Оценка безопасности воды, воздуха, почвы и пищевых продуктов

Область медицинской микробиологии, изучающую влияние микробиоты окружающей среды на здоровье человека, называют санитарной микробиологией. Санитарно-микробиологические исследования включают как определение общего количества микроорганизмов и вирусов в воде, воздухе, почве, на предметах обихода и в пищевых продуктах, так и обнаружение возбудителей конкретных заболеваний. Для этого используют две группы методов: прямые и косвенные. Методы косвенной оценки позволяют судить о потенциальной опасности данного объекта для здоровья людей. Так, при определении общего микробного числа (микробной обсемененносги) полагают, что чем большее количество микроорганизмов присутствует в пробе, тем более вероятно наличие среди них патогенных форм. Этот метод широко применяется и санитарной микробиологии и учитывает содержание мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАМ) в 1 мл или 1 г исследуемого материала. Подготовленную пробу высевают на чашки Петри с МПА и после определенного срока выдерживания при благоприятной температуре подсчитывают число выросших колоний. Для учета микроорганизмов, не способных расти на МПА в таких условиях (грибов, анаэробных, нитрифицирующих, азотфиксирующих и других бактерий), проводят дополнительные посевы на соответствующие среды. Общую обсемененность можно определить также методами прямого подсчета клеток под микроскопом.

Специфическим методом косвенной оценки является определение санитарно-показательных микроорганизмов. К санитарно-показательным микроорганизмам (СПМ) относят представителей нормальной микробиоты человека и теплокровных животных, обитающих в желудочно-кишечном тракте или в дыхательных путях. Такие микроорганизмы должны постоянно присутствовать в значительных количествах в выделениях и достаточно долго выживать в окружающей среде. Их учет должен быть простым и быстрым. Сами по себе СПМ могут и не представлять опасности для здоровья, но их наличие в пробе говорит о ее загрязненности выделениями человека и животных. Предполагают, что чем больше объект загрязнен такими выделениями, тем больше вероятность присутствия патогенных микроорганизмов. Содержание СПМ выражают в виде титра или индекса. Титр — это количество исследуемого материала (в миллилитрах или граммах), в котором содержится 1 микробная клетка. Величина, обратная титру, называется индексом и означает количество СПМ в 1 л жидких, 1 г твердых или 1 см³ газообразных веществ. Чаще всего СПМ выявляют путем посева на специальные диагностические среды, которые изменяют свои свойства при развитии на них определенной группы микроорганизмов. Набор выявляемых санитарно-показательных микроорганизмов зависит от природы исследуемого материала.

Наиболее важными СПМ считаются бактерии группы кишечной палочки (БГКП), природным резервуаром которых является желудочнокишечный тракт человека и животных, а в окружающей среде (за исключением продуктов питания) они не размножаются и не могут длительно сохраняться. Наличие кишечной палочки (Escherichia coli) и энтерококка (Enterococcus faecalis) говорит о свежем фекальном загрязнении, так как они выживают вне организма всего несколько дней. Если в пробе обнаруживается протей (Proteus vulgaris), то кроме загрязнения фекалиями, это свидетельствует о наличии процесса гниения. Выявление Clostridium perfringens, длительно сохраняющегося в окружающей среде, позволяет судить о давнем загрязнении экскрементами и о содержании в пробе анаэробных споровых бактерий — возбудителей опасных заболеваний человека. О загрязнении разлагающимися отбросами говорит резкое увеличение количества термофильных представителей лактобацилл и стрептококков, способных размножаться при 50—60°С.

Золотистый стафилококк и гемолитические стрептококки попадают на объекты окружающей среды воздушно-капельным путем из носоглотки, зева и с кожных покровов человека. Наличие этих микроорганизмов позволяет судить о возможном загрязнении исследуемого материала возбудителями респираторных инфекций. Методы прямого обнаружения патогенных микроорганизмов однозначно свидетельствуют о наличии возбудителя в окружающей среде. Для этого проводят посевы на специальные питательные среды с последующим выделением патогена в чистую культуру. Определение возбудителя ведут с использованием биохимических, молекулярно-биологических и серологических реакций. Прямое обнаружение патогена требует существенных затрат времени и затруднено незначительным содержанием и неравномерным распределением возбудителя в пробе на фоне сапротрофных микроорганизмов. Поэтому прямое выделение патогенов в санитарно-микробиологических исследованиях обычно проводят только в том случае, когда косвенная оценка свидетельствует о возможном их наличии в пробе.

