Прогностическое значение клинических, морфологических, иммуногистохимических факторов у больных раком молочной железы I и IIa стадии

В России рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости у женщин с 1985 года. Число впервые выявленных случаев заболевания и смертность от этой патологии имеют тенденцию к неуклонному росту по всей территории Российской Федерации и стран СНГ [12].

Во всём мире каждый год регистрируется более 1 млн. новых случаев рака молочной железы. В России в 2007 году выявлено 51 865 пациенток со злокачественными новообразованиями молочных желез. Годовой прирост заболеваемости при этом составил 8,9%, что на 0,3% ниже по сравнению с 2006 годом. Самый высокий уровень заболеваемости и темпы прироста отмечены в возрастных группах 60−64 года (136,5 на 100 тысяч населения) и 65−69 лет (133,2 на 100 тысяч населения) [12, 124] .

В структуре смертности злокачественные новообразования молочной железы имеют наибольший удельный вес — 16,5%. В России от него в 2007 году умерли 23 064 женщины. Наибольший возрастной показатель смертности — 86,2 случаев на 100 тысяч населения приходиться на 75 лет, а в возрастном интервале 70−74 года он составляет 75,8 случаев на 100 тысяч населения[12, 124].

Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что, несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, в настоящее время нельзя констатировать наличие значительного прогресса в снижении смертности от данного заболевания, как в России так и в большинстве развитых стран мира [3,4, 12].

Несмотря на то, что рак молочной железы чаще встречается в возрасте 5565 лет, в последние годы наблюдается тенденция к увеличению числа молодых женщин с данной патологией [10, 12, 14, 19]. Сведения о частоте заболеваемости среди них весьма противоречивы и колеблются от 2,6 до.

7,5% [12, 21, 39]. На сегодняшний день доказано, что рак молочной железы протекает у пациенток молодого возраста более злокачественно, чем в более старших возрастных группах [11, 21, 39, 44, 47]. Так в 2007 году на конференции в СанГалене доложено, что возраст до 35 лет при раке молочной железы является неблагоприятным признаком прогноза [39].

Стадия процесса при первичном обращении имеет доказанное прогностическое значение. Так при местно распространенном раке 5- и 10-летняя общая выживаемость составляет 34% и 29%, а при I и П-а стадии 5-и 10-летняя выживаемость равна 92% и 87% соответственно [38, 39, 49, 45].

Влияние статуса рецепторов стероидных гормонов обсуждается для женщин различных возрастных групп, в зависимости от сохранности менструальноовариальной функции. В целом большинство авторов склонны считать, что присутствие гормональных рецепторов определяет высокую эффективность гормонотерапии. Эффективность гормонотерапии при наличии в опухоли рецепторов составляет 50−70%. При наличии рецепторов только одного типа эффективность снижается до 33%. Приблизительно 11% рецепторотрицательных опухолей отвечает на применение гормонального лечения. Содержание рецепторов к стероидным гормонам в разных возрастных группах различно: у 45% больных в пременопаузе и у 63% пациенток в постменопаузе опухолевые клетки содержат рецепторы к эстрогену и прогестерону, 25% больных в пременопаузе и 9% в постменопаузе имеют положительный только один из стероидных гормонов. У 28% больных в пременопаузе и у 17% в постменопаузе рецепторы отрицательные. [20, 55, 61,77, 96].

Примерно в 20- 34% случаев инвазивного рака молочной железы отмечается гиперэкспрессия и/или амплификация Нег-2/пеимолекулы, подобной рецептору тирозинкиназы и принадлежащему к семейству рецепторов человеческого эпидермального фактора роста (ЕОРЯ) — НЕ11−2.

НЕ11−2/яем, с-егЬВ-2). Опухоли считаются Нег-2/пеи положительными, если при иммуногистохимическом исследовании отмечается гиперэкспрессия 3+, 6 либо выявлена амплификация гена с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) [39]. Гиперэкспрессия и/или амплификация Нег-2/neu ассоциируется с повышенной клеточной пролиферацией, инвазивностью, усиленным ангиогенезом, сниженным апоптозом опухолевых клеток и, как следствие, метастазированием опухоли [109].

С уровнем экспрессии Her-2/neu связывают продолжительность общей и безрецидивной выживаемости. Различные исследования показывают неоднозначные результаты. Так при наличии гиперэкспрессии данного белка ряд публикаций доказывают выраженное снижение продолжительности жизни больных, что ассоциируется с плохим прогнозом [9, 62]. 3-х и 5-летняя выживаемость у больных HER-2 при раке молочной железы I-II стадии (N") в 2−2,5 раза дольше (98% и 96%), нежели у больных с уровнем экспрессии HER-2 «++» (54% и 45%) и уровнем экспрессии HER-2 «+++» (41% и 34%) [13, 130].

Другие авторы напротив, при отрицательных значениях Her-2/neu в сочетании с рецепторотрицательным статусом, так называемый тройной негативный рак (triplenegative), представляют данные, свидетельствующие о низких показателях выживаемости [92, 115, 120]. Выживаемость как общая, так и 5-летняябезрецидивная больных с тройнымнегативным раком ниже, чем у больных с положительными рецепторами эстрогенов и прогестерона и амплификацией Her2/neu. Удельный вес больных с I стадией процесса в группе ТНРМЖ крайне низкий [114].

