Каллусные культуры растений

Существует несколько типов культур клеток и тканей растений, в зависимости от способа их получения, условий культивирования и происхождения. Если культивирование происходит на плотной поверхности питательной среды, содержащей агар, то образуется каллусная ткань (рис. 3.5, см. цв. вклейку).

Каллус («мозоль») может образовываться как на изолированных кусочках ткани (эксплантах) в условиях in vitro, так и на растении при поранении.

Каллусная культура — это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток.

Известный ученый-ботаник Н. Кренке более 50 лет назад посвятил часть своих работ изучению роли каллусной ткани в целом растении. Он установил, что в интактном растении каллусная ткань выполняет следующие функции:

• — защитные (защищает места повреждений);
• — запасные (запасание питательных веществ, синтез вторичных соединений);
• — регенерационные (регенерация утраченных органов — корней, побегов).

Каллусную ткань в условиях in vitro можно получить практически из любой живой ткани растений, используя для этого определенные методические подходы.

В основном каллусы имеют белый или желтоватый цвет. Реже отмечается их светло-зеленая окраска и очень редко — интенсивно-зеленая, как это наблюдалось у каллуса мандрагоры. Темно-коричневая окраска чаще возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них окисленных фенольных соединений (рис. 3.6, см. цв. вклейку). Для предотвращения этого процесса или его снижения в питательные среды вносят антиоксиданты.

Каллусная ткань обычно аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, хотя она может быть разной плотности, в зависимости от происхождения и условий выращивания (рис. 3.7).

По классификации Р. Г. Бутенко, существует три типа каллусной ткани (рис. 3.8, см. цв. вклейку):

• — рыхлая, легко распадающаяся на отдельные мелкие агрегаты и состоящая из сильно оводненных клеток;
• — средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

Рис. 3.7. Типы каллусных тканей высших растений (по Т. А. Егоровой и др., 2003)

— плотная, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Любой тип плотности каллусной ткани можно превратить в другой, используя для этого следующие приемы:

• — заменяя один ауксин на другой (например, ИУК — на 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д));
• — изменяя концентрацию ауксина в питательной среде;
• — увеличивая или уменьшая концентрацию соли хлорида кальция в питательной среде;
• — добавляя в питательную среду ферменты (если необходимо получить каллусную ткань рыхлого типа).

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток.

Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению.

Каждая клетка проходит три фазы роста: деление, растяжение, дифференцировку. Характерные особенности заключительной фазы роста — утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т. е. чтобы клетки как бы возвратились в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань.

Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки.

Эффект, вызываемый воздействием одних и тех же фитогормонов, может быть различным, в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Компетентность ее определяется степенью дифференцировки клеток.

Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму. Она включает пять фаз. Во время первой, латентной, или лаг-фазы, не происходит увеличения числа или массы клеток. Они в этот период подготавливаются к делениям. Вторая фаза — логарифмическая, или экпоненциалъного роста, — характеризуется наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной культуры; кроме того, рост происходит с ускорением. Третья фаза — линейная, в которой скорость роста клеток постоянна. Далее наступает четвертая фаза — замедленного роста, когда митотическая активность клеток резко снижается. В пятой — стационарной — фазе ростовая кривая выходит на плато, число поделившихся клеток равно числу отмерших. В этот период начинается деградация клеток, однако она еще уравновешивается возрастанием числа клеток за счет их деления; в целом же скорость нарастания клеточной массы равна нулю. После стационарной наступает фаза отмирания (деградации) клеток, во время которой число и масса живых клеток уменьшаются.

Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения, из которого они были получены. Сохраняются, например, такие свойства, как морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), а главное, хотя и в разной степени, — способность к синтезу вторичных метаболитов. Наряду с этими общими чертами, у каллусных клеток появляются свои, характерные только для них особенности. Например, длительно культивируемые in vitro клетки высших растений образуют специфическую популяцию соматических клеток, относящуюся к типу неполовых. Наиболее характерные свойства этой популяции — физиологическая асинхронность и генетическая гетерогенность.

Физиологическая асинхронность — важнейшее свойство неполовой популяции — заключается в том, что в каждый данный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее физиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток. Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны, в их числе:

• — особенности вида, сорта, генотипа индивидуального растения, а также особенности экспланта;
• — стрессы культивирования, например неоптимальная для данного вида клеток среда;
• — изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в течение выращивания;
• — генетическая гетерогенность клеток и клонов;
• — аномалия митотического цикла клеток in vitro;
• — физические факторы (температура, свет, аэрация).