Содержание микроорганизмов в открытых водоемах зависит от концентрации органических веществ и других физико-химических факторов. На число микробных клеток в подземных водах влияют глубина залегания и фильтрующая способность грунта. Загрязнение воды происходит при попадании ливневых и сточных вод и различных отбросов. Стоки населенных пунктов содержат фекальные выделения и большое количество микроорганизмов, многие из которых способны некоторое время выживать в водоемах. Среди них могут присутствовать и возбудители опасных заболеваний. Микробиологические показатели определяют для воды централизованного водоснабжения, колодцев, открытых водоемов, плавательных бассейнов, артезианских скважин и т. д.

Санитарно-микробиологическую оценку воды проводят путем определения общего микробного числа и содержания СИМ. Воду открытых водоемов для исследования отбирают в стерильные флаконы в количестве 500 мл с глубины 10—15 см. Водопроводные краны сначала протирают спиртом и обжигают, затем в течение 15 мин спускают воду и только потом заполняют стерильный флакон. Флакон для хлорированной воды должен содержат дехлоратор (гипосульфит натрия). Общее микробное число воды определяют путем глубинного посева в МПА в чашках Петри. После выдерживания чашек с посевами при 37 °C в течение суток подсчитывают число колоний, образовавшихся на поверхности и в глубине среды. Для хорошей питьевой воды общее количество микробов в 1 мл не должно быть выше 100. При значении 100—150 питьевая вода считается сомнительной, а при 500 и выше — загрязненной. Для питьевой воды определяют также коли-индекс (число клеток БГКП в 1 л воды) и коли-титр (количество миллилитров воды, в котором содержится 1 клетка этой группы). Так, показателем чистой воды в Российской Федерации является коли-титр более 500 (в Европе более 300).

Определение коли-титра и коли-индекса воды проводят двухэтапным бродильным методом или с помощью мембранных фильтров. При использовании бродильного метода определенные объемы воды вносят в емкости с диагностической средой, содержащей индикатор изменения кислотности и глюкозу. После выдерживания 24 ч при 37 °C отмечают наличие мутности, выделение газа, изменение цвета индикатора (т.е. выделение кислоты или щелочи). Если в среде отсутствуют помутнение, выделение кислоты и газа, то результат считают отрицательным (БГКП в данном объеме воды не обнаружены). Из положительных вариантов делают посев петлей на специальную агаризованную среду Эндо для получения отдельных колоний. Если через 18 ч роста при 37 °C не выросли характерные колонии, то результат считают отрицательным. Признаками характерных колоний являются красная, розовая или бледно-розовая окраска, круглая форма, блестящая поверхность и ровный край, иногда наличие металлического блеска. Из таких колоний делают фиксированные окрашенные по Граму препараты и ставят тест на наличие оксидазы. БГКП не имеют оксидазной активности и по Граму окрашиваются отрицательно. Искомые параметры определяют с помощью специальной таблицы (табл. 18.4).

Таблица 18.4

Определение коли-титра и коли-индекса для воды.

Примечание. «+» — наличие БГКП; «-» означает отсутствие признаков роста.

По методу мембранных фильтров воду сначала фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. При этом микробные клетки остаются на поверхности фильтра. Фильтры затем раскладывают на поверхность среды Эндо в чашках Петри и выдерживают 18—24 ч при 37 °C. Красные и темно-красные колонии с металлическим блеском и без него, выросшие на поверхности фильтра, подсчитывают и проверяют на принадлежность к БГКП, как в бродильном методе. Прямое обнаружение патогенов (сальмонелл, холерных вибрионов, возбудителей тифов, дизентерии, энтеровирусов) проводят только после подтверждения опасного фекального загрязнения.

