде. Во-вторых, растворение комплексов ДНК-поверхностно-активное вещество в органических растворителях в какой-то мере моделирует одну из стадий жизненно важного биологического процесса — прохождение макромолекулами ДНК клеточной мембраны при трансформации, что позволяет наиболее близко подойти к изучению механизма трансформации на модельных системах. И в-третьих, исследования свойств и морфологии комплексов ДНК в средах с различной полярностью, как оказалось, имеют фундаментальное значение при изучении механизма компактизации ДНК.
ГЛАВА I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. Комплексы гибкоцепных линейных полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ в органических растворителях.
Известно, что синтетические полиэлектролиты и молекулы мицеллообразующих противоположно заряженных поверхностно-активных веществ (ПАВ) образуют полимер-коллоидные комплексы (ПКК) в разбавленном водном растворе [8−13]. Такие комплексы возникают в результате электростатического взаимодействия звеньев полиэлектролита с ионогенными группами амфифильных ПАВ и стабилизированы гидрофобными взаимодействиями углеводородных фрагментов молекул ПАВ. В зависимости от соотношения [ПАВ]/[полиэлектролит] и значения рН раствора возможно образование как водорастворимых, так и нерастворимых в воде ПКК. Комплексы, включающие звенья полиэлектролитов и ионы ПАВ в эквимольном соотношении, т. е. стехиометричные комплексы, СПКК, не растворяются в воде. Отсутствие растворимости амфифильных СПКК в воде представляется естественным, поскольку ионогенные группы полиэлектролита и ПАВ, образующие друг с другом солевые связи, экранированы от молекул воды неполярными гидрофобными остовами полиионов и алифатическими фрагментами молекул ПАВ. Растворимость и свойства таких комплексов в органических растворителях начали изучать сравнительно недавно, но существует целый ряд работ [14−19], которые посвящены исследованию поведения СПКК в органических растворителях.
В работе [14] представлено систематическое исследование растворимости СПКК линейных синтетических полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ в органических растворителях с низкой диэлектрической проницаемостью. В табл. 1 приведены данные по растворимости СПКК при комнатной температуре и температуре, близкой к температуре кипения растворителя. Остановимся более подробно на влиянии природы растворителя на растворение различных СПКК.
Табл. 1 Растворимость СПКК в растворителях с низкой диэлектрической проницаемостью.
8 Растворитель, А В С Б Е Б в группы.
I 4.81 Хлороформ ++ ++ ++ ++ ' ++ ++ ++.
8.93 Метиленхлорид ++ ++ ++ ++ ++ -+ ;
10.6 1,2-дихлорэтан ++ ++ -+ -+ — —.
II 2.40 Бензол ++ ++ -+ -+ -+ -+ -+.
2.38 Толуол ++ ++ -+ -+ -+ -+ -+.
2.20 м-Ксилол ++ -+ -+ -+ ' -+ — ;
III 7.58 2.21 Тетрагидрофуран 1,4-Диоксан.
IV 2.24 4.34 1.88 2.02 Четыреххлористый углерод Диэтиловый эфир Гексан Циклогексан.
Плюс означает растворение СПККминус — отсутствие растворимостизвездочкой обозначен сложный характер поведения СПКК (А) в тетрагидрофуранепервый знак соответствует растворению при комнатной температуре, второй — при температуре, близкой к температуре кипения растворителяобозначение СПКК соответствует: А — сополимер 1Ч-этил-4винилпиридиний бромида и К-цетил-4-винилпиридиний бромида (93:7 мол. %), В — N — этил — 4 — винил пир идиний бромид, С — полистирол сульфонат натрия, D — поливинил сульфат калия, Е — полиакриловая кислота, Fполиметакриловая кислота, G — полиметакриловая кислота, в случае ПАВ А, В — додецилсульфат натрия, С, D, Е, F — цетилтриметиламмоний бромид, G — тетрадецилтриметиламмоний бромид.
Все растворители, приведенные в табл.1, авторы условно относят к четырем различным группам. В среднем, растворимость СПКК в растворителях первой группы выше и уменьшается при переходе к растворителям второй группы. В растворителях третьей и четвертой групп растворения СПКК практически не наблюдается. Такое различие в поведении растворителей, находящихся в разных группах, авторы [14] объясняют с помощью теории параметра растворимости (а) для регулярных растворов полимеров, описанной в работе [20]. Величины (а), приведенные в этой работе (с учетом вклада дисперсионных, полярных взаимодействий и водородной связи), составляют ai=9.4±0.6 для растворителей I-III группы и С2=7.8±-0.6 для растворителей IV группы. Если предположить, что параметр растворимости СПКК различного типа близок к ст=9.4±-0.6, т.к. многие из приведенных в таблице 2 СПКК растворимы в растворителях I и II групп, то можно заключить, что растворители IV группы хуже в термодинамическом смысле для СПКК, чем растворители I-III групп. Однако наблюдаемое небольшое различие в oi и 02 не позволяет однозначно предсказать отсутствие растворимости СПКК в растворителях IV группы. Более того, теория параметра растворимости не позволяет объяснить отсутствие растворимости СПКК в растворителях III группы. Поэтому авторы приводят некоторые дополнительные соображения о причинах различной растворимости СПКК в органических растворителях. Например, особенностью растворителей I группы является их склонность к образованию водородной связи, т.к. они являются донорами протона [21]. При этом донорные свойства уменьшаются в ряду хлороформ > метиленхлорид > 1,2-дихлорэтан. Учитывая акцепторные свойства изученных СПКК, можно предположить, что образование водородных связей способствует растворению СПКК в растворителях I группы. Можно также предположить, что склонность к растворению СПКК в растворителях II группы обусловлена образованием я-комплексов [22]. В растворителях III группы атом кислорода проявляет акцепторные свойства, поэтому трудно ожидать образования водородных связей с СПКК. Наконец, отсутствие склонности к специфическим взаимодействиям растворителей IV группы может служить дополнительным аргументом в пользу отсутствия растворимости СПКК в этих растворителях. В работе [14] упоминается необходимость учитывать также влияние химического строения компонентов СПКК на их растворимость в органических растворителях, однако подробный анализ в работе отсутствует.
