Электрофорез белков в полиакриламидном геле

Электрофорез белков в полиакриламидном геле — метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью, детерминированной длиной полипептидной цепочки, молекулярной массой, укладкой белковой молекулы, посттрансляционными модификациями и другими факторами. Данный способ фракционирования белков и пептидов широко применяют в современной молекулярной биологии, биохимии, генетике.

Разработано большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле для решения разных задач и для различных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) по Лэммли (Laemmli, 1970).

• 1. 30% раствор акриламида (акриламид: бис-акриламид = 74,1: 1) (объем 100 мл)
• · 29,6 г акриламида;
• · 0,4 г бис-акриламида;
• · растворить в 100 мл б/д воды;
• · профильтровать; хранить в тёмном месте.
• 2. Буфер А: 1,5 М трис-HCl-буфер, рH =8,8 (объем 200 мл)
• · 36,312 г трис на 200 мл б/д воды
• 3. Буфер В: 0,5 М Трис-НCl-буфер, pH= 6,8 (объем 200 мл)
• · 12,114 г трис на 200 мл б/д воды
• · рН довести концентрированной HCl до нужного рН
• 4. 50% SLB-буфер:
  • · 20% глицерин, берём для приготовления 25 мл глицерина
  • · 25 мл 0,1 М Трис-HCl, рН=6,8
  • · 10 мМ ЭДТА, навеска 0,47 г
  • · 10 мМ 2-меркаптоэтанола, берём для приготовления 100 мкл
  • · 0,02% бромфенолового синего, навеска 0,03 г
• 5. Буфер для электрофореза (5-кратный), рН = 8. Не требует подведения рН (объем 1 л):
  • · 125 мМ Трис, навеска 15,14 г
  • · 626 мМ глицерина, навеска 46,92 г
  • · 5 мМ ЭДТА, навеска 1,86 г.
  • · Непосредственно перед использованием разбавить до однократного, добавить 10 мМ 2-МЭ (или 1 мМ ДТТ), для этого к 200 мл 5х-буфера прилить 800 мл б/д воды и добавить 0,8 мл 2-МЭ
• 6. Фиксаж:
  • · 45% этанол
  • · 45% вода
  • · 10% уксусная кислота
• 7. Окраска:
  • · 0,5% кумасси
  • · 10% уксусная кислота
  • · 40% этанол
  • · 50% вода
• 8. Отмывка:
  • · 10% уксусная кислота
• 9. Лизирующий буфер (для гомогенизации) (объём 200 мл)
• · 50 мМ HEPES, навеска 2,384 г, pH 7,6 (довести конц. щёлочью)
• · 150 мМ хлорид натрия, навеска 1,77 г
• · 10% глицерин, объём 20 мл
• · 0,1% Тритон Х-100, объём 0,2 мл
• · 5 мМ ЭДТА, навеска 0,3724 г.
• · 10 мМ ДТТ, навеска 0,308 г.