Технология экстракорпорального оплодотворения

Технологию ЭКО осуществляют в специализированных медицинских учреждениях в условиях амбулаторного лечения. Для проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения необходимо получить яйцеклетки, получить сперматозоиды, провести оплодотворение in vitro, вырастить эмбрион, ввести эмбрион в полость матки женщины.

Этапы лечения стандартным методом ЭКО [3]:

• 1) Диагностика причины бесплодия и отбор супружеских пар.
• 2) Стимуляция суперовуляции
• 3) Мониторинг роста и развития фолликулов (УЗ и гормональный).
• 4) Трансвагинальная пункция фолликулов под контролем УЗИ и получение преовуляторных ооцитов
• 5) Получение спермы и подготовка ее к инсеминации «in vitro».
• 6) Инсеминация ооцитов «in vitro», культивирование половых клеток, установление факта оплодотворения ооцитов и дробления эмбрионов.
• 7) Перенос эмбрионов в область дна матки матери.
• 8) Поддержка лютеиновой фазы лечебного менструального цикла.
• 9) Диагностика беременности, ее ведение и родоразрешение.

В программах, включающих ИКСИ, инсеменацию ооцитов (этап 6) осуществляют с помощью микроманипуляционной техники.

Рассмотрим подробнее некоторые основные этапы.

Как правило, для экстракорпорального оплодотворения стараются получить несколько яйцеклеток, так как это повышает эффективность лечения бесплодия этим методом. Поскольку в норме у женщины в течение одного менструального цикла созревает одна яйцеклетка, то для получения нескольких яйцеклеток проводят так называемую процедуру «стимуляции суперовуляции». Для этого пациентке назначают инъекции гормональных препаратов.

Для стимуляции используют инъекции препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина (ХГ), а также блокаторов гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ). Сочетание видов и количества вводимых гормональных препаратов называют «схемой стимуляции». Существует несколько схем стимуляции суперовуляции, но окончательное количество, типы и длительность введения препаратов подбирают индивидуально для каждой женщины. В зависимости от схемы стимуляция суперовуляции занимает время от 7 до 50 дней и требует подкожного введения препаратов (ежедневные инъекции, либо введение подкожных капсул).

Кломифена цитрат назначают с 5-го дня менструального цикла в течение 5 дней в дозе 50 мг/сут. Не рекомендуется применять при низкой эстрогенной насыщенности, избытке массы тела, гипертензии, гиперволемии, отечности.

Тамоксифен (зитазониум) наиболее показан при бесплодии с НЛФ. Препарат назначают в дозе 10 мг/сут в течение 5 дней. При отсутствии положительного результата дозу увеличивают до 20−40 мг/сут.

Хориогонин является препаратом выбора при исходно низком уровне эстрогенов и НЛФ. С этой целью хориогонин вводят внутримышечно на 5,7,9-й дни цикла по 750 ЕД, на 11,13,15-й дни цикла — по 1500 ЕД, на 17,19,21-й дни — по 750 ЕД.

Сигетин показан оперированным женщинам с болезнью поликистозных яичников с целью реабилитации менструальной и репродуктивной функции. Препарат используют в дозе 100 мг/сут с 5-го по 9-й день цикла.

Хумегон (прегнил) — вводят по 2 ампулы, начиная с 3-го дня цикла, с определением эстрадиола крови, цервикального цикла, УЗИ. При достижении фолликулом диаметра 18 мм и более вводят ХГ.

Люлиберин назначают однократно в/в в дозе 100 мг накануне предполагаемой овуляции.

Человеческий менопаузальный гонадотропин вводят в/м с 6-го по 10 день (6,8,10-й дни) — по 150 ЕД — для индукции и дополнительного роста нескольких фоликулов. С 3-го по 7-й день включительно возможна доза по 2 ампулы через день.

Парлодел — для индукции овуляции при нормопролактинемии используют по схеме: 1,25 мг (½ табл.) 2 раза в день в течение первой недели, со второй недели — по 2,5 мг (1 табл.) 2 раза в день, сохраняя дозировку в дальнейшем. На 21 день от начала лечения оценивают содержание эстрогенов, прогестерона в крови и по ТФД. При отсутствии овуляции дозу увеличивают до 2 раза в день, а в дальнейшем — ступенчато, используя эмпирический подход до тех пор, пока не наступит овуляция и беременность (но не более 40 мг/сут).