Белок р53 является продуктом гена-супрессора опухоли р53 и экспрессируется во всех клетках организма. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется. Этот процесс состоит в приобретении способности белка р53 связываться с ДНК и индуцировать транскрипцию генов регуляторной области, которая обозначается р53-response element (участок ДНК, с которым связывается белок р53). Таким образом, р53 — фактор, который запускает транскрипцию группы генов и который активируется при накоплении повреждений ДНК. Результатом активации р53 является остановка клеточного цикла и репликации ДНКпри сильном стрессовом сигнале запускается апоптоз-программированная клеточная гибель. Мутантный р53 экспрессируется при метастатическом раке в 50% случаев, при инвазивном раке молочной железы — в 25% случаев. Мутантный р53 ассоциирован с лекарственной и лучевой резистентностью [29, 54].

Совершенствование методик морфологического исследования, широкомасштабное развитие иммуногистохимической и иммунологической диагностики позволяют совершенствовать методы лечения и определить индивидуальный прогноз в каждом конкретном случае, т. е. выработать индивидуальную программу лечения [33, 53, 58, 110].

Несколько десятилетий назад были созданы первые приборы для исследования клеток опухоли, последующее их совершенствование способствовало появлению и развитию нового направления — количественных методов исследования в онкоморфологии. В настоящее время из этого направления наибольшее развитие получил метод лазерной ДНКпроточной цитофлуорометрии [2,8, 108].

Современные критерии, использующиеся для прогнозирования течения заболевания, представляют собой клинико-морфологические и молекулярные показатели. К первым относят: возраст, менструальный статус, размер первичной опухоли, количество метастатически пораженных регионарных лимфатических узлов, морфологическая градация опухоли и степень злокачественности. Ко вторым: рецепторный статус клеток карциномы, гиперэкспрессия белка Нег-2/пеи, уровень синтеза р53, плоидность и показатели пролиферативной активности. Точность прогноза позволяет выделить категорию больных, нуждающихся в адьювантной терапии для предотвращения дальнейшего роста опухоли и отдаленного метастазирования [35, 100, 102, 114]. Выявление вышеуказанных 8 особенностей, связанных с анализом количественных параметров молекулярных особенностей клеток опухоли (число клеток в Sфазе, плоидность, индекс пролиферации) наряду с экспрессией р53 является весьма актуальной и целесообразной задачей.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния основных прогностических факторов у больных раком молочной железы I и Па стадии на основе многофакторного анализа прогноза заболевания.

Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить прогностическую значимость клинических факторов (возраст, стадия болезни), морфологических и биологических факторов (рецепторный статус, экспрессия Her-2/neu и р53) у больных раком молочной железы I и Па стадии.

2. Определить прогностическую значимость количественных показателей ДНКпроточной цитуфлоорометрии: плоидность, число клеток в S фазе, число клеток в G+M фазе, процент анеуплоидных клеток и индекс пролиферации у больных раком молочной железы I и Па ст.

3. Выявить зависимость между морфологическими критериями (гистологический тип опухоли, степень злокачественности) и уровнем экспрессии р53- mut у больных раком молочной железы I и Па стадии.

4. Оценить особенности данных ДНКпроточной цитофлуорометрии и уровня мутантного р53 при различных гистогенетических подтипах рака молочной железы.

5. Определить значимость уровня экспрессии p53-mut для прогноза течения заболевания на основании многофакторного анализа.

Научная новизна.

Впервые в нашей стране для определения индивидуального прогноза течения заболевания и выработки тактики лечения у больных раком молочной железы использован наряду с клиническими, морфологическими, иммуногистохимическими факторами молекулярнобиологический показатель р53-тЩ вместе с показателями ДНКпроточной цитофлуорометрии. Выполнено комплексное изучение количественных параметров клеток опухоли у больных I и Па стадии рака молочной железы. Изучение плоидности, числа клеток в Б фазе, числа клеток в Сх+М фазе, процента анеуплоидных клеток и индекса пролиферации опухолей, сопоставление полученных результатов с клиникоморфологическими параметрами позволили установить преобладание анеуплоидных образований у больных раком молочной железы I и Па стадии и более агрессивное их течение.

На основании полученных данных о корреляции р-53−1шй в опухолевых клетках со стадией заболевания, индексом ДНК и степенью злокачественности были отобраны группы больных с изначально неблагоприятным прогнозом, требующие интенсификации лечебных мероприятий.

Полученные данные позволили выявить особенности данных ДНК-проточной цитофлуорометрии и уровня р53-тЩ при различных гистогенетических подтипах ранних форм рака молочной железы.

Нам удалось установить ряд признаков ДНК-проточной цитофлуорометрии и уровня экспрессии р53-тЩ характерных для гистогенетических подтипов Люминальный, А и тройной негативный рак молочной железы.

На основе многофакторной модели выявлены клинические, биологические, иммуногистохимические прогностические факторы различных гистогенетических подтипов, позволяющие с высокой степенью достоверности предсказать индивидуальный прогноз заболевания.

