Перенос Н+ через внутреннюю митохондриальную мембрану

По гипотезе Митчелла, при переносе электронов по электронтранспортной цепи ионы водорода Н⁺ переносятся поперек внутренней митохондриальной мембраны. Но как протоны переносятся через непроницаемую для них мембрану? Это возможно, если, например, на внутренней стороне мембраны некий акцептор протонов, А присоединяет H⁺ из водной среды, а на внешней — донор D высвобождает H⁺ в воду (Рис.2). Этот процесс эквивалентен переносу протонов.

Рисунок 2 — Одна из гипотез создания трансмембранного градиента протонов вследствие их поглощения неким акцептором на одной стороне и сопряженного высвобождения донором на другой стороне. За счет энергии электрохимического протонного градиента ATP-синтетаза синтезирует ATP из ADP и фосфата.

Точный механизм создания электрохимического градиента пока не выяснен. Но сейчас уже известно, что протоны переносятся через митохондриальную мембрану из матрикса в межмембранное пространство в процессе переноса электронов NADH-дегидрогеназой (комплекс I), комплексом цитохромов bc₁ (III) и цитохромоксидазой (комплекс IV). Изучение протонного транспорта затруднено коротким временем жизни промежуточных соединений, малой величиной конформационных изменений, сложностью строения электронпереносящих комплексов.

Более понятен и имеет существенные экспериментальные подтверждения механизм переноса протонов в комплексе III — так называемый Q-цикл с участием молекул убихинона CoQH₂ (Рис.3). Он связывает перенос двух электронов коферментом Q, одноэлектронный перенос в цитохромах и перенос протонов через внутреннюю мембрану митохондрии.

Этот процесс проходит в несколько этапов. Сначала молекула CoQH₂, расположенная вблизи от наружной стороны ВММ (она обозначена как QH₂ на рис. 3) переносит один электрон, полученный от комплекса I, через Fe-S центр на цитохром с₁ (потом он переносится на цитохром с и далее по цепи). Второй электрон последовательно переносится через низкои высокопотенциальные гемы цитохрома b (b_L и b_Н, соответственно) на молекулу CoQ, находящуюся вблизи внутренней стороны ВММ, переводя ее в анион-радикальную форму ^?Q^-. При этом первая молекула убихинона высвобождает 2Н⁺ в межмембранное пространство. На следующем этапе ^?Q^- восстанавливается на внутренней стороне ВММ протонами, потребляемыми из митохондриального матрикса. Но для этого нужен еще один электрон. Он доставляется через пару гемов b_L и b_Н еще одной молекулой убихинона CoQH₂, которая при этом высвобождает 2 протона в межмембранное пространство (рис.3). Таким образом, этот процесс эквивалентен транспорту двух протонов через ВММ и переносу двух электронов от CoQH₂ на 2 молекулы цитохрома с. Суммарная реакция этого процесса:

QH₂ + 2 цит. с₁ (окисл) + 2 H⁺ (внутр) > Q + 2 цит. с₁ (восст) + 4 H⁺ (наруж) В нем участвуют две молекулы CoQH₂ на наружной стороне ВММ и одна молекула CoQ на внутренней стороне ВММ. Еще одна молекула CoQ, образовавшаяся при окислении CoQH₂, должна мигрировать с наружной стороны ВММ на внутреннюю. Также должен пополняться запас CoQH₂ на наружной стороне ВММ. Реально убихинон, видимо, не мигрирует, но за счет изгиба длинного липидного хвоста, располагающегося внутри липидной фазы мембраны, хиноновая группа может перемещаться от наружной стороны ВММ к внутренней.

Предполагается, что подобные циклы существуют и в комплексах I и IV, но механизм переноса протонов в них менее ясен. В комплексе I в них участвуют Fe-S центры как переносчики электронов и молекулы FMN/FMNH₂ как переносчики атомов водорода. Такой механизм транспорта протонов называется флавиновым циклом или F-циклом (Рис.4).