Однако, как показано в работе [15], в органических растворителях могут быть растворены не только СПКК, но и НПККнестехиометричные полимер-коллоидные комплексы — на основе синтетических гибкоцепных полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ. СПКК на основе по л и (14-этил — 4 — винилпиридин ий бромида) (ПЭВП) и додецилсульфата натрия получали способом, описанным в работе [14]. НПКК синтезировали, используя реакцию обмена между растворенным в хлороформе СПКК и растворенным в метаноле ПЭВП, т.к. в смешанном растворителе (хлороформ-метанол) не растворяются ни ПЭВП, ни додецилсульфат натрия. Полученные таким способом СПКК, содержащие 5, 10 и 16 мол. % избыточных групп ПЭВП, после высушивания оказываются растворимыми в хлороформе. Как следует из седиментограмм Шлирена для растворов СПКК и НПКК в хлороформе, оба комплекса присутствуют в хлороформе в виде индивидуальных соединений и плотность комплексов меньше плотности растворителя. На Рис. 1 представлены зависимости приведенной вязкости от концентрации СПКК и НПКК в хлороформе. Видно, что во всех случаях зависимости имеют характер, близкий к линейному. Наибольшее значение характеристической вязкости [г|] соответствует СПКК, а соответствующие значения [г|] для НПКК ниже и уменьшаются с уменьшением отношения [ПАВ]/[полиэлектролит]. Авторы работы [15] связывают этот факт с более компактной конформацией НПКК в хлороформе по сравнению с СПКК. Степень свернутости цепей НПКК увеличивается с уменьшением состава (отношения занятых групп полиэлектролита к общему числу ионогенных групп) НПКК. По мнению авторов, вискозиметрические и седиментационные данные свидетельствуют о наличии совпадения свойств растворов НПКК и иономеров в хлороформе. В обоих случаях агрегация солевых групп может возникать в неполярном растворителе, причем в разбавленных растворах агрегация сопровождается сворачиванием полимерных цепей.
Более подробное, систематическое исследование свойств и конформационных состояний СПКК и НПКК в хлороформе предпринято в работах [16, 17 ]. В работе [16] исследованы гидродинамические и динамооптические свойства растворов комплексов на основе ПЭВП и додецилсульфата натрия в хлороформе. В Табл. 2 приведены основные гидродинамические и конформационные характеристики молекул СПКК, НПКК и П4ВП (поли-4-винилпиридиния) в хлороформе.
Рис. 1 Концентрационные зависимости приведенной вязкостипф/С растворов ПКК в хлороформе. 1 — СПКК (2=3000), 2 — НПКК1 (2=3000, у=0.95) — 3 — НПКК2 (2=3000, ?=0.85) — 4 — НПККЗ (2=3000, |/=0.70) — 5 — СПКК (2=500) — 6 — НПК4 (2=3000, |/=0.55), Температура Т=20°С, [15].
Табл. 2 Гидродинамические и конформационные характеристики молекул ПКК в хлороформе. Т=20°С.
Обра [л] О-Ю7 Мэтг А.
— зец г-ю-3 дл/г к' см2/с 10″ 6 м’ю* нм.
СПКК 1.0 3 0.57 0.25 1.88 1.4±0.3 1.2 6.3.
1.0 1 0.35 — 0.40.
1.0 0.5 0.22 0.32 0.20.
НПКК1 0.95 3 0.46 0.31 2.06 1.4±0.3 1.2 5.4.
НПКК2 0.85 3 0.35 0.49 2.21 1.4±0.3 1.1 4.3.
НПККЗ 0.70. 3. 0.28 0.52 1.0 3.6.
НПКК4 0.55 3 0.21 0.61 2.78 1.2±0.2 ' 0.93 2.8.
П4ВП — 3 0.60 1.0 — - 3.18 2.7.
Для сравления приведены данные, полученные для поли-4-винилпиридина (П4ВП).
Коэффициенты диффузии, О, в разбавленном растворе ПКК в хлороформе измерены методом изотермической диффузии.