Полученные клинические, морфологические данные и данные ДНК-проточной цитофлуорометрии, экспрессии р53, позволили выбрать более оптимальный вариант комплексной и комбинированной терапии и установить более точные показатели прогноза общей и безрецидивной продолжительности жизни.

Практическая значимость.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о необходимости одновременного определения параметров ДНКпроточной цитофлуорометрии и уровня р53- mut, а также определять эти параметры при различных гистогенетических подтипах рака молочной железы.

Введение

в алгоритм обследования подобных комбинаций позволяет более достоверно оценивать долгосрочный прогноз и корректировать лечебную тактику.

Созданная в исследовании математическая модель индивидуального прогнозирования течения заболевания является реальной перспективой для внедрения в практическую деятельность онкологических клиник.

Выводы.

1. При I и Па стадии у больных раком молочной железы прогноз течения заболевания зависит от биологических и морфологических характеристик опухоли. Важно точно уставить гистологический тип опухоли, индекс пролиферации и число клеток в СО/1 фазе. Несколько ниже прогностическая значимость числа клеток в 8- фазе, числа анеуплоидных клеток в опухоли, степени метастатического поражения лимфатических узлов и степени злокачественности опухоли (р<0,05), данные получены на основе многофакторного анализа.

2. Минимальное влияние на продолжительность жизни больных раком молочной железы I и П-а стадии оказывают общепринятые клинические факторы — возраст, стадия болезни, статус рецепторов стероидных гормонов и уровень экспрессии НЕК-2/пеи (р<0,05), данные получены на основе многофакторного анализа.

3. Достоверно значимое снижение общей и безрецидивной выживаемости больных наблюдается при количестве анеуплоидных клеток в опухоли более 61% (р=0,05), индексе пролиферации более 20% (р=0,02), количестве клеток в 8-фазе более 15% (р<0,001), индексе ДНК менее 1,0 (р=0,02), количестве клеток в 02+М-фазе более 9% (р=0,02) и количестве клеток в 00/1 фазе менее 80% (р<0,001).

4. Согласно анализа продолжительности жизни при I и Па стадии уровень экспрессии р53-ши! привносит минимальную прогностическую значимость, но дает положительные корреляции с гистологическим типом рака и степенью злокачественности: для инфильтративнопротокового рака уровень его экспрессии значительно выше, чем при прочих формах рака молочной железыи чем выше степень злокачественности, тем больше уровень р53-тШ: в клетках опухоли (р<0,05).

5. Увеличение уровня экспрессии р53-тЩ достоверно снижает общую и безрецидивную выживаемость больных (р=0,039). С увеличением экспрессии р53 общая и безрецидивная Зх и 5ти летняя выживаемость существенно снижается (с 93% до 63%).

6. Значимость уровня экспрессии р53-шЩ на основании многофакторного анализа много меньше, чем рецепторный статус опухоли, экспрессия НЕЯ-2/пеи и морфологических характеристик (гистологический тип опухоли, степень злокачественности, количество пораженных лимфоузлов и размер опухолевого узла (р<0,05)).

7. Особенности данных лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии и р53-тЩ при разных гистогенетических подтипах таковы: характерным количеством клеток Б-фазы для подтипа люминальный, А оказалось от 8 до 14% (66,7%), а для тройного негативного подтипа — > 15% (43,8%) клеток. Экспрессия мутантного р53-пиИпоказала себя высокой в тройном негативном подтипе — 56,2% и низкой до 62,5% в подтипе люминальный А.

Заключение

.

Проблема роста заболеваемости рака молочной железы была и остается актуальной и по сей день, так как наблюдается неуклонный рост числа впервые выявленных случаев патологии, инвалидизации и смертности от неё женщин различных возрастов. Не смотря на большой прогресс в диагностике и лечении рака молочной железы, достигнутый в последние десятилетия, не удаётся получить полный контроль над течением этого заболевания. Оптимизация, путем выявления пациенток с ранними стадиями рака молочной железы и адекватное первичное лечение, остается одной из актуальных проблем современной клинической онкологии.

Общий прирост заболеваемости РМЖ в России за последние годы превысил 8,9%, а смертности около 3%. Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что, несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, в настоящее время нельзя констатировать наличие значительного прогресса в снижении этих показателей. Все это заставляет искать новые пути в диагностике, выявлении заболевания на ранних стадиях, лечении и устанавливать новые факторы прогноза при раке молочной железы [12,22].

Для предсказания прогноза заболевания используются различные прогностические и предсказывающие факторы: возраст, клиническая стадия, гистологическая градация опухоли, степень злокачественности, ее рецепторный статус, экспрессия Нег-2/пеи, экспрессия р53-тЩ. Так же факторы, которые отражают биологические особенности опухоли, которые позволяют определять индивидуальный прогноз и судить о прогрессировании при небольшой распространенности опухолевого процесса, к таким относится исследование лазерная ДНК-проточная цитофлуорометрия.

Большим преимуществом лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии является прекрасная воспроизводимость и объективная оценка сразу нескольких индивидуальных характеристик опухоли, отражающих степень ее агрессивности (плоидность, индекс ДНК, количество анеуплоидных клеток, число клеток в 00/1, 8, 02+М фазах клеточного цикла и индекса пролиферации) [57].