По В. П. Скулачеву (1989), в NADH-дегидрогеназном комплексе ионы Н⁺ от расположенных в матриксе субстратов цикла Кребса (АН₂) переносятся на FMN. Предполагается, что FMN и FMNH₂ могут мигрировать в митохондриальной мембране. Образовавшийся FMNH₂ может смещаться вглубь мембраны в сторону внешней среды, где расположены FeS-центры: FeS_I1a и FeS_I3 (индекс I обозначает принадлежность к комплексу I). Здесь FMNH₂ передает электроны на FeS_I1a или FeS_I3, а два протона в каждом случае уходят в межмембранное пространство. Окисленный FMN возвращается в сторону матрикса и восстанавливается электронами от FeS_I1b и протонами, выделяющимися в матрикс от NADH-дегидрогеназы:

FMN + 2e^- + 2H⁺ FMNH₂ ,.

Электроны, перешедшие от FMNH₂ на FeS_I 3, далее переходят на FeS_I 4, FeS_I 2 и поступают в Q-цикл, где вместе с еще двумя протонами Н⁺ из матрикса восстанавливают кофермент Q. Таким образом, в F-цикле при использовании одной молекулы субстрата через мембрану переносится 4Н⁺.

Возможно, в цитохромоксидазном комплексе IV перенос протонов происходит по механизму, называемому O-циклом. При переносе 4 электронов е^- на молекулу кислорода О₂ в комплексе IV синтезируются две молекулы воды. Но при этом из митохондриального матрикса поглощаются не четыре протона Н⁺, а восемь, четыре из которых переносятся через мембрану. То есть перенос пары электронов по ЦЭТ сопровождается переносом двух протонов через ВММ в наружную среду. При этом подвижными переносчиками могут служить кислород O₂ и перекись водорода Н₂О₂ (Рис.4). Молекулярные детали процесса переноса протонов в комплексе IV, пока неизвестны.

Н⁺-АТР-синтаза Долгое время было большой загадкой, как в митохондриях синтезируется АТР, и только в последнее десятилетие стали понятны принципы и механизмы этого процессы. Основная проблема при синтезе ATP^4- состоит в преодоления сильного электростатического отталкивания ADP^3- и P_i^2- при сближении. Эта проблема изящно решается ферментом Н⁺-АТР-синтетазой (его часто называют Н⁺-АТР-синтазой). Она действует за счет протонного тока, текущего по специальному протонному каналу, а протон-движущей силой служит градиент концентрации Н⁺ по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны. Действие этого тока передается в место синтеза ATP, на расстояние в несколько нм с помощью подвижной субъединицы Н⁺-АТР-синтазы.

Н⁺-АТР-синтазу впервые «увидели» Э. Рэкер с коллегами в начале 1960;х годов с помощью электронного микроскопа. Она состоит из двух функциональных доменов: F₀, встроенного во внутреннюю мембрану митохондрий, и F_1, выступающего из мембраны в митохондриальный матрикс. Их вместе часто называют ферментом F₀F₁ или комплексом V (Рис.5). Домен F₁ можно механически удалить из мембраны путем сильного перемешивания суспензии или обработки митохондрий ультразвуком. При этом он не синтезирует ATP, но сохраняет ATPазную активность. Мембранные пузырьки из внутренней митохондриальной мембраны со встроенными F₀, но лишенные F₁, могут переносить электроны от NADH к О₂ (т.к. в них сохранились встроенные электронпереносящие комплексы) и обладают сильной протонной проводимостью. Но они также не могут синтезировать ATP. То есть для синтеза ATP необходима совместная работа F₀ и F₁.

