Несмотря на большое количество предлагаемых в настоящее время методов исследований биологических субстратов, новые подходы к уже известным методам позволяют увидеть новые горизонты в клинической лабораторной диагностике.
С.Н.Шатохиной и В. Н. Шабалиным [1995], предложен метод клиновидной дегидратации капель биологической жидкости, который позволяет получить сухую пленку — фацию, представляющую собой структурированные и расположенные в определенном порядке выпавшие в осадок минеральные и органические компоненты, растворенные в жидкости. Морфология фаций различных биожидкостей здоровых людей и лиц, страдающих различными заболеваниями, сильно отличаются между собой.
В ходе исследований структуризации капель мочи установлено, что у лиц, страдающих мочекаменной болезнью, при высыхании капель мочи, содержащей белок, происходит кристаллизация камнеобразующих солей в белковой среде — феномен Шатохиной-Шабалина.
В результате научных поисков был разработан диагностикум «ЛИТОС-система», (Приказ МЗ РФ № 17 от 21 января 1997 г.). Он позволил определять активность процесса камнеобразования в почках как при установленном диагнозе мочекаменной болезни, так и на доклинической стадии заболевания. Диагностикум успешно используется в практике диагностических лабораторий (Зарубина М.Л., Ступина Л. И., 2001, Дасаев Л. А., Шилова Е. М., 2003, Шилова Е. М. и соавт. 2004).
По существу, появилось новое научное направление — морфология биологических жидкостей, которое предоставляет медицине и биологии новые возможности в клинической кристаллографии (Шатохина С.Н., 1995, Шабалин В. Н., Шатохина С. Н., 2001). Данной научному направлению были посвящены две Всероссийские научнопрактические конференции в 1997 и в 2001 гг. [62,81].
Вместе с тем, описанные закономерности структурирования при использовании метода клиновидной дегидратации охватывают далеко не все биологические жидкости. Трактовка механизмов формирования их фаций основывается в основном на теоретических положениях (С.Н.Шатохина, 1995; С. Н. Шатохина, В. Н. Шабалин, 1997; С. Н. Шатохина, В. Н. Шабалин, 1998(1,2)).
Ряд биологических жидкостей человека имеют близкие значения плотности, содержания белка и их фации имеют похожее морфологическое строение (Семенов, Н.В., 1971; Козинец Г. И. 2000; Шабалин В. Н., Шатохина С. Н., 2001). Это позволяет предположить существование общего механизма формирования этих фаций.
При исследовании высыхающих капель ряд авторов отмечают в них различные гидродинамические явления, однако результаты наблюдений носят достаточно противоречивый характер (A.Zole, 1995; R.D.Deegan, 2000).
Показано, что при высыхании капель жидкостей содержащих различные компоненты происходило образование фаций с похожими морфологическими структурами (A.Zole, 1955, J. Conwey et al., 1977; E. Parisse C.Allain, 1977).
Процесс структуризации капель биологических жидкостей представляет собой фазовый переход веществ из растворенного состояния в твердое, с формированием определенных структур — физико-химический процесс, принципы которого являются главенствующими в биологии (Титов В.Н., 2004).
Установление механизмов формирования структуры остатка выпаривания биологических жидкостей, одна из наиболее сложных задач физико-химической гидродинамики, теории массопереноса и фазовых переходов (Чашечкин Ю.Д., 2001), относящихся к приоритетным направлениям фундаментальных исследований РАН («Поиск», 1998).
Недостатками исследований морфологии биологических жидкостей является описательный подход и недостаточное использование морфометрических методов.
Для разрешения имеющихся противоречий между результатами различных исследований и теоретическими положениями, являющимися основой метода клиновидной дегидратации, мы решили провести исследования процессов структуризации капель мочи, сыворотки крови, смеси растворов солей и альбумина с использованием данного лабораторного метода, с целью оптимизации его возможностей и разработки нового методологического подхода к исследованию морфологического анализа биожидкостей, с применением морфометрических методов.
Цель исследования.