Как видно из таблицы 2, величины константы Хаггинса К4 соответствуют значениям, типичным для растворов гибкоцепных полимеров и как характеристики, зависящие от термодинамического качества растворителя, показывают, что хлороформ является хорошим растворителем для СПКК и НПКК-1. Значение [т|] для ПКК по порядку величины совпадает с характеристической вязкостью гибкоцепных полимеров с соответствующей степенью полимеризации и нелинейно зависит от ионного состава. М]>13 вычисленная с использованием экспериментальных значений Б, [г|] и гидродинамического инварианта Ао=(3.2±-0.2) х Ю~10 эрг/Кхмоль1/3 [23] в формуле.
МВп = (АоТ/г|оВ)3×100/[т1], (1) в пределах погрешности эксперимента совпадает с ММ (Мч), рассчитанной из степени полимеризации Ъ и состава ПКК по формуле.
2): м' = г[фМ01 + (1-Ф)М02], (2) где М01 и М02 — ММ звеньев сополимера I с противоионами додецилсульфата и Вг соответственно. Соответствие рассчитанных и измеренных значений ММ свидетельствует об отсутствии ассоциации молекул ПКК в хлороформе в широком интервале изменения состава ПКК. По мнению авторов, этот факт позволяет интерпретировать зависимость гидродинамических характеристик от состава ПКК в терминах изменения конформаций макромолекул.
Линейная зависимость приведенной вязкости от концентрации, сохранение симметрии диффузионной границы со временем (рис. 2), а также совпадение величин Мрл и М' свидетельствует об отсутствии полиэлектролитных явлений в растворах исследованных ПКК. Эти факты указывают на то, что противоионы додецилсульфата и Вг в среде хлороформа оказываются практически полностью локализованными вблизи от заряженных звеньев полииона. Авторы статьи [16] предполагают, что молекулы ПКК в хлороформе имеют конформацию статистического клубка.
Макромолекулы ПКК в растворе хлороформа являются незаряженными системами, в которых все противоионы Вг и додецилсульфата связаны с цепью полииона. Влияние состава противоионов, имеющих различные размеры, на степень свернутости молекулярных цепей ПКК подобно влиянию размеров боковых групп на равновесную жесткость обычных гибкоцепных сополимеров со.
Рис. 2 Зависимость дисперсии <ст2> диффузионной границы от времени I для образцов в хлороформе, Т=20°С. 1 — СПКК (2=3000), с=0.215 г/дл- 2 — НПКК2, с=0.217 г/дл- 3 — НПКК4, с=0.245 г/дл, [16]. статистическим распределением компонент. Изменение оптической свидетельствует о малом различии анизотропии звеньев, содержащих разные противоионы.
По данным анализа [17] сделан вывод о свойствах ПКК на основе гибкоцепных полиионов и противоположно заряженных ПАВ в малополярных органических растворителях. НПКК можно представить как новый тип иономеров, в которых избыточный заряд полииона скомпенсирован низкомолекулярными противоионами, играющими роль «солевых групп» иономера, способных агрегировать в малополярных органических растворителях. Растворимость таких НПКК в органической среде обеспечивается за счет структурных гидрофобных участков НПКК, состоящих из участков цепи полииона и противоионов — поверхностно активного вещества.
Исследовано равновесное электрическое двойное лучепреломление и кинетика эффекта Керра в растворах полиэлектролитных комплексов различного состава в хлороформе, образованных катионами поли-1Ч-этил-4-винилпиридиния и анионами додецил сульфата и Вг [18]. Установлено, что ориентирующее действие электрического поля на макромолекулы поликомплексов вызвано индуцированным дипольным моментом, время релаксации которого сравнимо с временем релаксации молекулярной ориентации. Обнаружено, что величина постоянной Керра поликомплекса согласуется с величиной оптического коэффициента сдвига и ее изменение с составом и степенью полимеризации поликомплекса вызвано изменением оптической анизотропии и деформационной поляризуемости макромолекул.
Следует отметить, что ПКК на основе гибкоцепных полиэлектролитов и противоположно заряженных ПАВ способны поглощать значительные количества воды [19]. Увеличение содержания воды в растворах СПКК (?=3000) и НПКК (г=3000, ?=0.70) приводит к выпадению осадка. Осаждение СГТКК происходит при содержании воды, анизотропии молекул ПКК отражает изменение их размеров и равном 6 молекулам воды на одну ионную пару ]Ч+" 080зС12Н25. Осаждение НПКК происходит, когда на одну ионную пару ]Ч+~Вг приходится 34 молекулы воды и на одну ионную пару 1Ч+~080зС12Н25 — 6 молекул воды Методом ИК-спеьсгрометрии показано, что, в основном, можно выделить два состояния воды: одно соответствует воде, растворенной в хлороформе, другое — отвечает воде, слабо связанной с ионогенными группами ПКК. Обнаружено, что солюбилизирующая способность комплексов по отношению к воде тем выше, чем выше доля малых противоионов (Вг~) в их частицах.