Выступающий из мембраны домен F₁ с молекулярной массой 371 кДа состоит из 9 субъединиц: 3, 3, 1, 1 и 1. (Рис.6). Рентгеноструктурный анализ, проведенный Дж. Уолкером с коллегами, показал, что фактор F₁ можно представить в виде приплюснутой сферы, высотой около 8 нм и диаметром 10 нм. В ней, как апельсиновые дольки, чередуются и субъединицы (Рис.6−8). Они образуют бв-пары, в которых субъединицы могут связывать нуклеотиды (ADP или ATP) вблизи места их контакта с субъединицами б (Рис. 7,б; 8, а) и находиться в одной из трех конформаций: «пустой», связанной с ADP и фосфатом (-ADP) или связанной с ATP (-ATP) (Рис.8). Предполагается, что субъединицы участвуют в каталитическом акте. Субъединица г представляет собой длинный изогнутый стержень из двух б-спиралей, проходящий по оси эллипсоида б₃в₃ (Рис.6; 7). Его нижний конец выступает на 3 нм из б₃в₃ и погружается внутрь домена F0 (Рис.6). Центральная часть субъединицы г гидрофобна и не содержит заряженных аминокислотных остатков, которые могли бы создавать трение при ее вращении.

Домен F₀ с молекулярной массой около 120 кДа состоит из субъединиц 3 типов: 1a, 2 b и 10−12 c, встроенных в мембрану и формирующих протонный канал. Субъединицы с — небольшие трансмембранные белки (8000 Да), состоящие из двух гидрофобных б-спиралей, дважды пересекающих мембрану. Внутри мембраны они образуют два коаксиальных цилиндра с наружным диаметром 5,5 нм. В их центре помещается субъединица г домена F₁ (Рис. 6; 9, б). Субъединица а состоит из шести трансмембранныхспиральных участков. Предполагается, что она образует входной и выходной каналы для протонов, которые перемещаются по кругу в цилиндре из субъединиц с. Субъединица b пересекает мембрану один раз. Две такие субъединицы вместе с д-субъединицы домена F₁ удерживают комплекс б₃в₃ над внутренней митохондриальной мембраной (Рис.6).

Рисунок 8 — H⁺-ATP-синтаза, вид сверху. (a). Показаны 3 разных состояния субъединиц и: незаполненное или пустое (-empty иempty); со связанным ADP (-ADP иADP) и со связанным ATP (-ATP иATP). (б). Показаны переходы между этими состояниями, при которых высвобождение вновь синтезированного АТР из фермента F₁ сопряжено с перемещением ионов водорода из межмембранного пространства в матрикс (по Nelson, Cox, 2005).

фосфорилирование электрон электрохимический Как работает эта конструкция? Как осуществляется энергетическое сопряжение протонного транспорта и синтеза ATP? Для преодоления электростатического отталкивания и сближения ADP^3- и P_i^2- в активном центре фермента должно создаваться «нулевое поле» с таким распределением зарядов, которое нейтрализует их отрицательные заряды и способствует переносу фосфата с образованием ATP. Тут возможны две ситуации:

• 1) Изначально в активном центре субъединицы в, находящейся в «пустой» конформации, нет никаких особых электрических полей. Для того, чтобы поместить туда ADP^3- и P_i^2-, в эту область нужно привлечь дополнительные положительные заряды, на что нужно потратить энергию. Они втянут отрицательно заряженные молекулы ADP^3- и Pi2- в активный центр, позволят их сблизить и образовать ATP^4-.
• 2) В активном центре субъединицы в изначально, в «пустой» конформации имеются положительные заряды, которые втягивают отрицательно заряженные ADP^3- и P_i^2- и нейтрализуют их заряды. Это позволяет им сблизиться и образовать ATP^4-. При этом не требуется энергии для входа этих субстратов в активный центр, но возникает проблема высвобождения образовавшейся молекулы ATP^4-. Чтобы освободиться от нее, фермент должен затратить энергию, позволяющую преодолеть электростатическое притяжение к положительным зарядам белка. Это можно сделать с помощью внешних ионов, замещающих на время заряды белка или ATP^4- в активном центре.