В проведённом исследовании использованы материалы клинических наблюдений 348 больных раком молочной железы I и П-а стадии, находившиеся на обследовании и лечении в клиниках РОНЦ им. Н. Н. Блохина за период с 1998 по 2002 гг.

Средний возраст больных по всему исследованию составил — 54,8±11,9 года, при этом минимальное число полных лет зарегистрированное в исследовании — 21 год, а максимальное — 89 лет. Медиана возраста по исследованию составляет — 54 года. По возрастным группам все больные в исследовании распределились следующим образом: до 35 лет — 15(4,3%) больныхот 36 до 55 лет — 173 (49,7%) больныхот 56 лет и более — 160 (46%).

При оценке прогностической значимости возрастного фактора на отдаленные результаты лечения были получены следующие данные. При I стадии заболевания, когда в большинстве случаев имеется возможность выполнить радикальное хирургическое вмешательство независимо от возраста пациента, прогностическая ценность этого фактора не так значима как при распространенных стадиях болезни. В нашем исследовании не выявлено достоверных различий в общей и безрецидивной выживаемости больных ранних стадий в группах молодого, среднего и пожилого возрастов.

Сохранная менструально-овариальная функция была выявлена у 135 (38,8%) пациенток, в стадии инволюции функции яичников находились 213 (61,2%) больных.

Поражение правой и левой молочных желёз встречалось примерно в равных соотношениях. Частота поражения правой железы — 186 (53,4%), левой — 162(46,6%).

Поражение различных квадрантов молочной железы было зафиксировано с различной частотой. В наибольшем проценте случаев встречается поражение верхних квадрантов: наружного — 122 (35,1%), внутреннего — 41 (11,8%) случаев и граница верхних квадрантов -78 (22,4%) случаев соответственно.

Морфологическая структура опухоли является важным прогностическим критерием у больных раком молочной железы. В исследовании наиболее часто встречался ИПР — 191 (54,9%), второй по частоте был ИДР — 85 (24,4%), редкие формы РМЖ составляли — 72 (20,7%) от общей базы исследования.

При ИДР общая 3-летняя выживаемость — 98,8±1,2%, 5-летняя — 95±2,4% (р=0,041) — безрецидивная 3-летняя — 95,2±2,4%, 5-летняя — 90,3±3,3% (р=0,025) значимо выше, чем при ИПР. При котором: общая 3-летняя выживаемость составляет — 90±2,2% и 5-летняя — 86,2±2,5%, а безрецидивная — 3-летняя — 83,7±2,7% и 5-летняя — 78,8±3%.

В наше исследование были отобраны пациентки с I и П-а стадией.

I стадия встречалась у 220 (63,2%) пациенток, ко Па стадии относилось 128 (36,8%) клинических случая.

Категория рТ] и размер опухоли до 2 см фиксировался у 259 (74,4%) больных, рТг категория и размер от 2,1 см до 5 см определялась у 89 (25,6%) пациенток.

Поражение регионарных лимфоузлов рИ} встречалось у 42 (11,5%) больных, тогда как в 308 (88,5%) случаях метастазы в лимфатические узлы отсутствовали.

Метастазы в одном лимфатическом узле фиксировались у 20 (47,6%) больных, поражение до 3 лимфатических узлов встречалось в 22 (52,4%) случаев.

Среди больных с I стадией наибольшая общая трехлетняя и пятилетняя выживаемость отмечалась среди пациентов с инфильтрирующей дольковой формой рака и составляла 98,8±1,2 и 95±2,4 соответственного, 041), а наибольшая безрецидивная трех и пятилетняя выживаемость у редких форм и составляла 95,8±2,4 и 91,5±3,3 соответственно (р=0,025). Тогда как у инфильтрирующего протокового рака общая трех и пятилетняя выживаемость составила 83,7±2,7 и 78,8±3 соответственно (р=0,025). Наличие редкой формы и инфильтративнодолькового варианта опухоли является наиболее благоприятным прогностическим фактором для больных раком молочной железы, в то время как инфильтрирующий протоковый вариант ухудшают прогноз заболевания.

Степень дифференцировки опухоли также является важным прогностическим критерием. В проведенном нами исследовании значимо чаще при стадии встречается с II степень злокачественности — 139 (72%) пациенток, при Т21М0М0 стадии чаще III степень злокачественности — 48 (57,8%) случаев, а при ТШ1М0 стадии также чаще встречается III степень злокачественности 22 (61,1%) случаев.

В целом по исследованию наиболее часто определяется II степень злокачественности — 178 (57,1%). Тем не менее, различия между инфильтрирующим протоковым раком и инфильтрирующим дольковым находятся на границе значимости (р=0,074 по ТКФ) при I степени злокачественности, где доля больных с протоковым инфильтрирующим раком — И (6,3%), а дольковым — практически в два раза больше — 11 (14,3%). При III степени злокачественности эти значения так же различны: ИПР — 59 (33,9%), а ИДР значительно меньше — 19 (24,7%).

Исходя из представленных данных, можно заключить, что ИДР обладает в целом меньшей степенью злокачественности, чем ИПР. Установлено, что I и II степень злокачественности чаще встречаются при инфильтрирующем дольковом типе РМЖ, а III степень злокачественности при инфильтрирующем протоковом типе РМЖ.

