Ассимиляция элементов минерального питания

Поглощенные растениями ионы во время своего движения через живые клетки корня могут включаться в органические соединения, необходимые для роста и развития растений. Процесс включения минеральных элементов в органические молекулы, такие как нуклеиновые кислоты и аминокислоты, липиды, кофакторы ферментов, пигменты, называется первичной ассимиляцией. Для первичной ассимиляции элементов необходима энергия.

Таким образом, корень — не только орган поглощения, но и орган первичной ассимиляции элементов минерального питания. Лучше всего изучена ассимиляция неорганического азота.

Азотный обмен

Потребность в азоте высшие растения удовлетворяют, поглощая нитраты или аммоний, содержащиеся в почве или в воде. Опыты, проведенные в стерильных условиях, показали, что в качестве источника азота могут быть использованы также аминокислоты и амиды. Однако в почве их, как правило, очень мало. Для насекомоядных растений источником дополнительного азота являются белки насекомых и некоторых других беспозвоночных животных.

Восстановление азота. Азот находится в органических молекулах в восстановленной форме, поэтому нитрат, поглощенный корнем, должен быть восстановлен. Процесс ферментативного восстановления нитрата до аммиака осуществляется в результате двух последовательных реакций:

Первая реакция протекает в цитозоле и катализируется нитратредуктазой (НР), которая восстанавливает нитрат до нитрита в соответствии со следующим уравнением:

НАДН (иногда НАДФН), являющийся донором электронов для этой реакции, образуется в результате дыхания.

Нитратредуктаза высших растений состоит из двух полипептидных цепей (субъединиц) и содержит три простетические группы: ФАД, гем и молибденсодержащий комплекс — молибденовый кофактор. ФАД забирает два электрона от НАДН и через гем передает их молибденовому комплексу, от которого они переносятся на нитрат (см. параграф 6.1).

Образующийся нитрит является очень активным и потенциально токсичным ионом. Поэтому он сразу транспортируется из цитозоля в лейкопласты, которые содержат нитритредуктазу (ЫиР), восстанавливающую нитрит до аммония по уравнению.

где Фд_воссх и Фд_окисл — восстановленная и окисленная формы ферредоксина. Ферредоксин восстанавливается за счет НАДФН, образующегося в окислительном пентозофосфатном пути дыхания, если восстановление нитрата происходит в темноте в лейкопластах клеток корня.

Питритредуктаза представляет собой полипептид с молекулярной массой 63 кДа, содержащий две нростетические группы — железопорфириновую (гем) и железо-серный кластер.

Нитратный азот может превращаться в ион аммония ИЩ уже в клетках первичной коры корня и даже в корневом волоске. Эффективное восстановление токсичного для клеток нитрита до аммония защищает клетки и не дает нитриту накапливаться.

У некоторых растений до 80—90% поглощенных нитратов в неизмененном виде вместе с пасокой может транспортироваться по ксилеме в листья. В листьях восстановление нитратов происходит в хлоропластах за счет восстановленных НАДФ и ферредоксина, которые образуются во время световой фазы фотосинтеза.

У большинства травянистых растений (хлебные злаки, кукуруза, фасоль, сорго, овощные культуры) восстановление нитрата идет как в корнях, так и в листьях. Однако такие растения, как обыкновенный дурнишник, сахарная свекла, хлопчатник, восстанавливают нитраты исключительно в листьях, а растения типа белого клевера, цикория, черники, клюквы, многие деревья и кустарники — преимущественно в корнях.

Регуляция скорости восстановления нитрата нитратредуктазой зависит от концентрации нитрата, содержания углеводов, интенсивности и качества света. Например, через 30 мин после добавления нитрата в зародышах куколя заметно увеличивается уровень иРНК нитратредуктазы. Более быстрая регуляция восстановления нитратов происходит в результате фосфорилирования (дефосфорилирования) молекулы нитратредуктазы. Темнота, ионы магния стимулируют протеинкиназу, которая фосфорилирует остатки серина, входящего в состав нитратредуктазы, вызывая ее инактивацию. Напротив, свет, углеводы и другие факторы стимулируют протеинфосфатазу, которая дефосфорилирует несколько остатков серина молекулы нитратредуктазы, в результате ее активность увеличивается^[1].