Установить физико-химические механизмы процесса структуризации в ходе фазового перехода веществ из жидкого состояния в твердое в высыхающей капле мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью с использованием диагноста кума «ЛИТОС-система» с применением морфометрических методов.
Задачи исследования.
1. Изучить гидродинамические процессы, возникающие в капле воды, мочи и других биожидкостях, при их высыхании.
2. Исследовать физико-химические закономерности фазового перехода компонентов из растворенного состояния в твердое, в высыхающих каплях мочи у здоровых людей и больных мочекаменной болезнью, растворов солей и белков с использованием диагностикума «ЛИТОС-система», с применением весовых методов, микрометрии, микроскопии и микрофотографии.
3. В моче больных мочекаменной болезнью установить природу фактора, формирующего в фациях структуры, указывающие на наличие этого заболевания.
4. Оценить процесс изменения камнеобразующей активности мочи у пациентов с мочекаменной болезнью в условиях спонтанного диуреза и процесса лечения на курорте «Краинка» минеральными водами курорта, в сочетании их с фармакологическими средствами.
5. Разработать модификацию методов оценки камнеобразующих свойств мочи для объективизации процесса исследования и документирования его результатов.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования.
Предложена новая трактовка механизмов структуризации, происходящих в капле высыхающей биологической жидкости, позволяющая объяснить процесс образования фаций с классических научных позиций гидрои термодинамики, физической и коллоидной химии, и использовать результаты в клинической лабораторной диагностике.
Впервые выявлена закономерность гидродинамических процессов возникающих в высыхающих каплях водных растворов: наличие торообразных циркуляционных потоков и образование на периферии застойной краевой зоны. Установлены механизмы их возникновения.
На основании изучения хронометрической последовательности процессов, происходящих в высыхающей капле мочи, впервые установлены общие закономерности, и принципиальные различия в ходе формирования фаций в пробах мочи у здоровых и больных мочекаменной болезнью.
Впервые установлена природа фактора, оказывающего влияние на формирование в фациях мочи больных мочекаменной болезнью характерных структур, имеющего муциновую основу.
Впервые описаны механизмы формирования фаций биожидкостей, объясняющие причины разделения их на краевые и центральные зоны.
Предложена гипотеза, объясняющая причины формирования различных фаций в каплях из проб мочи здоровых людей и страдающих мочекаменной болезнью при использовании диагностикума «ЛИТОС-система».
Установлено, что диагностикум «ЛИТОС-система» выявляет степень насыщения мочи муцином.
Научно-практическая значимость.
Разработаны и внедрены в практику работы клинико-диагностической лаборатории ООО Санаторий (курорт) «Краинка» и в Центре клинической лабораторной диагностики Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова методы диагностики мочекаменной болезни, позволяющие объективизировать исследования структуризации капель биологических жидкостей:
— способ получения документированного изображения фаций, удостоверение на рационализаторское предложение № 1466 от 20 октября 2005 г, выданное СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова;
— способ маркировки альбумина для определения его локализации в фациях биожидкости, удостоверение на рационализаторское предложение № 1467 от 20 октября 2005 г, выданное СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова;
— морфометрический способ определения объема фаций биожидкости, удостоверение на рационализаторское предложение № 1468 от 20 октября 2005 г, выданное СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова;
В результате работы получено обоснование для разработки нового способа лечения мочекаменной болезни.
Положения, выносимые на защиту.
1 .В высыхающих каплях жидкостей (биожидкостей) па горизонтальной подложке при комнатной температуре протекают гидродинамические процессы, характеризующиеся торообразными циркуляционными потоками и формированием застойной краевой зоны. Установлены механизмы их формирования, в основе которых лежат термодинамические, концентрационные и гидродинамические принципы.
2. При формировании фаций в каплях мочи здорового человека с использованием диагностикума «Литос-система», происходит формирование краевой белковой зоны. При образовании фации из капель проб мочи пациентов с почечным камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование фаций биожидкостей в ходе фазового перехода, происходит только в краевой зоне при достижении в ней перенасыщенной концентрации растворенных компонентов.
