Методы экологии микроорганизмов

Общие принципы сбора и обработки проб из природных источников

При изучении микроорганизмов в природных местообитаниях анализируют отдельные части образца и результаты затем обобщают для сообщества или экосистемы в целом. Поскольку во многих местообитаниях распределение микроорганизмов скорее кластерное, а не однородное, то единичная проба, взятая в определенной точке, не может правильно отражать общую картину. Это особенно важно для микроорганизмов, которые живут в условиях микроокружения. Ошибка снижается при специальном перемешивании нескольких индивидуальных проб и проведении статистической обработки результатов.

Анализ каждой пробы состоит из трех фаз: сбора образцов, подготовки проб и собственно измерения. При отборе проб и их хранении количество клеток не должно изменяться. Выбранный способ должен гарантировать невозможность загрязнения пробы посторонними микроорганизмами. Если невозможно вплотную приблизиться к анализируемому месту, то применяют различные пробоотборники для дистанционного забора проб. Пробы почвы отбирают обычно с помощью чистых нестерильных инструментов и контейнеров, так как количество микроорганизмов в поверхностных почвенных горизонтах во много раз больше, чем на соприкасающихся с ними чистых предметах. Для сбора образцов со значительной глубины вручную или с помощью специальных механизмов высверливают керн (вертикальный столб почвы и нижележащего грунта). В лаборатории внутри керна анализируют нужные зоны.

Для отбора проб почвенных микроорганизмов, находящихся в относительно небольшом количестве, применяют аттрактангы («наживки») или стекла обрастания (по Холодному). В почву опускают чистые стекла или стекла со специфической агаризованной средой, на которой развиваются прикрепившиеся нужные микроорганизмы. Чистые стекла, не обладающие селективностью, служат аналогами минеральных частиц почвы (кварца) и отражают общее микробное разнообразие образца. Нанесение на стекло среды или использование «наживки» позволяет определить наличие той или иной физиологической группы микроорганизмов.

Погружение в донные осадки или почву открытых с обоих концов капилляров с плоскоиараллельными стенками (капилляров Перфильева) приводит к свободному перемещению микроорганизмов внутри них. Часто капилляры заливают селективной средой. Преимущество таких капилляров в том, что их содержимое можно рассматривать непосредственно под микроскопом. Прижизненные наблюдения за развитием почвенной или осадочной микробиоты дают возможность вести непрерывные исследования микробных популяций, не нарушая их целостности. В капилляр можно вносить разные вещества и следить за реакцией микробного сообщества. При этом можно применять съемку с помощью автоматической кинокамеры, рассчитанной на определенное число снимков в час или день, не опасаться подсыхания препарата, устанавливать режим проточного культивирования и следить за развитием анаэробного сообщества, не применяя при этом сложной техники анаэробного культивирования. Капилляры также дают возможность обнаруживать необычные морфологические формы пока некультивируемых микроорганизмов. Пробы воды практически всегда отбирают на значительном удалении от исследователя. Открытые водные пространства содержат немного микроорганизмов, поэтому пробы легко загрязнить неестественной микробиотой с самого прибора или из других слоев воды.

Создание сложных пробоотборников преследует цель дистанционного отбора и соблюдения максимальной стерильности при доставке пробы из нужного места, например, со значительной глубины. Водные пробоотборники могут представлять собой вакуумированные бутыли, которые заполняются водой на определенной глубине с помощью грузика-мессенджера, разбивающего водозасасывающий капилляр. Другой вариант — это стерильный пластиковый пакет, раскрывающийся с помощью пружины на определенной глубине после опускания с поверхности груза, одновременно приводящего в движение пружину и бритву, вскрывающую отверстие в пакете. Существует пробоотборник с укрепленными на разной глубине стерильными шприцами, в которые одновременно засасываются пробы воды. Такие приспособления применяют обычно для отбора проб из неглубоких стратифицированных озер. При отборе глубоководных проб необходимо предусматривать возможность декомпрессии организмов при подъеме на поверхность. Разработаны пробоотборники, позволяющие открывать и закрывать входные отверстия на глубине, что способствует сохранению присущего месту отбора давления внутри пробы при подъеме.