Заметим также, что в работе [19] изучены свойства ПКК в блоке. Не останавливаясь подробно, следует отметить, что такие ПКК имеют в твердом состоянии упорядоченную надмолекулярную структуру, заметно отличающуюся в зависимости от предыстории получения образцов.
Исследованы также свойства комплексов на основе гибкоцепного полиэлектролита — ПЭВП — и противоположно заряженного ПАВ — ди (2-этилгексил)сульфосукцината натрия (АОТ) в неполярных органических растворителях (октан и гексан) [24]. Обнаружена зависимость структуры комплекса ПЭВП-АОТ от количества вводимой в систему воды. При высоких степенях гидратации ПЭВП оказывается включенным в водную область обращенной мицеллы АОТ, причем цепи поликатиона в этом случае находятся в значительно сконденсированной форме. Результаты, полученные с применением методов светорассеяния и ультраседиментации, позволяют утверждать, что включение поликатиона в обращенную мицеллу практически не влияет на ее размер. При степенях гидратации ниже критической поликатион взаимодействует с ПАВ с образованием стехиометричного полимер-коллоидного комплекса, растворимого в алифатических углеводородах. Размеры таких комплексов оказываются значительно большими, чем размеры исходных обращенных мицелл чистого АОТ в отсутствии поликатиона. Такие комплексы представляют собой гребнеобразные структуры, в которых заряженные группы АОТ электростатически связаны с заряженными группами ПЭВП, в то время как углеводородные радикалы ПАВ, «пришитые» к поликатиону, ориентированы в объем растворителя.
1.2. Взаимодействие иономеров с полярными и амфифильными соединениями в органических растворителях.
К настоящему момменту опубликоавны лишь отдельные работы, посвященные поведению иономеров в малополярных растворителях в присутствии других амфифильных соединений, например таких как, макромолекулы других иономеров [25], небольшие количества полярных сорастворителей [26−28], или молекулы сорастворимых ПАВ [29−33]. Ландберг и Маковский [26] исследовали вязкость растворов иономеров на основе сульфированного полистирола и сульфированного этилен-пропилен-диен-терполимера (СЭПД) в ксилоле в присутствии небольших добавок спиртов. Хотя используемые в работе иономеры были малорастворимы в ксилоле, они легко растворялись в нем при добавлении спирта. Значение приведенной вязкости 2% раствора ПСИа (натриевой соли полистирола) (т=2.6%) в смешанном растворителе, содержащем 80% ксилола и 20% гексанола, было почти такое же, как и для раствора полистирола той же молекулярной массы (рис. 3) [26]. Авторы сделали заключение, что молекулы спирта разрушают межцепные ассоциаты ионогенных групп иономера за счет взаимодействия по схеме: спирт + (полимер-803Ка)п оп (спирт-полимер- 803Ка) (3).
При больших концентрациях спирта ассоциация ионогенных групп иономера практически полностью подавлена. При снижении концентрации гексанола ниже 10% наблюдается увеличение приведенной вязкости раствора иономера вплоть до значения, почти в 3 раза превышающего приведенную вязкость раствора полистирола (рис. 3). Способность молекул спирта сольватировать ионогенные группы иономера зависит от длины алифатического радикала и уменьшается в ряду: р о.
ПС при 25° С и 80° С.
20 О.
10 гексанол, об. %.
Рис. 3 Зависимость приведенной вязкости (г|пр) растворов ПС и СПШ (2.6) от состава смешанного растворителя ксилол-гексанол (гексанол, об.%), [ПС]=[ОЖа]=2 г/ддиз работы [26]. метанол > изопропанол > гексанол > деканол.
Ландбергом было исследовано влияние температуры на вязкость систем иономер (СЭПД) — ксилолспирт [27]. Он обнаружил, что при концентрациях иономера, больших 1.5% с увеличением температуры вязкость растворов цинковых солей иономеров проходит через минимум (рис. 4). Такое поведение было объяснено следующим образом. При низких температурах ионогенные группы иономера сольватированы спиртом. С увеличением температуры вязкость сначала уменьшается вследствие увеличения подвижности иономерных цепей и молекул растворителя. Однако по мере повышения температуры равновесие в реакции (3) сдвигается влево, т. е. начинает преобладать тенденция к ассоциации ионогенных групп иономера друг с другом, что приводит к увеличению вязкости раствора. При повышении содержания спирта в смеси равновесие (3) сдвигается вправо за счет избытка молекул спирта и вязкость раствора иономера монотонно уменьшается при повышении температуры (рис. 4).
Ландберг [28] исследовал влияние химической природы полярных сорастворителей на вязкость полуразбавленных растворов иономеров. Было установлено, что спирты и амины являются наиболее эффективными сорастворителями по отношению к ионогенным группам иономера. Амиды также оказались эффективными, но лишь при повышенных температурах, так как при комнатной температуре они выкристаллизовываются из раствора. Карбоновые кислоты и особенно сложные эфиры, в частности диалкилфталаты, оказались наименее пригодными в качестве сорастворителей. В гомологических рядах аминов и спиртов соединения с меньшей длиной углеводородного фрагмента более эффективно сольватируют ионогенные группы иономеров. Геометрия молекул сорастворителя также влияет на их сольватирующие свойства. Так, например, при равных концентрациях, сорастворители, молекулы.