Наше исследование показало, что при II степени злокачественности опухоли общая 3-летняя выживаемость соответствует — 92±2,1%, а 5-летняя.

87,9±2,5%- безрецидивная 3-летняя продолжительность жизни равна -86,9±2,6% и 5-летняя — 82,3±2,9%. Для III степени злокачественности характерен схожий уровень выживаемости: общий 3-летний — 95,8±2,1% и 5-летний — 89,4±3,2%- безрецидивный 3-летний — 87,4±3,4% и 5-летний — 79,8±4,2%. При I степени злокачественности ни одного смертельного случая или случая рецидива за 5 лет наблюдения не выявлено, что свидетельствует о большей выживаемости при ней.

В исследовании зарегистрированы случаи с предоперационным лечением различного объема. Это лечение проводилось при стадии T2N0M0, для выполнения в последующем органо сохранной операции, поэтому у 15 больных (1,5%) до хирургического вмешательства применялась лучевая терапия в режиме укрупненного фракционирования. В 3 (0,9%) клинических случаях в качестве неоадьювантного лечения использовалась химиотерапия в различных схемах.

А уровень патоморфоза был весьма низким, вне зависимости от объёма первичного лечения. Слабый патоморфоз фиксировался в 5 (1,4%) случаях, а умеренный у 3 (0,9%) пациенток.

Большей части больных в нашем исследовании на первом этапе лечения было проведено радикальное хирургическое лечение. Радикальная резекция проводилась у 167 (48%) больных, модифицированная радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц 180 (51,7%) больных, и одной пациентке была проведена радикальная мастэктомия по Маддену (0,3%).

В послеоперационном периоде 248 (71,3%) больных получали различные виды терапии, в зависимости от морфологических и иммуногистохимических характеристик первичной опухоли. Лучевая терапия проводилась у 139 (39,9%) больных, химиотерапия- 76 (21,8%) больным и гормонотерапия использовалась у 116 (33,3%) пациенток. При этом только лучевая терапия была проведена 85 (34,2%) пациенткам, только химиотерапия — 20 (8,1%) больным. Комбинация хирургического лечения с лучевой, химиои эндокринотерапией зафиксирована в 6 (2,4%) случаях.

Значимых различий в выживаемости в зависимости от вида операции не выявлено. При радикальной резекции значения общей 3-летней выживаемости равны — 93,3±2% и 5-летней — 90,2±2,3%, а безрецидивной 3-летней — 90,3±2,3% и 5-летней — 86±2,7%. При радикальной мастэктомии они несколько ниже: общая 3-летняя выживаемость составляет — 94,4±1,7% и 5-летней — 89,9±2,3%- безрецидивная 3-летняя — 87,8±2,4% и 5-летняя — 82,6±2,8%.

Послеоперационное лечение не проводилось в 100 (28,7%) случаях, и использовалась у 248 (71,3%) больных. Несмотря на то, что значимых различий между группами с наличием и отсутствием послеоперационного лечения выявлено не было, необходимо отметить тенденцию увеличения как общей, так и безрецидивной продолжительности жизни при наличии адьювантной терапии. В группе пациенток леченных только хирургически 3-и 5-ти летняя выживаемость составила 94,3±1,5% и 91,3±1,8% по общему и 90,2±1,9% и 86,5±2,2% по безрецидивному критериям, чем в группе без лечения, где общая 3-летняя — 92,9±2,6% и 5-летняя — 86,8±3,4%- безрецидивная 3-летняя — 85,9±3,5% и 5-летняя — 78,7±4,1%. Отмеченная тенденция свидетельствует о целесообразности проведения адьювантного лечения, что подтверждают данные последнего консенсуса в Сан-Галене (2010).

Значимых различий в выживаемости при различных схемам лечения не выявлено. Однако, обращает на себя внимание факт большей безрецидивной выживаемости больных при комплексной тарапии, где значения составляют: безрецидивная 3-летняя — 92,2±3% и 5-летняя — 88,3±3,7%, против значений безрецидивной выживаемости в группе с комбинированной терапией: безрецидивная 3-летняя — 89,3±2,4% и 5-летняя — 85,6±2,7%.

Схемы химиотерапевтического лечения были 2-х видов: антрациклинсодержащие — 50 (65,8%) и без антрациклинов — 26 (34,2%).

Несмотря на то, что значимых различий в продолжительности жизни больных в зависимости от схемы лечения не выявлено, стоит отметить, что.

146 при атрациклиннесодержащих схемах выживаемость в целом несколько выше: общая 3- и 5-летняя — 92,3±5,2%- безрецидивная 3-летняя и 5-летняя — 92,3±5,2%.

По сравнению со схемами антрациклинсодержащими: общая 3-летняя — 92±3,8% и 5-летняя — 87,7±4,7%- безрецидивная 3-летняя — 90±4,2% и 5-летняя — 84±5,2%.

