Актуальность темы
Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных реакций в плазме крови. Ее основой служит каскад активирующих друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей — реакций, в которых ферменты нижних ступеней каскада воздействуют на компоненты, находящиеся на более высоких ступенях [1,2]. Основная задача свертывания заключается в предотвращении потери крови при нарушении целостности сосудистой системы. Она реализуется посредством расщепления белка фибриногена, присутствующего в плазме крови, которое ведет к его превращению в способный к полимеризации белок фибрин. В свою очередь, формирование сети волокон фибрина приводит к локальному переходу плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние и остановке кровотечения. Помимо наиболее очевидной функции, остановки кровотечения при ранениях, свертывание крови участвует в защите организма от различных внутренних повреждений и кровоизлияний, микротравм, которые постоянно возникают при любой мышечной нагрузке, заживлении ран, иммунном ответе, формировании сосудистой системы при ангиогенезе.
Нормальное функционирование кровеносной системы требует постоянного поддержания деликатного баланса между жидким состоянием крови в норме и способностью быстро сформировать фибриновый сгусток. Такое положение дел приводит к тому, что система остановки кровотечения, система гемостаза оказывается не только жизненно важной, но одновременно и одной из самых уязвимых систем организма. Отклонение вышеописанного баланса создает опасность возникновения кровотечения, тромбоза или же более сложной патологии наподобие диссеминированного внутрисосудистого свертывания [3−5]. Такие отклонения нередко возникают при самых разных заболеваниях или состояниях, изначально не связанных напрямую со свертыванием: раке, сепсисе, атеросклерозе, травме, беременности и других. В связи с этим нарушения свертывания крови являются, прямо или косвенно, лидирующей причиной смертности и инвалидности в современном мире.
Борьба с нарушениями свертывания затруднена высокой сложностью этого процесса. В нем задействованы десятки белков, взаимодействующие в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой стенкии указанное взаимодействие происходит на фоне диффузии участников реакций и их переноса кровотоком. Наличие сложных и нелинейных обратных связей в каскаде свертывания приводит к тому, что его ответ на внешнее воздействие оказывается сложно предсказать на основании интуитивных соображений [6]. На практике это означает, что большинство современных лекарственных средств не могут эффективно вернуть свертывание к нормальному состоянию: применение антитромботических препаратов почти всегда связано с риском развития кровотечений, а попытки улучшить свертывание крови часто ведут к тромбозам [7]. Схожие проблемы возникают и при диагностике: например, удлинение активированного частичного тромбопластинового времени не обязательно связано с кровотечениями, а прокоагулянтные изменения в плазме этим тестом не регистрируются совершенно [8,9].
Ключевым препятствием на пути развития более совершенных методов диагностики и терапии свертывания крови оказывается недостаточное понимание его регуляции [10,11]. В этой сложной сети реакций только одна — полимеризация фибрина — непосредственно нужна для перехода плазмы крови в гелеобразное состояние. Весь остальной каскад с его сложными механизмами, десятками факторов, ингибиторов, положительных и отрицательных обратных связей выполняет чисто регуляторную роль. Выяснение того, зачем система свертывания устроена так сложно, и какую роль играет каждый из ее компонентов, может привести к качественному прогрессу в нашей способности ею управлять.
Описанные обстоятельства позволяют сделать первый вывод: о практической важности исследований регуляции свертывания крови, обусловленной значительностью вклада нарушений свертывания в смертность и инвалидность.