Относительный вклад корней или листьев в восстановление нитратного азота зависит не только от специфики вида, но и от концентрации внесенного нитрата и других факторов. При увеличении концентрации нитратов в прикорневом слое почвы значительная часть поглощаемых ионов транспортируется, но сосудам ксилемы в клетки мезофилла и восстанавливается в них. Много нитратов обнаружено в пасоке гречихи и табака. Избыток нитрата может временно запасаться в вакуолях. Накопление нитрата в тканях, достигающее иногда высоких значений, — одна из особенностей азотного обмена растений.

Поскольку для восстановления нитратов необходим достаточный запас НАД (Ф)Н, то интенсивность дыхания корней должна быть довольно высокой. В условиях, затрудняющих дыхание, восстановление нитратов тормозится. Тесная связь восстановления азота с интенсивностью дыхания корней доказывается, например, тем, что при усиленном поглощении нитратов содержание в тканях углеводов, являющихся главным дыхательным субстратом, падает. Это надо учитывать при позднем внесении азотных удобрений. Если дать растению нитратную подкормку в период, когда должно идти накопление сахаров, то сахаристость сахарной свеклы или сахарного тростника снижается, так как сахар будет использоваться в процессе дыхания для образования НАДФН, который пойдет на восстановление ферредоксина. Позднее внесение азота по той же причине снижает и содержание крахмала в клубнях картофеля, батата. В такое время лучше давать в качестве подкормки аммиачный азот.

Восстановление нитратов связано не только с дыханием, но и с фотосинтезом. Связь восстановления нитрата с фотосинтезом бывает как прямая (фотосинтез — поставщик НАДФН и восстановленного ферредоксина), так и косвенная. Косвенная связь состоит в том, что в процессе фотосинтеза образуются углеводы — основной дыхательный субстрат. При выращивании растений в темноте восстановление нитрата должно замедлиться, чтобы не произошло накопления нитритов. Восстановление нитрата и нитрита должно идти с одинаковой скоростью, чтобы не накапливался нитрит. Нитрат и свет стимулируют синтез нитратредуктазы. Период ее полураспада — несколько часов.

От интенсивности света зависит количество восстановленных молекул НАДФ и ферредоксина, а также количество углеводов. При слабом освещении в зеленых клетках реакции темповой фазы фотосинтеза и восстановления нитратов конкурируют за НАДФН и восстановленный ферредоксин.

На восстановление нитратов влияет и качество света. Этот процесс стимулирует синий свет. Флавиновые ферменты, участвующие в восстановлении нитратов, могут его поглощать и активироваться. Следовательно, для восстановления нитрата необходим свет.

НАДН, необходимый для восстановления нитрата в корнях в цитозоле, может образовываться в темноте в гликолизе. Транспорт нитрита из цитозоля в хлоропласт регулируется через светозависимые изменения pH, концентрации образования АТФ, а также через редукцию М0₂.

В последнее время появилось мнение, что процессы ассимиляции С0₂ и Ы0₂ не конкурируют за восстановленный ферредоксин и НАДФН в хлоропластах, так как ферредоксин восстанавливается за счет пентозофосфатного пути дыхания, и в темноте его достаточно, чтобы обеспечить электронами все взаимодействующие с ним процессы. Отсутствие конкуренции между этими двумя процессами доказывается тем, что снабжение азотом усиливает рост, а следовательно, общую фиксацию С0₂.

Взаимодействие и регуляция ассимиляции С0₂ и азота в хлоропласте существует на уровне притока субстратов (С0₂, N0^) и удаления продуктов ассимиляции (глутамата, ФГА).

Одним из факторов регуляции образования нитрита в цитозоле является ПАДИ. Нитрит конкурирует за электроны с кислородом и, вероятно, препятствует образованию АФК.