Тот или иной вид прогрессирования заболевания был отмечен у 61 (17,5%) больной, при этом у 287 (82,5%) пациенток новых проявлений болезни отмечено не было. Местный рецидив был отмечен у 9 (14,8%) пациенток, из них у 2 (3,3%) он сочетался с появлением отдалённых метастазов. Метастатическое поражение органов зарегистрировано у 54 (88,5%) больных. 290 (83,3%) пациенток I и Па стадии живы без проявлений болезни, а 42 (12,1%) умерли от основного заболевания.

Изучение количественных параметров клеток опухолей (плоидность, число опухолевых клеток в различных фазах клеточного цикла) с использованием метода лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии, которая позволяет объективно производить измерение содержания ДНК в десятках тысяч клеток за считанные секунды.

Исследование морфологического материала у больных раком молочной железы с использованием метода лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии позволило определить: что из 60 лабораторных образцов в двух образцах опухолевые клетки содержали диплоидный набор хромосом, при этом содержание анеуплоидных клеток в них составляло до 20%. 58 (96,7%) образцов были отнесены к анеуплоидным. До 40% анеуплоидных клеток содержало 6 (10,3%) исследуемых опухолей, от 41% до 60% - 33 (56,9%) и от 61% и выше 19(32,8%) исследованных образцов. Т. е. при анеуплоидных опухолях преобладают значения от 40% до 70% (среднее значение 61%).

При диплоидных же опухолях оба значения были менее 40%.

Гистологическая структура этих опухолей была представлена.

147 инфильтрирующим протоковым и слизистым РМЖ I и II степени злокачественности соответственно. При этом у одной больной метастазов выявлено не было, а у другой зафиксировано поражение 2 региональных лимфатических узлов.

В группе анеуплоидных опухолей ИПР составлял — 28 (48,3%) случаев, ИДР — 19 (32,7%), а РФ РМЖ всего — 11 (19%). I степень злокачественности из них имели 12 (20,7%) образцов, II степень — 24 (41,4%) и III степень — 22 (37,9%) опухолей. Без поражения лимфатических узлов было 49 (84,5%) больных, у 4 (6,9%) пациенток был поражён 1 лимфатический узел, столько же имело поражение 2 лимфатических узлов — 4 (6,9%) и у одной (1,7%) фиксировались метастазы в 3 лимфатических узлах.

Количество анеуплоидных клеток значимо влияет на общую (р=0,009) и безрецидивную (р=0,05) выживаемость. При значении анеуплоидных клеток более 60% отмечалось значимое снижение 3- и 5-летней общей — 57,9±11,3% и 52,6±11,5% соответственно и 3- и 5-летней безрецидивной выживаемости -47,4±11,5% и 47,4± 11,5% больных.

При оценке значений числа клеток в различных фазах клеточного цикла получены следующие результаты: так при оценке количества клеток в СО/1 фазе было выявлено что, при диплоидных опухолях число клеток в фазе 00/1 равнялось 82% и 73%- при анеуплоидных опухолях — медиана составляла 80%, а в среднем — 78,8±8,9%. Минимальное значение признака -44%, максимальное значение — 92%.

Число клеток в фазе вОЛ значимо влияет на общую (р=0,001) и безрецидивную (р<0,001) выживаемость. При числе клеток в фазе СО/1 более 80% общая 5-летняя выживаемость — 89,5±7,1% и 5-летняя безрецидивная выживаемость — 91,9±5,5%, что значимо выше, чем при числе клеток в 00/1 фазе менее 80%.

В результате оценки индекса ДНК при диплоидных опухолях индекс ДНК в обоих случаях был равен 1- распределение больных при анеуплоидных опухолях имеет следующий вид: до 1 — 6 (10,3%), от 1,1 до 1,5 — 27 (46,6%) и.

148 от 1,6 и выше — 25 (43,1%). При индексе ДНК менее 1, общая 5-летняя выживаемость — 37,5=Ы7,1% значимо ниже, чем при других значениях. Так же можно отметить тенденцию к росту общей выживаемости с ростом индекса ДНК. Это подтверждает и исследование проведенное [103], где при оценке плоидности опухоли рассчитывали индекс ДНК, который характеризовал отношение интенсивности флюоресценции пика анеуплоидных клеток к диплоидному. Диплоидными опухолями считали те, у которых пик 00/1 находился в пределах контрольного пика диплоидных стандартов (был равен 1,0). В анеуплоидных опухолях он был больше или меньше 1,0. Из 215 пациенток с доказанным раком молочной железы 96 (44,7%) имели диплоидные опухоли и 119 (55,3%) — анеуплоидные. В группе больных с анеуплоидными опухолями в 61 (51,3%) случае доля анеуплоидных клеток в опухоли составила до 50% и в 58 (48,7%) — более 50%. Сравнение двух групп больных показало, что в группе больных с диплоидными опухолями безрецидивная и общая выживаемость достоверно лучше, чем в группе пациенток с анеуплоидными опухолями с ИДНК 1,1 — 1,84. Показатели безрецидивной выживаемости достоверно не различались. Полученные данные также свидетельствуют о том, что при индексе ДНК =1,0 имеют наиболее благоприятный прогноз в группе анеуплоидных опухолей. Общая и безрецидивная выживаемость снижалась при индексе ДНК больше или меньше 1,0 [148].