Сочетанные методы:

пергонал по 75−150 ЕД со 2-го дня цикла ежедневно до достижения доминантным фолликулом указанных размеров 16−18 мм. Через 24−48 часов после достижения фолликулом указанных размеров вводят внутримышечно 5000−10 000 ЕД хорионического гонадотропина. Применение данной схемы стимуляции суперовуляции приводит к образованию до 20 фолликулов. В течение всего этого времени женщина находится под постоянным динамическим контролем; проводят ежедневное ультразвуковое исследование с измерением диаметра фолликулов, определение эстрадиола и лютенизирующего гормона в крови;

кломифена цитрат — по 50−100 мг/сут. с 3-го или 5-го дня цикла в течение 5 дн. в зависимости от длительности менструального цикла. При достижении размеров доминантного фолликула диаметром 17−18 мм в/м вводят 10 000 ЕД хориогонина в 22.00. Через 35−36 ч производят аспирацию ооцитов (ультразвуковая пункция, лапароскопия);

кломифена цитрат — по 100 мг/сут. с 3-го по 7-й день и по 3 ампулы хумегона на 6, 8, 10 дни цикла. При возникновении доминантного фолликула диаметром 18 мм и более и уровне эстрадиола (Е₂₎ 300 400 пг/мл на один растущий фолликул вводят в/м 1000 ЕД ХГ. Сочетанные методы обладают большей эффективностью из-за потенцирования действия друг другом.

Для стимуляции роста фолликулов чаще всего используют кломифен, менопаузный гонадотропин человека, хориогонадотропин, Фолликулостимулирующий гормон, а также их различные сочетания.

Созревание яйцеклеток непосредственно не может быть определено неинвазивными методами. Поэтому о созревании яйцеклеток судят косвенно по росту фолликулов яичника. Рост фолликулов наблюдают с помощью аппаратов ультразвукового исследования. При достижении доминантным фолликулом определенного размера (16−20 мм) назначают процедуру извлечения яйцеклеток — пункцию фолликулов яичника. Пункцию фолликулов проводят под общей (чаще) или местной (реже) анестезией, иглу проводят трансвагинально, ход иглы контролируют аппаратом УЗИ. Целью пункции является аспирация (отсасывание) содержимого фолликула (фолликулярной жидкости). Полученную жидкость исследуют с помощью микроскопа для обнаружения яйцеклеток.

Обнаруженные яйцеклетки отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в лабораторную посуду с культуральной средой. В качестве лабораторной посуды используют чашки Петри, либо культуральные планшеты. Посуду с яйцеклетками помещают в инкубаторы, где они содержатся до оплодотворения.

Обычно использование гормональных препаратов и проведение пункции фолликулов не вызывает негативных реакций у пациентки, но иногда могут возникнуть осложнения. Осложнением стимуляции суперовуляции является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), который может развиться спустя несколько дней после окончания стимуляции. СГЯ возникает при созревании большого количества фолликулов, которые, трансформируясь в желтые тела, секретируют большое количество эстрогенов. При тяжелом течении СГЯ может потребоваться госпитализация больной. Осложнением пункции фолликулов может явиться гематома яичника.

При невозможности получить яйцеклетки у пациентки (отсутствие яичников, менопауза и пр.) возможно использование донорских яйцеклеток (то есть яйцеклеток другой женщины). В качестве донора яйцеклеток может выступать бескорыстный донор (родственница, знакомая) или платный донор. Условия работы с донором яйцеклеток регламентирует приказ N67 Минздрава РФ.

Затем идет следующий этап — получение спермы. Сперму пациент получает самостоятельно с помощью мастурбации. Возможно использование прерванного коитуса, либо медицинского презерватива без смазки. В случае невозможности получения спермы путем эякуляции, используют хирургические методы: аспирация содержимого эпидидимиса, биопсия яичка и пр. Сперму получают в день пункции фолликулов супруги. Если получение спермы в день пункции невозможно, то используют предварительное получение спермы с последующим замораживанием и хранением в жидком азоте (криоконсервация). Перед оплодотворением яйцеклетки сперматозоиды отделяют от семенной жидкости. Для этого проводят многократное центрифугирование спермы в культуральной среде.

При невозможности использования спермы мужа (по медицинским показаниям) или при отсутствии у пациентки полового партнера, возможно использование спермы донора. Использование спермы донора производится при обязательном письменном согласии супруга и регламентируется приказом N67 Минздрава РФ. Согласно этому приказу сперма донора используется не ранее, чем через 6 месяцев хранения в замороженном состоянии с целью получения в этот период данных об отсутствии инфекционных заболеваний у донора спермы.