В воздухе (особенно в закрытых помещениях) могут присутствовать патогенные микроорганизмы, выделяемые человеком через верхние дыхательные пути и с поверхности кожных покровов. При оценке санитарного состояния воздуха определяют общее микробное число и наличие СПМ. Максимально допустимый предел микробной обсемененности нормируется только для медицинских учреждений и спецпроизводств. Общее микробное число определяют в 1 см³ воздуха по числу колоний, выросших на чашке Петри с МПА. Самым простым способом определения является седиментационный метод, когда чашки с МПА оставляют открытыми на 5—10 мин, а затем закрывают и выдерживают 1—2 сут. при 20—30°С. Считается, что под действием силы тяжести на поверхность среды в открытой чашке Петри оседают все частицы (в том числе и клетки) из 10 л воздуха и каждая клетка дает колонию. Отбор проб воздуха с помощью специальных аппаратов позволяет повысить точность определения общего микробного числа. Для выявления СПМ воздуха — золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) и гемолитических стрептококков (штаммы Streptococcus pyogenes), используют агаризованиые среды, содержащие цельную кровь или плазму. Золотистый стафилококк также хорошо развивается при повышенном содержании поваренной соли на молочноили желточно-солевом агаре. На них колонии СПМ образуют зоны гемолиза или коагуляции. Прямое выделение патогенов проводят из воздуха медицинских стационаров для выявления возбудителей внутрибольничных инфекций. На ряде предприятий пищевой и микробиологической промышленности следят за содержанием микроорганизма-продуцента в воздухе производственных помещений.

Санитарно-микробиологическая оценка почвы проводится при определении пригодности земли для земледелия, застройки, организации зон отдыха и т. д. Почвы в целом характеризуются высоким содержанием микроорганизмов, среди которых могут присутствовать патогенные виды, постоянно обитающие в почве или занесенные туда с выделениями человека и животных. Занесенные микробы при наличии способности к спорообразованию могут длительно сохраняться в почве. Неспоровые возбудители в большинстве своем выживают в почве в течение нескольких недель или месяцев. Для определения общего микробного числа отбирают 10 проб из разных мест исследуемой территории. Образец массой 200—300 г берут стерильным ножом с глубины 10—15 см в стерильную банку или пакет и тщательно перемешивают. Навеску помещают в колбу со стерильной водой и встряхивают в течение 10 мин. Затем из полученной суспензии готовят последовательные десятичные разведения до 10^_/. Из двух последних разведений осуществляют глубинный посев в МПА в чашках Петри. После роста в течение суток при 37 °C подсчитывают колонии на агаре и определяют микробное число. Для чистых почв общее микробное число составляет 10 000 на 1 г почвы; для слабо загрязненных — 100 000; для умеренно загрязненных — менее 1000 000; для сильно загрязненных — более 1000 000. В качестве почвенных санитарно-показательных микроорганизмов исследуют БГКП, Clostridium perfringens и термофильные бактерии. Коли-титр и коли-индекс почвы определяют бродильным методом, как и для воды, используя десятичные разведения почвенной суспензии. Для вычисления иерфрингенс-титра (массы почвы в граммах, где обнаруживается одна клетка этого клостридия) пользуются обезжиренным молоком или железосульфитной средой. Через 1—2 сут. при 43 °C после засева разведений почвенной суспензии отмечают образование сгустка на молочной среде или характерных колоний в агаровом столбике железосульфитной среды. Колонии С. perfringens имеют форму чечевичек или комочков ваты и черную окраску. Принадлежность колоний подтверждают микроскопированием и биохимическими тестами. Самое большое разведение почвенной суспензии, при котором еще наблюдается рост, и дает значение перфрингенс-титра. Содержание термофильных бактерий в образце определяют с помощью глубинного посева разведений суспензии в МПА в чашках Петри. Посевы выдерживают в течение суток при 60 °C и число выросших колоний пересчитывают на 1 г почвы. Оценка санитарного состояния почвы проводится комплексно (табл. 18.5), однако решающее значение имеет степень фекального загрязнения.

Таблица 18.5

Оценка санитарного состояния почвы.

Большинство пищевых продуктов содержит питательные вещества, благоприятные для развития различных групп микроорганизмов. Опасность микробного заражения пищевых продуктов заключается не только в самом присутствии посторонней микробиоты, но и в изменениях, происходящих в продуктах под влиянием микробного метаболизма. Поэтому исследование пищевого продукта на соответствие установленному для него стандарту состоит из целого комплекса процедур. В специальных лабораториях изучают доброкачественность продукта, определяют содержание в нем вредных и ядовитых веществ, а также выявляют общее микробное число и наличие микроорганизмов ряда групп. Санитарно-микробиологическую оценку состояния пищевого продукта проводят в плановом порядке для контроля процессов его приготовления, хранения и реализации, в случае сомнения в его качестве и при возникновении заболеваний, связанных с употреблением продукта. В пробе по утвержденной схеме определяют степень общей обсемененности, содержание плесеней, дрожжевых форм и молочнокислых бактерий, СПМ, наличие условно патогенных и патогенных микроорганизмов. Допустимые количества той или иной группы микроорганизмов в конкретном продукте нормируются государственными стандартами (ГОСТ), санитарными правилами и нормами (СанПиН), методическими указаниями, инструкциями и другими документами (табл. 18.6).