При оценке количества клеток в Бфазе при диплоидных опухолях число клеток в 8 фазе равнялось 10% и 12%, а при анеуплоидных опухолях больные распределены следующим образом: до 7% - 10 (17,2%), от 8% до 14% - 31.

53,4%) и от 15% и больше — 17 (29,3%) — среднее ±-8Б — 11,7±4,8%, медиана.

10,5%. Минимальное значение — 4%, максимальное -27%. число клеток в 8 фазе при диплоидных опухолях находится около среднего значения числа клеток в 8 фазе при анеуплоидных опухолях — 11,7%. Число клеток в 8 фазе значимо влияет на общую (р<0,001) и безрецидивную (р<0,001) выживаемость. При числе клеток в 8 фазе более 14% общая и безрецидивная.

149 выживаемость значимо снижается до значений общей 3-летней выживаемости — 47,1±12,1% и общей 5-летней выживаемости — 35,3±11,6%. Безрецидивная выживаемость при этом составляет 3-летняя — 17,6±9,2%, а 5-летняя — 5,9±5,7%.

Многие исследователи, так же как и в нашем исследовании, отмечают связь между увеличением числа клеток в S-фазе клеточного цикла и повышенным риском возврата заболевания и смертностью больных [49, 79, 106]. Так, по данным ряда авторов, процент клеток в S-фазе клеточного цикла является прогностическим фактором для общей и безрецидивной выживаемости, уступающим по значимости только статусу лимфатических узлов [106, 149, 153]. Некоторые исследования указывают на то, что пролиферативная активность, особенно в комбинации с плоидностью опухоли, может дать больше прогностически значимой информации, чем только плоидность опухоли [155]. Кроме того, по данным Р. Hupperts и соавт. [21], комбинация количества клеток в S-фазе клеточного цикла и процента анеуплоидных клеток в опухоли является важным фактором прогноза как для общей, так и для безрецидивной выживаемости у больных с I и II стадиями РМЖ. В то же время, по сведениям некоторых авторов, количество клеток в S-фазе клеточного цикла не имеет прогностического значения [6, 8, 64]. По другим данным, этот показатель имеет значение для безрецидивной выживаемости, но не влияет на общую выживаемость [62, 125]. По данным Page DL и соавт. [113], количество клеток в S-фазе клеточного цикла имеет прогностическое значение для безрецидивной выживаемости только при отсутствии поражения регионарных лимфатических узлов или при поражении 1—3 лимфатических узлов.

Оценка количества клеток в G2+M фазе показала, что при диплоидных опухолях число клеток в G2+M фазе равнялось 15% и 18%, а при анеуплоидных опухолях распределение составляло: среднее значение -9,4±4,5, медиана — 8%. Минимальное значение — 3%, максимальное — 29%.

Число клеток в 02+М фазе значимо влияет на общую (р<0,02) и безрецидивную (р=0,004) выживаемость. При числе клеток в С2+М фазе более 8% общая и безрецидивная выживаемость значимо снижается. Её значения составляют — 3-летняя общая выживаемость — 69,2±9,1% и 5-летняя общая выживаемость — 61,5±9,5%.

В зависимости от индекса пролиферации больные были распределены следующим образом: при диплоидных опухолях индекс пролиферации равнялся 27% и 28%- при анеуплоидных опухолях: менее 18% - 23 (39,7%), от 18% до 25% - 22 (37,9%) и более 25% - 13 (22,4%). Среднее значение -21,2±8,9%, медиана — 20%. Минимальное значение — 8%, максимально значение — 56%. Индекс пролиферации значимо влияет на общую (р=0,02) и безрецидивную (р<0,001) выживаемость. Так, при индексе пролиферации более 20% общая и безрецидивная выживаемость значимо снижается, при этом 5-летняя общая выживаемость составляет 59,2±8,7% и 5-летняя безрецидивная выживаемость — 40,4±8,7%.

Таким образом, полученные данные показывают, что основные показатели, определяемые при помощи лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии, могут быть использованы в качестве дополнительных прогностических критериев индивидуально у каждой больной раком молочной железы.

Одним из основных компонентов в регуляции апоптозапрограммируемой гибели клеток является ген — супрессор роста опухоли р53. Однако в результате приобретенных мутаций, продуцируемая уже мутантная форма белка р53, которая не может выполнять положенных для нее функций и процесс размножения опухолевых клеток приобретает хаотичный, неуправляемый характер.

Определение экспрессии мутантной формы белка р53 было выполнено у 60 больных раком молочной железы, из них у 30 (50%) больных была отмечена положительная иммуноцитохимическая реакция.

Из 30 пациенток с уровнем экспрессии (+) было — 19 (63,3%) больных, с уровнем экспрессии (++) — 6 (20%) больных, с уровнем экспрессии (+++) — 5 (16,7%) больных.

В зависимости от стадии уровень экспрессии р53-тШвозрастал, так при I стадии уровень эксрессии (+) составил 5(50%), при II- 3(30%), при III-2(20%), а при Па стадии уровень эксрессии (+) составил 14 (70%), с уровнем экспрессии (++) — 3 (15%), с уровнем экспрессии (+++)-3 (15%). Стоит отметить, что если полученное значения по умеренному (++) и высокому (+++) уровню при обоих стадиях фактически совпадают, то доля низкого (+) уровня экспрессии при стадии Па оказалась несколько выше — 14 (41,2%), а отсутствие экспрессии больше при I стадии — 16 (61,5%).