Пробы осадков обычно отбирают с поверхности с помощью скребков или ковшей, однако такие способы не позволяют уберечь данные пробы от загрязнения посторонней микробиотой. С соблюдением асептики можно отбирать пробы-керны, которые затем в лаборатории в стерильных условиях делят в вертикальном направлении, что позволяет прослеживать динамику осадков по горизонтали. Наиболее точно отбирают пробы морских осадков с использованием миниатюрных двух-трехместных подводных лодок, которые погружаются на глубину до 3 км. С помощью манипуляторов и специальных сверл исследователи, находясь внутри лодки, отбирают пробы осадков в точно ограниченном участке (особенно это важно в местах подводных термальных источников или «черных курильщиков»). Использование мини-подлодок позволяет также обрабатывать пробы на месте отбора (например, вводя радиоизотопы) и оставлять их на месте отбора для инкубации с последующим подъемом на поверхность для анализов. Отбор проб воздуха ведут с применением аппаратов, которые минимально травмируют живые клетки микроорганизмов, находящиеся обычно в мельчайших капельках аэрозолей. Пробы воздуха определенного объема либо пропускают через бактериальные фильтры, либо направляют поток засасываемого воздуха на поверхность открытой чашки Петри с агаризованной средой, где осаждаются все взвешенные частицы, включая микроорганизмы. Пассивная седиментация, позволяющая подсчитать количество осевших (и образовавших колонии) клеток микроорганизмов на поверхности открытых чашек Петри с агаризованной средой, более пригодна для подсчета количества спор грибов, но дает лишь приблизительные результаты для количественного учета находящихся в воздухе бактерий. Пробы биологических образцов растений или животных — это образцы биологических жидкостей (растительный сок, кровь, моча, лимфа, мокрота), выделений (каловые массы) или проб с поверхности и внутренних органов объекта (биопсии). С поверхностей микроорганизмы смывают или счищают стерильным физраствором (0,85%-й раствор NaCl в дистиллированной воде) с помощью стерильных ватных тампонов. Можно сохранять микроорганизмы непосредственно в образцах тканей, что важно для наблюдения их топографического распределения или количественного учета в них.

Концентрированные образцы должны быть разбавлены до нужной плотности микроорганизмов с последующим высевом на питательные среды для подсчета живых клеток. Обычно осуществляют 10-кратные разведения проб с тем, чтобы на поверхность среды в чашке Петри попало 50—200 клеток, способных образовать колонии. При этом важно подобрать разбавитель, не влияющий на жизнеспособность микроорганизмов. При разбавлении образцов клетки должны равномерно распределяться в объеме пробы. При обработке проб почвы или осадков, в которых микроорганизмы прикреплены к частицам, степень десорбции микробных клеток может зависеть от концентрации и химического состава разбавителя, времени, температуры и силы перемешивания. Процедура подготовки проб к экспериментам должна быть стандартной, чтобы результаты можно было сравнивать. Сильно разбавленные образцы должны быть перед посевом сконцентрированы путем центрифугирования или фильтрования через мембранные фильтры, задерживающие микробные клетки. При концентрировании образцов огромное значение имеет выбор фильтра, так как фильтры с малыми порами быстро забиваются и не позволяют фильтровать пробы достаточных объемов, а фильтры с большими порами могут пропустить часть клеток. Обычно поликарбонатным фильтрам отдают предпочтение над нитроцеллюлозными из-за более плоской поверхности и унифицированного размера пор. Химический состав материала фильтра также влияет на выживаемость микроорганизмов.

Необходимо учитывать возможность размножения клеток в образце во время хранения или транспортировки (так называемый «эффект бутылки»). Например, когда пробу морской воды, лишенной природных абсорбирующих поверхностей, помещают в стерильную посуду, питательные вещества воды сорбируются на внутренней поверхности сосуда, привлекая микробные клетки. Они прикрепляются к стенкам и начинают быстро размножаться. В то же время хранение собранных образцов может привести к гибели части популяции микроорганизмов, следствием чего будет занижение результатов. Несоблюдение при обработке проб условий, необходимых для той или иной физиологической группы микроорганизмов, может существенно изменить результат анализа. Так, обработка проб для выявления строгих анаэробов требует проведения всех разведений в растворах без кислорода и посева проб в бескислородной атмосфере. Для выявления психрофильных микроорганизмов вся стеклянная посуда и жидкости, соприкасающиеся с пробой, должны быть охлаждены для максимального сохранения жизнеспособных клеток нсихрофилов.

Если пробы не предназначены для определения числа живых и мертвых клеток, то их обычно фиксируют с помощью формальдегида или глутарового альдегида непосредственно после отбора. Такие препараты сразу готовы для прямого микроскопирования.

Сбор вирусных частиц из природных проб требует применения специальных методов их концентрирования из водных образцов путем неоднократной адсорбции/элюции подкисленных проб при пропускании их через эпоксидные, фиберглассовые или нитроцеллюлозные фильтры. Сорбированные частицы затем элюируют щелочными растворами. Процедуру повторяют многократно, концентрируя вирусные частицы в тысячи раз, например, из морской воды или проб осадков.