Санитарно-бактериологические нормативы для некоторых мясных и молочных продуктов

Примечание. «—» означает, что анализ не проводится.

Из разных мест плотных продуктов (с поверхности и с глубины) отбирают пробы, смешивают их и получают усредненную пробу. Ее навеску затем растирают в стерильной ступке с добавлением стерильного физиологического раствора (10 г продукта на 90 мл физраствора). Такую суспензию, а также жидкие продукты используют для посевов и разведения. Для определения наличия сальмонелл из усредненной пробы сразу отбирается навеска 25 г. Для посевов готовят последовательные десятичные разведения. Определение общей обсемененности проводят путем глубинного посева разведений в МПА в чашках Петри. Подсчет выросших колоний осуществляют после выращивания при 37 °C в течение суток. Наличие плесневых грибов и дрожжей в продукте показывают с помощью глубинного посева разведений на сахаристую среду Сабуро в чашках Петри. Посевы выдерживают 5 сут. при 25 °C и подсчитывают отдельно колонии дрожжей и плесневых грибов.

Наличие БГКП определяют бродильным способом, аналогичным определению коли-титра, но для посева берут количество продукта, в котором по нормам предусматривается отсутствие бактерий этой группы. Если в диагностической среде не происходит изменения цвета индикатора и газообразования, то делают заключение о соответствии продукта нормативу по этому показателю. Если признаки роста есть, то производят посев на среду Эндо для получения отдельных колоний. Колонии, типичные для БГКП, подвергают биохимическому и микроскопическому тестированию.

Для определения сальмонелл 25 г усредненной пробы помещают в 100 мл селенитового бульона и после суточного подращивания при 37 °C осуществляют посев истощающим штрихом на поверхность висмут-сульфит-агара. Через сутки отбирают черные с металлическим блеском и светло-зеленые колонии и высевают их штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик на специальную диагностическую агаризованную среду с двумя сахарами (глюкозой и лактозой). Варианты, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа и не использующие лактозу, микроскопируют и при наличии грамотрицательных подвижных палочек с закругленными концами, не образующих споры и капсулы и не имеющих оксидазной активности, делают вывод о возможном присутствии сальмонелл в образце.

Для определения золотистого стафилококка используют посев разведений в 6,5%-й солевой бульон для подращивания и на поверхность молочноили желточно-солевого агара для получения отдельных колоний. Посевы выдерживают сутки при 37 °C и еще сутки при комнатной температуре. На желточно-солевом агаре колонии стафилококков имеют дисковидную форму с ровными краями с окраской от белой до золотистой. Вокруг колонии образуются радужное кольцо и зона помутнения среды. Выросшие на молочно-солевом агаре колонии стафилококков — круглые, выпуклые, мутные, окрашены в белый, кремовый и желто-оранжевый цвета. Из типичных колоний готовят микроскопические препараты по Граму и ставят тест на наличие каталазы.

Для определения протея в пробе образец высевают в конденсационную воду нижней части свежескошенного МПА и посевы оставляют на 18—20 ч при 37 °C. При наличии вползающего нежного вуалеобразного роста и гнилостного запаха из верхнего края культуры отбирают клетки и микроскопируют их в живом препарате и в окрашенном по Граму. Протей — это грамотрицательная прямая подвижная палочка с закругленными концами, склонная к полиморфизму. Результаты микроскопирования подкрепляются положительным тестом на каталазу и отрицательным — на оксидазу. Наличие в образце продукта клостридий определяют с помощью глубинного посева в железо-сульфитный агар в пробирки. Через сутки роста при.

37 °C появление черных колоний указывает на присутствие сульфитвосстанавливающих клостридий в образце. Из подозрительных колоний готовят окрашенные по Граму препараты и ставят тест на каталазу.

Пищевые продукты, состояние которых не соответствует требованиям нормативных документов, не должны допускаться в продажу. По эпидемиологическим показаниям в таком продукте может быть проведено прямое выделение патогенных микроорганизмов и их токсинов с использованием набора биохимических, молекулярно-биологических и серологических методов.