Выявлена корреляция между экспрессией р53-тШи гистологической структурой, так только при ИПР встречается средний и высокий уровень экспрессии р53-ши1 (++/+++) — 11 (37,9%). Для других же гистотипов наиболее характерно отсутствие экспрессии исследуемого маркёра: ИДР (-) -16 (84,2%) и редкие формы — (-) — 7 (58,3%).

Выявлена так же корреляция между степенью злокачественности и экспрессией р53-ти1:. При отрицательной экспрессии наиболее характерна I степень злокачественности — 10 (76,9%), а для умеренного и высокого уровня экспрессии — III степень 8 (36,4%), тогда как I степень при этом не встречается вообще.

Экспрессия р53-тШкоррелирует с количественными параметрами клеток опухолей молочных желез, определяемых при помощи метода лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии. Доля опухолей экспрессирующих р53-тШпри количестве анеугаюидных клеток выше 61% составляла — 12 (63,2%), против — 7 (36,2%) без экспрессии.

При низком уровне р53-ти! индекс ДНК — 1,3±0,43 значимо ниже (р=0,036), чем при отсутствии экспрессии — 1,54±0,24 и при среднем/высоком уровне экспрессии — 1,51±0,33 (р=0,145). При этом индекс ДНК при отсутствии экспрессии и при среднем/высоком ее уровне значимо не различается (р=0,965).

При числе клеток в фазе СО/1 менее 80% положительная экспрессия р53-тЩ встречается значимо чаще — 20 (64,5%) (р=0,038). Из чего следует предположить наличие отрицательной корреляционной связи между числом клеток в СО/1 фазе и уровнем экспрессии р53, которая подтверждается при проведении корреляционного анализа (гб=-0,372, р=0,003), где гб-коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

При числе клеток в Б фазе более 15% положительная экспрессия р53-тШвстречается значимо чаще — 12 (70,6%) (р=0,045). Следует предположить наличие корреляционной связи между числом клеток в Б-фазе и уровнем экспрессии р53-тЩ, которая подтверждается при проведении корреляционного анализа (гб=0,3, р=0,02).

При числе клеток в 02+М фазе от 9% и выше положительная экспрессия р53 встречается значимо чаще — 18 (69,2%) (р=0,009). Так же следует предположить наличие корреляционной связи между числом клеток в С2+М фазе и уровнем экспрессии р53-ти1, которая подтверждается при проведении корреляционного анализа (р=0,343, р=0,007).

При индексе пролиферации более 20% положительная экспрессия р53-тШвстречается значимо чаще — 21 (65,6%) (р=0,01), что свидетельствует о наличие связи между индексом пролиферации и уровнем экспрессии р53-ти1-, которая подтверждается при проведении корреляционного анализа (^=0,374, р=0,003).

Из проведенного анализа следует, что экспрессия р53 мутантного типа в опухолях больных раком молочной железы является неблагоприятным фактором прогноза и значительно ухудшают отдаленные результаты.

Результаты проведенного нами исследования по оценке особенностей данных ДНКпроточной цитофлуорометрии и уровня мутантного р53 при различных гистогенетических подтипах следующие: до 66,7% случаев РМЖ люминального, А подтипа содержат от 8 до 14% клеток в Б-фазе- 58,3%.

153 опухолей в С2/М фазе содержат до 8% клетока 62,5% случаев в фазе СО/1 более 80% клеток, также для этого подтипа характерен индекс ДНК более 1,6% для 45,8% случаев, а от 1,1% для 83,3%. Для тройного негативного подтипа РМЖ в Бфазе клеточного цикла характерно >15% клеток у 43,8% наблюдений- 62,5% опухолевых клеток в в2/М фазе содержат до 8% клеток и индекс ДНК от 1,1% и выше наблюдается у 93% опухолей.

При люминальном, А подтипе до 62,5% опухолей имеет отрицательную экспрессию мутантного р53, а для тройного негативного подтипа, напротив, до 56,2% свойственен положительный р53-ши1.

По результатам многофакторного анализа выявлено, что наибольший вклад в прогноз течения заболевания привносит гистологическая структура опухоли и индивидуальные генные характеристики наиболее агрессивного пула клеток опухоли: индекс пролиферации и число клеток в активных фазах цикла — СО/1 и Б фазе. Это и является причинной низкой выживаемости больных ранними формами РМЖ.

Исследование мутантного р53 в зависимости от гистогенетического типа рака молочной железы позволяет дополнить прогностическую характеристику рака молочной железы в каждом конкретном случае и большей долей достоверности выработать оптимальную лечебную тактику.

Наука не стоит на месте, с развитием новых клинических исследований в области онкологии и развития рака молочной железы, появляются новые данные, которые говорят о том, что механизм возникновения, роста и прогрессировать злокачественных новообразований достаточно сложный процесс. Наша работа дает почву к продолжению исследования и данный труд не является конечным результатом в решении проблемы диагностики и лечения рака молочной железы, но вносит существенный вклад в развитие дальнейших исследований.