ТЕМПЕРАТУРА, °С.
Рис. 4 Зависимость вязкости раствора СЭЩ1? п от температуры в смешанном растворителе масло-гексанол, где масло — смесь парафинов, при содержании гексанола 0.75 об. %, (¦), 1.5 об. %, (А), 3.0 об. %, (•) и 6.0 об. %, (¦) — [СЭПД2п]=1.5 г/длиз работы [27]. которых создают меньшие стерические затруднения, т. е. первичные спирты и амины, наиболее сильно понижают вязкость полуразбавленных растворов иономеров. Показано, что в случае мономеров с ионогенными группами типа 80з (7п)½ их сольватация происходит за счет образования донорно-акцепторного комплекса между Ъх1+ противоионом (акцептор) иN2 группой амина (донор). В отличие от сульфированных иономеров, иономеры, содержащие карбоксильные ионогенные группы спротивоионом, практически не взаимодействуют с аминами и не растворяются в их присутствии.
В работе [29] методом вискозиметрии изучено взаимодействие между иономерами ПСИа и молекулами низкомолекулярного ПАВдиметилэтилалкилбензиламмоний хлорида в растворителях различной полярности. Показано, что в относительно полярных растворителях, таких как диметилсульфоксид и диметилформамид, молекулы СП№ ведут себя как классические полиэлектролиты, т. е. их приведенная вязкость возрастает при разбавлении. Однако введение небольших количеств ПАВ подавляет полиэлектролитный эффект. Это явление расценивается как образование комплексов иономер-ПАВ в результате заряд-зарядовых и гидрофобных взаимодействий между молекулами ПАВ и иономера. При этом молекулы полистирола, не содержащего ионогенных групп, тем не менее адсорбируют молекулы ПАВ за счет гидрофобных взаимодействий, что приводит к образованию положительного заряда на цепях полистирола и к их разворачиванию вследствие отталкивания одноименных зарядов. В относительно маополярном растворителе — циклогексане, где ионогенные группы полимера не диссоциированы и образуют внутримолекулярные агрегаты в разбавленных растворах, добавление молекул ПАВ приводит к увеличению приведенной вязкости иономера с последующим выходом зависимости приведенной вязкости от концентрации ПАВ на «плато». Подобное поведение Пейффер и Ландберг объясняют тем, что молекулы катионного ПАВ выступают в качестве сорастворителей для ионогенных групп мономера. Отсутствие изменений приведенной вязкости полистирола в присутствии молекул диметилэтилалкилбензиламмоний хлорида указывает, по мнению авторов, на отсутствие гидрофобных взаимодействий молекул ПАВ и цепей полистирола в циклогексаноне [29].
Авторами [30−32] исследовано комплексообразование между иономерами на основе сульфированого полистирола и молекулами одноименно заряженного ПАВ — бис-(2-этилгексил)сульфосукцината натрия (аэрозоля ОТ или АОТ) в малополярных растворителях: м-ксилоле и тетрагидрофуране. Методами вискозиметрии, скоростной седиментации, динамического светорассеяния, паровой осмометрии и флуоресцентной спектроскопии показано, что введение молекул АОТ, как и обращенных мицелл {АОТ-вода} в раствор иономера приводит к разрушению внутрицепных ассоциатов ионогенных групп иономера, замене их на ассоциаты ионогенных групп иономера и АОТ и образованию комплексов {иономер-АОТ} или {иономер-миц.{АОТ-Н20}} состава 12+24 молекулы ПАВ или 0.21+0.66 миц.{А0Т-Н20} на ионогенную группу иономера [30]. Результатом взаимодействия является «разворачивание» иономерных клубков в разбавленных растворах, увеличение их размеров и приближение их по конформации к конформации немодифицированного полистирола. По мнению авторов, причиной такого комплексообразования является понижение электростатической составляющей свободной энергии системы за счет включения ионогенных групп иономера в полярную область агрегатов АОТ и тем более в водное ядро мицелл АОТ, а также выигрыш в энтропии системы за счет возрастания энтропии иономерного клубка в результате его разворачивания. Было установлено, что константа связывания макромолекул сульфированного полистирола с мицеллами {АОТ-Н2О} значительно больше константы связывания иономера со слабоагрегированными молекулами ПАВ, однако в первом случае для иономерного клубка характерна более компактная конформация, т. е. неполное расшивание. На основе полученных экспериментальных данных авторами работы [30] была предложена структура таких комплексов, изображенная схематически на рис. 5.
Следует отметить, что в случае взаимодействия иономера со слабо агрегированными молекулами АОТ степень агрегации молекул ПАВ в составе кластеров с ионогенными группами повышается по сравнению со степенью агрегации АОТ в отсутствии иономера, т. е. ионогенные группы иономера индуцируют дополнительную агрегацию молекул ПАВ на цепи. Особенно ярко этот эффект проявляется в тетрагидрофуране [31], где АОТ в отсутствии иономера находится практически в молекулярно-дисперсном состоянии, в то время как с каждой ионогенной группой полимера связывается от 9 до 14 молекул ПАВ, т. е. степень агрегации молекул ПАВ в присутствии иономера существенно возрастает. Причины такого поведения молекул ПАВ авторами работы не объясняются.