6 этап — оплодотворение in vitro.Непосредственно ЭКО проводится врачами-эмбриологами в условиях эмбриологической лаборатории. Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов: 1) инсеминация in vitro; 2) интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ICSI, ИКСИ). При первом, более простом способе к яйцеклеткам, которые находятся в питательной среде, добавляют суспензию сперматозоидов. Сперматозоиды добавляют из расчета 100−200 тыс. на одну яйцеклетку. В течение 2−3 часов один из сперматозоидов проникает в яйцеклетку и тем самым оплодотворяет ее. При втором способе (ИКСИ) сперматозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургических инструментов. ИКСИ используют при очень плохом качестве спермы, когда оплодотворение не может быть получено даже в чашке.

После проникновения сперматозоида яйцеклетка считается эмбрионом. Вероятность успешного оплодотворения 60−70%. Эмбрионы содержат в искусственных условиях от 2 до 5 дней. Для этого используют так называемые СО₂-инкубаторы — шкафы, в которых поддерживается температура 37 °C и содержание СО₂ в атмосфере 5−6%. Эмбрионы (а до этого яйцеклетки) в инкубаторах непосредственно содержат в пластиковых чашках (чашки Петри, чашки Нунка, планшеты и пр.) с культуральной средой. В культуральную среду для эмбрионов входят основные физиологические ионы (Na+, K+, Ca++, Mg++, Cl-, CO₃— и т. д.), энергетические субстраты (глюкоза, пируват, лактат), аминокислоты, часто витамины и белки сыворотки крови. За время инкубации эмбрион человека практически не увеличивается в размере (первые 4 дня его размер 0,1 мм, на 5 день 0,15−0,2 мм), но количество клеток, его составляющих, возрастает многократно (1 день — 1 клетка; 2 день — 4 клетки; 3 день — 8 клеток; 4 день — от 10 до 20 клеток, 5 день — от 40 до 200 клеток).

7 этап — Перенос эмбриона в матку осуществляют через 2−5 дней после оплодотворения яйцеклетки. Процедура не требует анестезии (обезболивания) и выполняется на гинекологическом кресле в течение нескольких минут. Эмбрион переносят в матку, проводя через шейку матки специальный эластичный катетер. Согласно приказу N 67 Минздрава РФ в полость матки не рекомендуется переносить более 4 эмбрионов, чтобы избежать многоплодной беременности^[3]. Современная практика ЭКО в России такова, что обычно осуществляют перенос 2 эмбрионов.

При невозможности вынашивания плода пациентка может прибегнуть к использованию суррогатной матери.8 этап — поддержка лютеиновой фазы. После переноса эмбрионов на 2 недели назначаются препараты прогестерона уменьшающие вероятность спонтанных абортов. Через 2 недели женщина сдает кровь для подтверждения или исключения беременности. В зависимости от результата исследования определяется дальнейшая тактика ведения пациентки.

В течение культивирования эмбрионов возможно осуществление дополнительных лабораторных мероприятий. Криоконсервация эмбрионов — жизнеспособные эмбрионы замораживают и хранят при температуре жидкого азота. В дальнейшем эмбрионы могут быть разморожены и осуществлен повторный перенос в матку для достижения беременности Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — исследование наличия некоторых хромосомных или некоторых генетических патологий у эмбриона до имплантации. Также этим методом возможно определить пол эмбриона.

9 этап — ведение беременности и роды. Эффективность экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в целом составляет порядка 30−35%. Значение может изменяться в зависимости от возраста, причин бесплодия, квалификации врачей и уровня клиники (в связи с тем, что материально-техническое оснащение имеет немаловажное значение). Из 20 наступивших беременностей родами заканчиваются в среднем 18. После введения эмбрионов один раз в 3 дня нужно контролировать уровень гормонов в крови. Через 12 дней выполняется тест на беременность. В случае многоплодной беременности по желанию женщины выполняют редукцию — удаление ненужных эмбрионов.

Роды при беременности после ЭКО ничем не отличаются от обычных. В тех случаях, когда причина бесплодия — болезнь женщины, роды проводятся с учётом конкретной болезни и к способу оплодотворения это уже не имеет никакого отношения.

По мнению врачей, зачатые в пробирке дети ничем не отличаются от остальных. Тем не менее есть мнение, что такие дети лучше учатся, но чаще болеют. Врачи считают, что это может быть связано с чрезмерной опекой желанного ребёнка.