3. Камнеобразующая активность мочи, определяется присутствием в ней уромукоида. Модуляция свойств уромукоида in vitro уксусной кислотой, in vitro и in vivo муколитиками снижает уровень камнеобразующей активности в образцах мочи.
4. Механизмы формирования фаций из капли пробы мочи здорового человека определяются свойствами альбумина, который препятствует кристаллизации солей и совершает фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне. Наличие уромукоида в моче у больных мочекаменной болезнью, препятствует проявлению защитных свойств альбумина и способности совершать фазовый переход из золя в гель.
Апробация работы.
Материалы конференции были доложены на II Международном конгрессе по курортологии- 2000 г., 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Морфология биологических жидкостей в диагностике и контроле эффективности исследований», 2001 г., научно-практической конференции «Проблемы диагностики до нозологических состояний в профилактической и клинической медицине» в рамках работы пленума «Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды», 2003 г. Научно-практическом симпозиуме по проблеме.
Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина", 2004 г., Ill (VII) съезде Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики, 2005.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, и списка литературы. Работа иллюстрирована 52 рисунками, 10 таблицами, Список литературы содержит 135.
Выводы.
1. Выявлена закономерность гидродинамических процессов, возникающих в высыхающих каплях водных растворов (биожидкостей) -наличие торообразных циркуляционных потоков, и образование на периферии капли застойной краевой зоны. Механизмами их возникновения являются термодинамические и концентрационные факторы.
2. В эксперименте с использованием методов морфометрии доказана хронометрическая последовательность процессов происходящих в капле мочи при ее структуризации у здоровых людей и больных МКБ. Одновременно установлены и принципиальные различия в процессе формирования Ф у здоровых людей и больных МКБ.
3. Предложена гипотеза, объясняющая механизм структуризации Ф мочи пациентов с активным камнеобразованием и здоровых людей. При формировании Ф из смеси мочи здорового человека и ДЛС происходит формирование краевой белковой зоны, связанное со свойствами альбумина, проявлять защитные свойства в отношении кристаллов солей и совершать фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне. При образовании Ф из мочи с камнеобразованием, белковая зона не формируется и в краевой зоне происходит кристаллизация солей. Формирование Ф капли камнеобразующей мочи, определяется действием уромукоида, присутствующим в ней, и препятствующим альбумину проявлять защитные свойства и совершать фазовый переход из золя в гель в застойной краевой зоне.
4. Показано снижение камнеобразующей активности мочи под действием in vitro уксусной кислоты и муколитиков, и in vivo под действием муколитиков на фоне санаторно-курортного лечения, что указывает на роль уромукоидов в формировании камнеобразующих характеристик мочи.
5.Вскрыт и описан механизм формирования Ф биожидкостей и разделение их на краевую и центральную зоны. В его основе лежит свойство биожидкости в высыхающей капле образовывать структуры только в краевой зоне, которые в пределах одной зоны образуют концентрические окружности идентичные по своему химическому составу. Формирования Ф биожидкостей в ходе фазового перехода происходит только в краевой зоне при достижении критической концентрации растворенных компонентов. Центральная зона формируется в условиях отсутствия фактора воздействия застойной краевой зоны.
6. Разработана модификация методов оценки камнеобразующих свойств мочи, позволяющих объективизировать диагностический процесс обнаружения МКБ с использованием ДЛС: способ маркировки альбумина метиленовым синим, морфометрический способ измерения объема Ф. биожидкостей, а также способ получения документированного изображения биожидкостей.
Практические рекомендации.
1. При проведении исследований мочи на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, для улучшения диагностической эффективности рекомендуется маркировать альбумин, входящий в состав диагностикума метиленовым синим.
2. При проведении исследований мочи у пациентов с мочекаменной болезнью на камнеобразующую активность с использованием ДЛС, необходимо учитывать, что прием муколитиков снижает уровень камнеобразующей активности мочи.
3. Для объективизации полученных результатов исследования структуризации капель биожидкостей, предлагается способ получения документированного изображения фаций без использования фотоаппаратов и видеокамер.