Показано также, что количество молекул АОТ или мицелл {АОТ-Н2О}, связанных с одной ионогенной группой сульфированного полистирола уменьшается в ряду: 80з№ > 80з (2п)½ > 80зН, что, по мнению авторов, связано с уменьшением полярности ионогенных групп в том же ряду [30].
Иономер — АОТ.
Иономер — мицеллы АОТ.
Рис. 5 Схема строения комплексов иономеров на основе сульфированного полистирола с молекулами АОТ или обращенными мицеллами {АОТ-Н2О} в ксилоле, предложенная в работе [30].
Таким образом, из приведенных выше данных следует, что полимер-коллоидные комплексы на основе синтетических линейных полиэлектролитов и противоположно-заряженных ПАВ, а также комплексы между иономерами и противоположно-заряженными ПАВ способны растворяться в малополярных органических растворителях, причем такие комплексы характеризуются развернутой клубкообразной конформацией. Известно, что ДНК также является полиэлектролитом, однако характеризуется значительно более высокой жесткостью, а также обладает рядом свойств, присущих исключительно двойной спирали макромолекулы ДНК. В следующих главах будут рассмотрены некоторые свойства ДНК, обусловленные ее особенностями как природного полиэлектролита.
2. Особенности ДНК как природного полиэлектролита.
2.1. Свойства ДНК в растворах.
Дезоксирибонуклеиновая кислота — ДНК — является одной из самых крупных молекул, образуемых живыми организмами. ДНК содержит генетическую информациюв частности, информацию о последовательности аминокислот полипептидов.
ДНК состоит из мономеров, называемых нуклеотидами. Каждый нуклеотид состоит из фосфатной группы, пятиуглеродного сахара (пентозы) и азотсодержащего основания, в молекуле которого имеется одно (тимин и цитозин) или два (аденин и гуанин) кольца. Нуклеотиды присоединяются друг к другу таким образом, что фосфатная группа каждого следующего нуклеотида образует ковалентную связь с сахаром предыдущего нуклеотида. В результате образуется длинная цепь из чередующихся остатков сахара и фосфатных групп, называемая сахаро-фосфатным остовом молекулы. Основания располагаются по одну сторону этого сахаро-фосфатного остова, под прямым углом к нему.
В любой молекуле ДНК число нуклеотидов, содержащих аденин (А), равно числу нуклеотидов, в состав которых входит тимин (Т): А=Таналогично, соотношение гуаниновых (Г) равно соотношению цитозиновых (Ц) нуклеотидов: Г=Ц.
Молекула ДНК закручена в спираль. Сахаро-фосфатный остов образует ее наружную сторону, азотистые основания — внутреннюю. Модель, предложенная Уотсоном и Криком [34−36], предполагает, что молекула ДНК состоит из двух цепей или нитей. Таким образом, молекулу ДНК можно сравнить с веревочной лестницей, в которой веревками является сахаро-фосфатный остов, а перекладинами — азотистые основания (рис. 6).
I Пара оснований.
Сахарофосфатный остов.
Рис. 6 Участок двойной спирали молекулы ДНК.
Заметим, что в модель Уотсона и Крика хорошо вписывается существование в природе только А-Т и Г-Ц связей. На рис. 6 видно, что подобные связи обеспечивают одинаковую ширину «лестницы» на всем ее протяжении, а также максимально стабильные связи между нитями ДНК [37, 38].
Поскольку в основном ДНК в организме находится в растворе, остановимся подробнее на свойствах ДНК в растворах. Для исследования ДНК в растворе применяют широкий круг методов, таких как. циркулярный дихроизм, линейный дихроизм, дисперсию оптического вращения, ядерный магнитный резонанс, рассеяние у-лучей под малым углом и многие другие. Первые сообщения о поведении ДНК в растворе появились в семидесятых годах [39, 40]. До этого исследовались преимущественно волокна ДНК, обеспечивавшие регулярную ориентацию молекул. Расшифровку данных о поведении молекулы ДНК в растворе затрудняли случайная ориентация молекул и эффекты термической флуктуации. Не останавливаясь подробно на истории открытий, перечислим основые свойства ДНК в растворе.
В среднем на виток спирали в растворе приходится 10.5 азотистых оснований [41,42]. Молекула ДНК устойчива в водном растворе: ни разбавление, ни добавление низкомолекулярного электролита, ни изменение рН в диапазоне 3−9 не приводит к денатурации ДНК [43,44]. Конформация молекулы в присутствии конденсирующих агентов меняется при незначительном изменении концентрации ДНК. Как показано в работе [45], в сверхразбавленных растворах (содержание ДНК не превышает 1 мкг/мл) в присутствии полиаминов длинные молекулы ДНК подвергаются мономолекулярному «схлопыванию» — в очень разбавленных растворах (примерно 10 мкг/мл) образуются микроагрегаты, содержащие длинные и короткие молекулы ДНКв разбавленных растворах (примерно 1 мг/мл) формируются крупные агрегаты, которые легко седиментируют.