Рисунок 9 — Домен F₀ H⁺-ATP-синтазы. (а) Вид сбоку, показаны 12 трансмембранныхспиралей; (б) вид снизу, со стороны межмембранного пространства, видно положение субъединицы и два коаксиальных кольца из торцов субъединиц с (по Nelson, Cox, 2005)

Эксперименты показали, что справедливо второе предположение: энергия нужна не для синтеза ATP^4-, а для ее высвобождения. Было показано, что изолированные домены F1 обратимо катализируют реакцию:

ADP + P_i — ATP + H₂O.

В присутствии ATP и воды, меченой изотопом кислорода ¹⁸О, происходит гидролиз ATP, и ¹⁸О включается в неорганический фосфат. Тщательные измерения изотопного состава фосфата показали, что за несколько минут в него включается не один, а три или четыре атома ¹⁸О:

Следовательно, за несколько минут F₁ может несколько раз отщеплять и присоединять последнюю фосфатная группу в молекуле ATP, каждый раз присоединяя к ней ¹⁸О из молекулы воды. Этот же процесс происходит и в неэнергезированном комплексе F₀F₁ в отсутствие протонного градиента. То есть, реакция синтеза или гидролиза ATP практически не требует свободной энергии. Мембранный потенциал митохондрий или движение протонов Н⁺ необходимы для такого перераспределения электрического поля в активном центре, чтобы способствовать высвобождению ATP^4-, ранее прочно удерживаемому ферментом. Измерения констант связывания ATP и ADP ферментом F₀F₁ показали, что его сродство к ATP (K_d? 10^-12 M) на 7 порядков выше, чем к ADP (K_d? 10^-5 M). Это различие соответствует разнице свободных энергий связывания около 10 ккал/моль.

Когда была расшифрована пространственная структура F₁, то оказалось, что в его активном центре молекулу ATP действительно окружают положительно заряженные аминокислотные остатки Lys¹⁵⁵⁺, Arg¹⁸²⁺ и Arg³⁷⁶⁺. Кроме того, в создании «нулевого поля» и связывании ATP^4- участвуют Glu^181- и ион Mg²⁺ (Рис.10).

В отсутствие протонного градиента ATP так и остается связанным с F₁. Но когда есть градиент, протоны движутся через F₀ по каналу, сформированному субъединицами а и с, и индуцируют высвобождение ATP. Но каким образом движение протонов по каналу в домене F₀ может повлиять на перераспределение зарядов в весьма удаленной субъединице домена F₁ влекущее за собой высвобождение ATP? Как передается туда энергия протонного градиента?

Идею вращательного принципа работы Н⁺-АТР-синтазы впервые выдвинул П. Бойер. Суть предложенного им механизма состоит в том, что передаточным звеном между движением протонов по каналу в F₀ и конформационными превращениями субъединицы в в F₁ может служить вращение центральной субъединицы г. Согласно этой модели, процесс синтеза АTР можно разделить на следующие этапы (Рис. 11):

• 1) Пустая в субъединица связывает АDР и P_i и переходит в конформацию в-АDР.
• 2) Затем быстро происходит сближение АDР и P_i и образование АТР. При этом субъединица в переходит в состояние в-АTР.
• 3) Под влиянием переноса протонов по круговому протонному каналу в домене F₀ (Рис. 9,а) происходит поворот субъединицы г на 120^о. Круговое движение фрагмента субъединицы, находящегося внутри комплекса ₃₃, влияет на активный центр субъединицы в и способствует отсоединению АTР от нее.
• 4) Отсоединение АTР и возвращение в к «пустой» конформации.