План обследования во время беременности, возникшей в результате ЭКО, несколько шире, чем при физиологически возникшей беременности:

анализ крови на сифилис, ВИЧ-инфекцию, гепатиты В, С;

клинический анализ крови;

биохимический анализ крови;

общий анализ мочи;

исследование системы гемостаза, включая маркёры активации внутрисосудистого тромбогенеза;

определение волчаночного антикоагулянта;

определение АТ к ХГЧ;

уровень ХГЧ в динамике;

анализ влагалищного отделяемого с окраской по Граму;

бактериологическое исследование материала из канала шейки матки;

выявление вируса простого герпеса (ВПГ), цитомегаловируса (ЦМВ), хламидий, гонококков, трихомонад в материале из канала шейки матки путём ПЦР;

УЗИ.

К особенностям течения беременности, возникшей в результате вспомогательных репродуктивных технологий, относят:

тенденцию к невынашиванию;

многоплодную беременность;

повышенный риск ВПР плода;

высокий инфекционный индекс.

Поэтому ведение беременности после ЭКО должно быть акцентировано на следующих направлениях:

преодоление невынашивания беременности;

своевременная редукция эмбрионов (при наличии трёх и более плодов), тщательное наблюдение и специфическая терапия нарушений, связанных с наличием двойни;

раннее выявление ВПР плода.

Кроме того, необходимы профилактические действия, выполняемые при физиологически наступившей беременности (ранняя профилактика плацентарной недостаточности, профилактика РДС плода и т. д.) в стандартных объёмах.

Невынашивание беременности В I триместре 25−30% беременностей после ЭКО заканчивается её прерыванием.

Причины угрозы прерывания можно разделить на три группы:

иммуногенетические:

G несовместимость по системе HLA (особенно II класса);

G «малые формы» хромосомных изменений у супругов вследствие их полиморфизма;

G антифосфолипидный синдром (АФС);

G циркуляция АТ к ХГЧ;

эндокринные;

инфекционновоспалительные.

Аутоиммунизация к ХГЧ обусловлена, с одной стороны, заболеванием, предшествовавшим ЭКО (чаще наружным генитальным эндометриозом), с другой стороны, назначением гонадотропинов в программе стимуляции суперовуляции и переноса эмбриона. Предполагается, что АТ к ХГЧ продуцируют клоном клеток CD19+5+. При повышении уровня этих клеток увеличивается содержание аутоантител к гормонам, имеющим важнейшее значение для нормального развития беременности: эстрадиола, прогестерона, ХГЧ. Действие АТ обусловливает медленный прирост ХГЧ, повреждение желточного мешка, появление субхориальных гематом, воспаление и некроз, нарушение образования фибриноида и избыточное отложение фибрина. Данные механизмы приводят к нарушению плацентации. Причиной угрозы прерывания беременности могут быть циркуляция антифосфолипидных АТ к фосфатидилсерину и фосфатидилхолину, играющих роль «клея» при формировании и адгезии синцитиотрофобласта и волчаночного антикоагулянта. АТ могут возникать под влиянием экзогенных (инфекционных) и эндогенных стимулов. Экзогенные стимулы, как правило, ведут к образованию транзиторных АТ, которые не вызывают тромбоэмболических осложнений.

Принципы терапии при беременности после экстракорпорального оплодотворения

При обнаружении причин невынашивания проводят этиотропную и патогенетическую терапию.

При несовместимости по HLA системе показано продолжение начатой в периоде предгестационной подготовки иммунотерапии отцовскими или донорскими лимфоцитами каждые 4 нед до 12−4 нед беременности. В качестве альтернативной терапии возможно применение высоких доз иммуноглобулина (иммуноглобулин человека нормальный по 50 мл трижды через день в/в капельно) через каждые 4 нед.

При выявлении аутоантител к ХГЧ проводят исследование системы гемостаза и назначают:

G глюкокортикоиды (преднизолон 5 мг, метилпреднизол 4−8 мг);

G антиагреганты при повышении агрегационной активности тромбоцитов (дипиридамол в дозе 75−150 мг в сутки, со II.

триместра беременности — ацетилсалициловая кислота по 500 мг через день или по 100 мг ежедневно в течение 14 дней);

G низкомолекулярные гепарины при вовлечении в патологический процесс плазменного звена (надропарин кальция по 0,3 мл, далтепарин кальция по 5000 МЕ или эноксапарин натрия по 0,4 мл подкожно).

· С целью воздействия на эндокринные причины невынашивания все беременные после ЭКО получают гормональную поддержку. Решение вопроса о назначении определённых доз гормонов и длительности терапии определяется исходным гормональным профилем женщины, особенностями модулированного фолликулогенеза, количеством фолликулов, количеством жёлтых тел. Рекомендуют применение: G препаратов натурального прогестерона (прогестерон в/м по 1−2 мл ежедневно или микронизированный прогестерон по 300−400 мг с постепенным снижением дозы при отсутствии признаков угрозы прерывания к 12−14 нед);

G аналогов (изомеров) прогестерона (дидрогестерон по 10−30 мг до 16 нед).