Опасное накопление нитритов, например в корнях, может происходить в условиях аноксии, возникающих при затоплении. Затопленные корни способны выделять нитрит в воду.

Восстановление нитратов — это универсальный процесс, идущий не только в клетках высших зеленых растений, но и в клетках грибов и водорослей.

Ассимиляция аммония. Поскольку аммоний ядовит и не должен накапливаться в клетках, следующий этап ассимиляции азота — включение азота аммония в состав органических соединений через синтез амидов и аминокислот. Существует два главных пути ассимиляции азота аммония у растений: ГС/ГОГАТ-путь и ГДГ-путь, названия которых происходят от сокращенного имени участвующих в них ферментов.

В 1974 г. Р. Ли и Б. Мифлин (США) описали процесс включения аммония в глутамат с участием двух ферментов — глутаминсинтетазы (ГС) и глутаминоксиглутаратаминтраисферазы (ГОГАТ). Именно этот процесс и получил название ГС/ГОГАТ-пути. Он состоит из двух последовательных реакций. Сначала глутаминсинтетаза катализирует присоединение аммония к глутамату с образованием глутамина. Образовавшийся глутамин далее реагирует при участии ГОГАТ с 2-оксоглутаратом. В результате образуется две молекулы глутамата:

Глутамин — продукт первичной ассимиляции аммония.

АТФ, необходимая для синтеза глутамина в лейкопластах, может образовываться в митохондриях и транспортироваться в лейкопласты переносчиком в обмен на АДФ. Для реакции, катализируемой ГС, необходим не только гидролиз одной молекулы АТФ, но и присутствие в качестве кофакторов двухвалентных ионов магния, марганца и кобальта. Если реакция идет в хлороиластах, то донором водорода для нее вместо НАДН является восстановленный ферредоксин.

Молекула ГС с молекулярной массой 350 кДа состоит из восьми одинаковых субъединиц. В растениях содержится две формы этого фермента — цитозольная и пластидная. Активность глутаминсинтетазы в корнях днем мала, к вечеру она становится равной ее же активности в листьях, а ночью активность этого фермента в корнях больше, чем в листьях.

ГОГАТ тоже существует в двух изоформах. Одна из них использует в качестве донора электронов НАДФН, а другая — восстановленный ферредоксин. Фд-ГОГАТ существует у фотосинтезирующих организмов, а НАДФН-ГОГАТ — у растений и бактерий. Последняя форма иногда более активна в присутствии НАДН, чем НАДФН, и поэтому называется НАДГОГЛТ. Обе формы находятся в пластидах, хлоропластах или лейкопластах.

Глутамат — основной продукт ассимиляции нитрата, органическое вещество, занимающее второе место после сахарозы по концентрации в цитозоле. Глутамат является предшественником глутамина, аргинина и пролина, хлорофиллов и цитохромов.

Помимо ГС/ГОГАТ-пути ассимиляции аммония, существует и другой путь, катализируемый глутаматдегидрогеиазой (ГДГ):

ГДГ обнаружена не только у всех высших растений, но и у животных и бактерий. В корнях и листьях фермент находится главным образом в митохондриях, так как именно в них образуются органические кетокислоты и восстанавливается НАД, являющийся донором водорода для этих реакций.

До недавнего времени ГДГ считали главным ферментом ассимиляции аммония, да и изучен он был раньше, чем ГС/ГОГАТ-путь. Однако было установлено, что глутаматдегидрогеназа не может функционировать при низких концентрациях аммония в клетках. С помощью ингибиторного анализа было показано, что активность ГДГ зависит от функционирования ГС/ГОГАТ-пути: ГДГ активируется в неблагоприятных условиях, вызываемых накоплением аммония из-за снижения скорости протекания ГС/ГОГАТ-пути.