Эти предположения подтвердились при исследованиях молекулярной структуры F₀F₁. На рис. 12 показано, как меняется структура комплекса при вращении субъединицы. Более детальное рассмотрение показывает, что в субъединице можно выделить два структурных домена, верхний и нижний, которые смещаются относительно друг друга при вращениисубъединицы. Это вызывает структурные изменения в «переключающих участках» S₁ и S₂, контролирующих связывание и высвобождение нуклеотидов и фосфата, соответственно (Рис. 13).

Поскольку в состав F1 входит 3 субъединицы в и 3 субъединицы б и все они находятся в разных состояниях, то за полный оборот субъединицы г синтезируется 3 молекулы АТР. Есть предположение, что субъединица б, в отличие от субъединицы в, которая связывает нуклеотиды и фосфат, играет вместе с субъединицей г каталитическую роль. Действительно, в связывании АDР участвует Arg³⁷⁶ субъединицы б (Рис.10). Но ее роль в производстве АТР.

пока неясна. Также неясны строение и функции субъединиц д и е, которые плохо разрешаются на рентгенограммах. Предполагается, что д связывает комплекс б₃в₃ с двумя субъединицами b, помогая тем самым закрепить F₁ над мембраной, а субъединица е — или участвует во вращении вместе с субъединицей г, или располагается между F₀ и F₁ и регулирует вращение субъединицы г.

Решающим шагов в понимании принципа работы Н⁺-АТР-синтазы стало применение методов манипуляции с единичными молекулами. Японским ученым под руководством К. Киношита удалось прочно иммобилизовать фермент F₁ на покровном стекле микроскопа (Рис. 14,а). К субъединице г они с помощью белка авидина ковалентно присоединили длинную (до 1.5 мкм) актиновую нить, меченую ярко флуоресцирующим красителем, так что ее хорошо было видно во флуоресцентном микроскопе. Поскольку фермент F₁ работает обратимо и может действовать как ATPаза, расщепляя ATP, то добавление ATP в среду вызывало вращение субъединицы и «пришитой» к ней актиновой нити. Это вращение было дискретным, с шагом 120^о (Рис. 14,б), что соответствует предположению о трех состояниях субъединицы в и всего комплекса F₁. Максимальная скорость вращения составляла 4 оборота в секунду. За это время гидролизовались 52 молекулы ATP. По оценке авторов этой работы, этот мотор развивает вращательный момент до 45 пН•нм.

В другом эксперименте К. Киношита и сотрудники «пришивали» к покровному стеклу не только домен F_1, а весь комплекс F₀F₁. При гидролизе ATP в нем субъединица г вращалась вместе с субъединицей е и всем кольцом из 12 субъединиц с комплекса F₀. По этим данным, вращающимся ротором является комплекс гес₁₂, а статором служит комплекс ab₂дб₃в₃. Эти данные трудней интерпретировать, т.к. нелегко представить вращение крупного белкового комплексы внутри липидной мембраны. Возможно, при изоляции комплекса F₀F₁ и последующем сшивании с подложкой также получались сшивки субъединицы г с белком с. В изолированном состоянии, в отсутствие трения, которое белок с испытывает внутри мембраны, вращение субъединицы г могло передаваться белку с, и он вращался вместе с ней. А в митохондриях, вероятно, этого не происходит и ротором служит только субъединица г.

Что же заставляет крутиться субъединицу г в Н⁺-ATP-синтетазе? Как еще постулировал П. Бойер, для этого процесса используется энергия электрохимического потенциала ионов водорода _H+, причем все равно какой его компоненты — или pH. Предполагается, что в домене F₀ протоны, проходящие через мембрану, двигаются по кругу между субъединицами с и выходят по градиенту в матрикс (Рис. 6,а). Этот круговой ток протонов и заставляет вращаться субъединицу г также, как в электромоторе круговой электрический ток, текущий по неподвижному статору вращает подвижный ротор.

Таким образом, H⁺-ATP-синтаза представляет собой самый маленький электромотор нанометровых размеров, работающий на токе, переносимом несколькими протонами.