Показано, что в умеренно концентрированном растворе присутствуют набухшие «пучки» нитей ДНКв концентрированном растворе существуют молекулярные агрегаты, организация которых напоминает организацию регулярного кристалла [46].
Разбавленные растворы ДНК характеризуются высокой подвижностью молекул. С увеличением концентрации нуклеиновой кислоты происходит фазовый переход, характеризующийся высокой кооперативностью агрегации молекул. Дальнейшее увеличение концентрации ДНК резко уменьшает подвижность молекул, наносекундные перемещения оказываются «заморожены». Концентрация ДНК, при которой происходит переход, уменьшается с увеличением молекулярной массы [46].
Одним из важных свойств ДНК в растворах является ее денатурация или плавление — разрыв межмолекулярных связей, удерживающих две комплементарные цепи ДНК друг около друга. Возможно' как локальное, так и полное расхождение тяжей молекулы ДНК.
Плавление ДНК осуществляется в широком интервале температур. В отличие от фазовых систем, у ДНК температура растет непрерывно, и с ее повышением все новые участки молекулы переходят из спирального состояния в расплавленное. Переход «растянут», денатурация осуществляется поэтапно, поскольку участки ДНК, обогащенные парами А-Т, плавятся при более низкой температуре, чем участки, обогащенные парами Г-Ц [47]. Тот факт, что при повышении температуры в первую очередь денатурируют, молекулы, обогащенные аденин-тиминовыми парами нуклеотидов, а молекулы с более высоким содержанием гуанин-цитозиновых пар остаются еще нерасплетенными (нативными), объясняется различными энергиями связи А-Т и Г-Ц [48].
Одним из методов изучения явления денатурации ДНК является наблюдение за измененим оптической плотности раствора при Х=260 нм с увеличением температуры. Известно, что гиперхромный эффект, составляющий 20−40% увеличения оптической плотности, соответствует почти полной денатурации ДНК [47]. В заключение отметим, что плавление ДНК — это процесс, который постоянно происходит в клетке: и при удвоении ДНК и при считывании с нее информации комплементарные цепи должны быть разведены, чтобы на каждой из них (в случае репликации) или на одной из них (в случае транскрипции) начался синтез цепей ДНК или РНК.
2.2 Взаимодействие ДНК с поверхностно-активными веществами в водных растворах.
Поскольку представленная работа посвящена исследованию свойств и структуры комплексов ДНК-ПАВ в малополярных органических средах, то представляется важным подробно рассмотреть имеющиеся в литературе данные по процессу взаимодействия ДНК с ПАВ в водных средах, а также по структуре и свойствам образующихся в результате этой реакции комплексов. Наиболее подробно процесс комплексообразования изучен для линейной ДНК и противоположно заряженных ПАВ [43]. Методом потенциометрического титрования с использованием ПАВ-селективного электрода изучен процесс взаимодействия линейной ДНК с додецилтриметиламмоний бромидом (ДДТМАБ) и тетрадецилтриметиламмоний бромидом (ТДТМАБ), влияние низкомолекулярного электролита на протекание реакции— определены константы связывания и параметры кооперативности. Показано, что ДДТМАБ и ТДТМАБ начинают взаимодействовать с ДНК при очень низкой равновесной концентрации, значительно ниже их критической концентрации мицеллообразования (ККМ) даже в присутствии низкомолекулярного электролита. Ранее было показано [49], что додецилсульфат анионы не взаимодействуют с ДНК, следовательно в процессе связывания ДНК с ПАВ значительную роль играют электростатические силы. Отмечено также, что связывание ДНК с ТДТМАБ происходит гораздо легче, что объясняется более длинным алифатическим фрагментом указанного ПАВ. Для последнего большими оказываются параметры кооперативности и и К. Полученные результаты свидетельствуют также о значимости гидрофобных взаимодействий в процессе взаимодействия ДНК и катионов ПАВ. Хорошо известно, что кооперативный характер взаимодействия полимеров с противоположно заряженными ПАВ связан с гидрофобными взаимодействиями углеводородных радикалов ПАВ [50−52]. Очевидно, что это положение справедливо и для природного полиэлектролита — ДНК. Следует отметить, что определенную роль во взаимодействии между ДНК и ПАВ играет химическая структура алифатического фрагмента ПАВ. Как показано в работах [53,54], взаимодействие ДНК с катионом 1Ч-додецилпиридиния (1Ч-ДДП) начинается при гораздо более низкой концентрации последнего, чем с ДДТМАБ. Авторами исследовано также влияние температуры на характер связывания ДНК с ПАВ и показано, что температура. влияет очень незначительно, однако существует точка инверсии при 27 °C, до которой наблюдается незначительный сдвиг изотерм связывания вправо, т. е. в сторону больших концентраций ПАВ, а после нее — влево. Для определения внутренней структуры продуктов реакции была использована флуоресцентная метка — пирен. Оказалось, что комплекс ДНК-ПАВ имеет гидрофобные области, аналогичные обычным мицеллам.