Активность ГДГ увеличивается при прорастании семян и старении, т. е. в те периоды, когда ускорены процессы распада, в том числе аминокислот. В результате образующийся после дезаминирования а-кетоглутарат дополнительно включается в цикл Кребса. В целом эти факты свидетельствуют о важной роли ГДГ в катаболизме аминокислот и реутилизации больших количеств аммония, образующегося в фотодыхании в митохондриях. Количество и активность фермента увеличиваются в темноте при снижении уровня углерода.

Аммоний представляет собой основное и, по-видимому, единственное вещество, включающееся в процессы азотного обмена. При этом аммоний может быть разного происхождения: 1) образовавшийся в результате восстановления нитратов; 2) непосредственно поглощенный из почвы;

• 3) образовавшийся в гликолатиом цикле фотосинтеза (фотодыхаиии) или
• 4) в результате распада белков в стареющих органах, о чем речь пойдет дальше. Реакции ассимиляции аммония очень важны. Эго не только путь обезвреживания аммиака, но и важнейший механизм накопления аминокислот в клетке.

Итак, в результате ассимиляции аммония образуются только глутаминовая кислота и глутамин. Остальные аминокислоты возникают в процессе трансаминирования (переаминирования) и взаимопревращения аминокислот. Реакции переаминирования были открыты в 1937 г. А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман (СССР). Они катализируются трансаминазами, кофактором которых является витамин В₆ (пиридоксальфосфат). Трансаминазы находятся в цитозоле, хлоропластах, митохондриях, глиоксисомах и пероксисомах.

Наиболее интенсивно в растении протекают следующие реакции переаминирования:

Главным источником оксоглутарата является цикл Кребса (ЦТК), поэтому мы можем говорить о центральной роли дыхания в ассимиляции азота. Кетоглутаровая и нировиноградная кислоты — важнейшие продукты превращения углеводов, поэтому описанные реакции образования аминокислот имеют большое значение как пути, тесно связывающие обмен углеводов с обменом аминокислот и белков.

В переаминировании участвует и гликолатиый цикл фотосинтеза (см. параграф 4.5): в пероксисоме образовавшийся глиоксилат в результате реакции трансаминирования, идущей при участии фермента глиоксилатглицинаминотрансферазы, превращается в глицин. Для образования глицина используется аминогруппа, переносимая от глутамата, который при этом превращается в кетоглутарат. Две молекулы глицина затем могут дать одну молекулу серина. У С₄-растений образуется часто большое количество аланина.

Все аминокислоты — конечные продукты ассимиляции азота. Аминокислоты транспортируются только по ситовидным трубкам.

Многообразие аминокислот создается и в результате превращения одной аминокислоты в другую (рис. 6.10). Так, пролин, присоединяя кислород, дает оксипролин. Подвергаясь дегидрированию и ряду других превращений, пролин может образовать орнитин или глутамат; из серина образуется цистеин, а рибозо-5-фосфат — предшественник гистидина.

Рис. 6.10. Взаимопревращения аминокислот Оксалоацетат, образуемый при помощи ФЕП-карбоксилазы, имеет две функции в ассимиляции нитрата:

• 1) он превращается в результате трансаминирования в аспартат, который является предшественником пяти АМК (аспарагина, треонина, изолейцина, лизина и метионина);
• 2) вместе с пируватом служит предшественником кетоглутарата, который превращается путем трансаминирования в глутамат, являющийся, в свою очередь, предшественником грех АМК (глутамина, аргинина, пролина).

Так же как и восстановление нитратов, синтез аминокислот идет в корневых волосках, клетках паренхимы корней и листьев и тесно связан с дыханием и фотосинтезом, которые являются источниками энергии, донорами водорода (НАДН, НАДФН), поставщиками акцепторов аммония. Ассимилиция нитрата может происходить лишь в том случае, когда благодаря фотосинтезу образуются углеродные скелеты для аминокислот.

Ароматические аминокислоты тирозин, фенилаланин, триптофан образуются с помощью шикиматного пути биосинтеза.

• [1] Cm.: Kaiser W., Iluber S. C. Posttranslational Regulation of Nitrate Reductase in HigherPlants // Plant Physiol. 1994. V. 106. P. 817−821.