Асинхронность — устойчивое свойство популяции каллусных клеток. Если с помощью специфических воздействий синхронизировать пролиферацию клеток популяции, то уже через три-четыре деления она вновь становится асинхронной.

Генетическая гетерогенность — свойство клеток соматической популяции (нестабильность генома и их генетическая гетерогенность).

Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации, генные мутации. Однако генетическую гетерогенность нельзя рассматривать как недостаток, поскольку она является необходимым условием существования популяции клеток и служит основой для их адаптации.

В качестве причин появления генетической гетерогенности можно назвать следующие:

• — генетическая гетерогенность исходного материала. В растениях клетки характеризуются различной плоидностью, диплоидны только активно делящиеся меристематические клетки;
• — нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения;
• — действие компонентов среды. Экзогенные гормоны и стимуляторы могут оказывать мутагенное воздействие. Ауксины (особенно 2,4-Д), входящие в состав питательных сред, являются мутагенами; цитокинины способствуют полиплоидизации клеток;
• — длительное субкультивирование, при котором накапливаются генетически измененные каллусные клетки.

После пяти-шести пересадок новый кариотип клеточной популяции, как правило, стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физических или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям.

Генетическая нестабильность каллусных клеток имеет большое значение для селекционной работы, так как позволяет отбирать штаммы клеток с измененным генотипом. Эти клетки могут обладать уникальными свойствами: повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам, повышенной продуктивностью и т. д. Однако генетическая гетерогенность популяций каллусных клеток в культуре не влияет на сохранение в их геноме основных качеств вида и растения-донора.

Гормоннезависимость. Хотя гормоны и вызывают мутации, каллусные ткани большинства растений образуются только в присутствии в питательной среде и ауксинов, и цитокининов. Исключение составляют, например, незрелые зародыши пшеницы и семядоли подсолнечника. Первые образуют каллусную ткань на питательной среде с 2,4-Д, но без цитокининов, вторые, напротив, — на среде, содержащей цитокинины, но без ауксинов. По-видимому, такая специфика связана с эндогенным содержанием фитогормонов и с компетентностью клеток.

При длительном культивировании у каллусных тканей может возникать специфическое свойство гормоннезависимости, т. е. автономности, по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на опухолевые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Внешне же такие гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных.

Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свойство автономности от присутствия в среде гормонов, называют «привыкшими». Ткани, образованные такими «привыкшими» клетками, называют «химическими опухолями», в отличие от растительных или генетических опухолей.

Генетические опухоли возникают на межвидовых гибридах растений. Растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение, чаще всего они возникают при попадании в растения агробактерий. Так, Agrobacterium tumefaciens вызывает образование корончатых галлов, A. rhizogenes — бородатого корня, A. rubi — стеблевого галла. Превращение растительных клеток в опухолевые связано с проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называемой Т-ДНК, которая значительно изменяет свойства клетки, в том числе экспрессирует гены, контролирующие синтез ауксинов и цитокининов.

Гормоннезависимость «привыкших» клеток связана с изменением активности собственных генов, ответственных за синтез белков-ферментов, участвующих в синтезе гормонов. Таким образом, «привыкшим» тканям и растительным опухолям в равной степени свойственна гормоннезависимость, но у растительных опухолей она носит генетический характер. У «привыкших» клеток это свойство достигается главным образом за счет эпигеномных изменений.

Существует еще одна особенность, позволяющая отличить «привыкшие» и опухолевые клетки от обычных каллусных. Так, ни опухолевые, ни «привыкшие» ткани не способны к нормальной регенерации. Они могут образовывать уродливые органоподобные структуры, так называемые тератомы. В отдельных случаях у длительно культивируемых тканей удается отодвинуть порог «привыкания» путем изменения состава питательных сред и добиться регенерации нормального растения.

В заключение следует сказать, что, как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они «помнят» свое происхождение. Так, клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового — соответствующее растение и т. д.

Культивируемые клетки высших растений — это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автономному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может сохраняться очень долго. Известны ткани, которые поддерживаются в культуре in vitro по 60−70 лет.