Вопрос о назначении эстрогенов должен решаться конкретно в каждом случае при наличии информированного согласия женщины, он показан при гипофункции яичников, донации яйцеклетки, замедленных темпах роста эндометрия, чистой формы дисгенезии гонад, внутриматочных синехиях. Их применение оправдано до 12−15 нед беременности.

Следует особо отметить, что усиление гормональной терапии при наличии кровянистых выделений патогенетически не оправдано, так как оказывает противоположный эффект (вследствие усугубления гемостазиологических нарушений).

Для снижения роли инфекционновоспалительных факторов невынашивания проводится профилактика реактивации вирусной и бактериальной инфекции, часто возникающих на фоне приёма глюкокортикоидов:

G инфузии иммуноглобулина человека нормального с целью стимуляции собственной продукции иммуноглобулиновтрижды через день в дозе 25 мл или по 50 мл 2 раза через день, повторно вводят в 24 нед беременности и перед родами;

G применение интерферона альфа2 в свечах по 1 млн ЕД в течение 10 дней, или интерферон человеческий рекомбинантный альфа 2+комплексный иммуноглобулиновый препарат сухой (по 2 свечи в сутки в течение 10 дней) с 12 нед беременности;

G антибактериальную терапию проводят только по строгим показаниям при выявлении инфекции с учётом чувствительности к антибиотикам; применяют амоксициклин+клавулановая кислота по 875 мг 3 раза в день 7 дней;

джозамицин по 3 таблетки в день 7−10 дней, спирамицин по 9 млн ЕД 2 раза в день 5 дней;

G восстановление нормальной микрофлоры кишечника и влагалища (дотация лактобактерий).

С целью дальнейшего лечения угрозы прерывания проводят токолитическую терапию, для чего назначают:

ингибиторы простангландинсинтетазы (индометацин с 14 до 32 нед беременности, в свечах по 50−100 мг, курсовая доза 1000 мг);

блокаторы кальциевых каналов (нифедипин по 10 мг 4 раза в сутки);

инфузии 25% раствора сульфата магния 20,0 в 5% растворе глюкозы 200,0−400,0);

селективные b2адреномиметики (фенотерол и гексопреналин) эффективны с 25 до 36 нед беременности в связи с появлением к ним рецепторов в миометрии; назначают сначала в виде инфузий по 0,5 мг (5 мл) после предварительного приёма блокаторов кальциевых каналов (верапамил по 40 мг), а затем переходят на пероральный приём по 5 мг 6 раз в день.

В сроках с 28−34 нед беременности необходима профилактика РДС плода (дексаметазон 4 мг по 1 мл внутримышечно 3 раза в день в течение двух дней, всего 24 мг). Рекомендуются инфузии фенотерола или гексопреналин в течение 2 дней для профилактики РДС плода при угрожающих преждевременных родах.

Многоплодие Многоплодная беременность достаточно часто осложняет течение беременности после ЭКО (25% наблюдений). С целью успешного завершения беременности при тройнях и четвёрнях производят редукцию эмбриона в 9−10 нед беременности. Оптимальным доступом является трансабдоминальный в связи с более низким риском возникновения инфекционных осложнений. В случаях возникновения кровянистых выделений после операции усиление гормональной терапии нецелесообразно, проводят гемостатическую терапию, а также профилактику плацентарной недостаточности и инфекционных осложнений (нередко при УЗИ обнаруживается хорионит).

Истмикоцервикальная недостаточность. ИЦН достаточно часто развивается во II триместре беременности. Причинами являются многоплодная беременность (чаще двойни, при тройнях коррекция ИЦН опасна), гиперандрогения надпочечникового генеза, анатомические особенности шейки матки. Для ИЦН при многоплодной беременности характерны развитие после 22 нед беременности и очень быстрое прогрессирование. В связи с этим во избежание пролабирования плодного пузыря показан еженедельный бимануальный (а не только ультразвуковой) контроль за состоянием шейки матки. Также с целью профилактики активации инфекции, которая может поддерживать повышенный тонус матки, показан регулярный инфекционный скрининг состояния генитального тракта. При наличии показаний проводят хирургическую коррекцию ИЦН.

Раннее выявление врождённых пороков.

Риск ВПР при беременности после ЭКО выше, чем в популяции и равен 2,0 (95% CI 1,3−3,2). В связи с этим необходима предимплантационная диагностика для исключения хромосомных нарушений и некоторых генных заболеваний.