Взаимодействие ДНК с противоположно заряженным ПАВ изучали методом флуоресцентной микроскопии [55,56]. На рис. 7 представлен типичный пример изменения конформации ДНК в процессе связывания с ПАВ. Видно, что ДНК претерпевает конформационный переход клубок-глобула при увеличении концентрации ПАВ. Подобный результат был ранее получен при взаимодействии ДНК с другими компактизующими агентами, такими как незаряженные гибкие полимеры, катионы многовалентных металлов, спирты, полипептиды и т. д. [57−63]. Был изучен характер этого конформационного перехода [55,56]. На рис. 8 представлена изотерма связывания ионов цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ). Заштрихованная область на рис. 8 соответствует «области сосуществования», что нашло свое подтверждение в экспериментах по измерению размеров молекул с использованием флуоресцентного микроскопа (см. рис. 9). Очевидно, что используемая в данном случае концентрация ДНК в растворе (6.0×10″ 5 М) оказывается в 100 раз больше концентрации ДНК, необходимой для исследований с использованием флуоресцетного микроскопа. В сочетании с результатами, полученными в работе [43], эти данные демонстируют независимость изотерм связывания ионов ЦТАБ макромолекулами ДНК вплоть до концентрации последней 10″ 3 М. Как видно из рисунка, изотерма имеет типичную 8-образную форму, что указывает на высокую кооперативность процесса связывания. Интересно отметить, что критическая концентрация агрегатообразования (ККА) оказывается на 2 порядка ниже ККМ раствора ЦТАБ в отсутствии ДНК [64]. Следует также отметить, что значения р не достигают единицы и остаются практически постоянными и равными 0.7 при концентрации ПАВ выше 2.0×10~5 М. Подобное поведение может быть объяснено совместным действием двух эффектов: эффекта Маннинга (конденсации противоионов) [65,66] и изменения высокоупорядоченной структуры ДНК при взаимодействии с ПАВ. В соответствии с теорией Маннинга для разбавленных растворов полиэлектролитов [67] для нативной ДНК 76% зарядов полииона скомпенсированы присутствием сконденсированных противоионов. Это означает, что связывание в данном случае сопровождается реакцией обмена с малыми противоионами (в данном случае Ма+). Как видно из рис. 8, экспериментальные значения р очень близки к предсказанным теоретически Маннингом (0.76).
10.0)Ш1.
Рис. 7. Изображения молекул гигантской ДНК Т4 (а) и комплексов.
ДНКТ4-ДСДАХ при концентрации ДСДАХ 1×10″ 5 (Ъ), 5×10″ 5 © и 1×10−4 М ((1), полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, [55].
1.0*10″ 5 1.040*4.
Рис. 8 Изотерма связывания ионов цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ) макромолекулами ДНК Т4, [56].
Степень связывания, равная 1, соответствует предельному случаю, когда все фосфатные группы ДНК связаны с противоположно заряженными ионами ПАВ. Однако, комплекс ДНК-ПАВ состава 1:1 не может быть получен экспериментально вследствие стерических ограничений, возникающих из-за того, что размеры ионогенной группы ЦТАБ оказываются больше расстояния между зарядами в молекуле ДНК [68].
На основании рассмотренных литературных данных по исследованию реакции взаимодействия ДНК с противоположно заряженными ПАВ можно заключить, что данный процесс характеризуется высокой кооперативностью и сопровождается конформационным переходом молекул ДНК «клубок — глобула» .
СрШ.
10−6 10−5 10−4 ю-З.
1 а.
ЛГТТИ^^ТПППППТ^^^И!
— 2.
Рис. 9 Зависимость размеров макромолекул ДНКТ4 от концентрации ЦТАБ в системе, [56].
выводы.
1. Показано, что в результате реакции между макромолекулами ДНК и противоположно заряженными ионами ПАВ в разбавленных водных растворах образуются агрегаты стехиометричных комплексов ДНК-ПАВ, имеющие форму тора.
2. Установлено, что тщательно высушенные комплексы ДНК-ПАВ независимо от молекулярной массы ДНК способны растворяться в малополярных органических растворителях с сохранением двуспиральной нативной конформации макромолекул ДНК.
3. Впервые обнаружено, что комплексы ДНК-ПАВ в хлороформе независимо от молекулярной массы ДНК имеют компактную конформацию. При исследовании морфологии таких комплексов, полученных из хлороформа, методами СТМ и АСМ обнаруживаются торообразные частицы, включающие в среднем одну молекулу ДНК. Таким образом, растворение комплексов в хлороформе сопровождается диспергированием их частиц до молекулярных размеров.
4. Впервые обнаруженное явление компактизации макромолекул ДНК в неполярном растворителе объяснено особенностями двунитевой структуры ДНК как таковой, т. е. внутренним свойством незаряженной двойной спирали.
5. Обнаружен перенос комплексов ДНК-ПАВ через границы раздела фаз вода/органический растворитель/водный раствор NaCl, который может служить моделью трансмембранного переноса ДНК.