Что сейчас известно о регуляции системы свертывания? Еще на самых ранних этапах ее исследования появлялись гипотезы о возможных причинах каскадного устройства [12]. В последние десятилетия на пути к его пониманию были сделаны несколько принципиальных шагов. Основополагающие теоретические работы М. А. Ханина и сотрудников [6,13] выявили роль положительных обратных связей в формировании в ферментативных каскадах порога по активации — способности системы переключаться между устойчивыми стационарными состояниями в зависимости от силы активации. Другая функция обратных связей, регуляция пространственного распространения свертывания, была предложена в серии теоретических и экспериментальных работ Ф. И. Атауллаханова и сотрудников [14−18]. Третье возможное следствие наличия положительных обратных связей, пороговый ответ по скорости кровотока, было предсказано Э. Бельтрами и Дж. Джести [19]. Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток проанализировать и понять структуру каскада свертывания в целом, систематически и с единых позиций изучить функции его различных частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты были предсказаны с помощью сильно упрощенных математических моделей. За редким исключением [14,17], они не были проверены на детальных моделях или в эксперименте. Типичным примером существующей неопределенности в вопросе регуляции свертывания крови может служить ситуация с порогом по активации. За последние двадцать лет теоретики предлагали самые разные положительные обратные связи в качестве его регуляторов [6,20−24], в то время как сам порог, являющийся предметом столь разрозненных мнений, экспериментально не обнаружен [25,26].
Подобная скудность доказательств и отсутствие единых представлений приводит нас ко второму заключению: об актуальности детального исследования регуляции свертывания крови.
Но какая стратегия должна быть избрана для такой работы? Изучение сложных систем биохимических реакций, начавшееся в 1960;е годы, привело к созданию проработанных теорий и методов для исследования полиферментных систем, примерами которых могут быть анализ метаболического контроля и теория биохимических систем [27]. Однако, такие методы были эффективны в основном при анализе стационарных, пространственно однородных систем реакций, и потому не играли заметной роли в исследованиях свертывания.
С другой стороны, прогресс в биохимии и вычислительной математике привел к тому, что на рубеже ХХ-го и ХХ1-го века отдельные направления исследования полиферментных систем, методы биоинформатики и математической биологии слились, породив новую дисциплину — системную биологию [28]. Ее целью является детальное, количественное, не допускающее априорной редукции, всестороннее исследование сложных биологических систем. В отличие от теорий метаболического контроля, системная биология не накладывает ограничений на классы изучаемых систем: в ней создаются подходы для изучения систем, которые могут быть пространственно неоднородными, нестационарными, плохо определенными, стохастическими. В рамках системной биологии получила важное развитие идея иерархической, модульной структуры биологических систем [28,29]- в ней также нашел активное применение анализ чувствительности, универсальный метод тестирования и изучения сложных математических моделей [30]. Тем не менее, современный арсенал методов системной биологии не содержит готовых подходов для решения сформулированной выше проблемы исследования регуляции свертывания крови. Попытки применить к свертыванию традиционные варианты анализа чувствительности не выявили новых данных о его регуляции [31,32], а существующие примеры модульного анализа сложных систем не содержат единообразных алгоритмов выделения таких функциональных модулей [33].
Отсюда мы можем сделать третье заключение: об актуальной проблеме развития методов системной биологии и адаптации их к анализу регуляции нелинейных, нестационарных, пространственно неоднородных систем реакций, подобных свертыванию крови.
Какой бы метод анализа сложной системы мы не выбрали или не создали, его реализация невозможна без математической модели. Такая модель должны быть детальной, потому что невозможно понять роль какой-либо реакции в системе свертывания, если такая реакция в модели отсутствует. Далее, такая модель должна быть построена предельно тщательно и должна быть проверена сравнением с экспериментальными данными на всех уровнях организации, потому что даже медленная и внешне незначительная реакция в сложной системе может сыграть контролирующую роль: ярким примером тут может быть ключевая роль медленных обратных реакций в управлении стационарным состоянием в теориях метаболического контроля. Таким образом, произвол в выборе параметров системы и механизмов реакций недопустим, если мы хотим получить модель, способную решить нашу задачу. Наш анализ литературы не выявил математических моделей, способных удовлетворить таким требованиям.
И так мы приходим к последнему заключению: об необходимости работы по созданию новой, детальной, согласованной на всех уровнях организации с экспериментом математической модели свертывания крови.
Подводя итоги нашему рассмотрению, мы можем сделать заключение о практической значимости, важности и актуальности работы по выявлению механизмов регуляции свертывания крови. Однако, такая работа осложняется отсутствием подходящих системно-биологических подходов и математических моделей. Рассмотренные принципиальные проблемы определяют структуру настоящего исследования.
Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови.
Задачи исследования:
1. Разработка алгоритма анализа сложных, нестационарных, неточечных биологических систем.
2. Построение детальной математической модели свертывания кровиэкспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы свертывания для тестирования модели.
3. Выявление молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию процесса свертывания.
4. Применение полученных результатов к практическим задачам — исследованию методов диагностики нарушений свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.
Научная новизна. Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. С их использованием выявлен механизм и динамика порогового поведения системы свертывания крови. Экспериментально показана новая роль фактора VIII в регуляции доставки субстрата к ферменту в комплексе внутренней теназы. Впервые построена детальная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы. Выявлен механизм, с помощью которого внутренняя теназа регулирует пространственную динамику свертывания крови. Теоретически предсказана и экспериментально обнаружена локализация пространственного роста тромба in vitroпоказано, что она определяется путем протеина С. Установлено преимущественное связывание компонентов внутренней теназы с малой субпопуляцией, формирующейся при активации тромбоцитов. С помощью математического моделирования выявлен новый режим регуляции внешнего пути ингибитором пути тканевого фактора. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций.
Научно-практическое значение. Разработанные в работе методы и построенные математические модели могут быть использованы в качестве инструментов для теоретического исследования биохимии, биофизики, фармакологии, как свертывания крови, так и других сетей ферментативных реакций, а также для планирования и анализа экспериментов. Выявленные механизмы отдельных реакций свертывания крови и взаимодействия факторов системы свертывания с фосфолипидными везикулами и активированными тромбоцитами могут быть использованы для создания новых прои антикоагулянтов. Полученные результаты по регуляции динамики свертывания крови позволяют пересмотреть представления. о регуляции каскада и способах фармакологического воздействия. Они открывают путь для создания новых методов диагностики и фармакологического воздействия на систему свертывания.
Основные положения, выносимые на защиту;
1) Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе.
2) Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных.
3) Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций.
Выводы.
1. Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Его особенностью является возможность исследовать нестационарные системы произвольной сложности, в том числе в присутствии диффузионных и конвекционных потоков. Он позволяет выделить в биологической системе функциональные модули, разделить их структурные и управляющие элементы, построить редуцированные математические модели отдельных модулей.
2. Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. Кроме того, в процессе построения модели:
2.1. Выявлен молекулярный механизм сборки комплекса, активирующего фактор X во внутреннем пути свертывания крови. Экспериментально обнаружена новая роль фактора VIII в этом комплексе, которая заключается в регуляции доставки субстрата, фактора X, к ферменту, фактору 1Ха. Впервые построена детальная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы.
2.2. Экспериментально установлено неравномерное связывание компонентов внутренней теназы с активированными тромбоцитами: активация тромбином ведет к формированию малой субпопуляции, клетки которой имеют высокую поверхностную плотность фосфатидилсерина и кальций-зависимым образом связывают преобладающее большинство факторов свертывания.
2.3. Выявлен новый режим регуляции ферментативного комплекса внешней теназы при участии ингибитора пути тканевого фактора.
3. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций. Предсказаны с помощью математической модели и подтверждены экспериментально функции трех модулей:
3.1. Путь фактора V: отвечает за триггерный ответ системы свертывания крови на активирующий сигнал.
3.2. Внутренний путь: регулирует пространственное распространение свертыванияпри этом первостепенная контролирующая роль принадлежит диффузии фактора 1Ха и активации фактора VIII, а дополнительная регуляция осуществляется с помощью реакции активации фактора XI тромбином.
3.3. Путь протеина С: определяет остановку роста тромба посредством переключения активности тромбина тромбомодулином.
4. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии.
Благодарности.
Эта работа в была бы невозможна без помощи и поддержки многочисленных коллег, перед которыми я нахожусь в неоплатном долгу.
В первую очередь, я выражаю благодарность замечательному коллективу, в котором я имею удовольствие работать. Хотя необходимость разумного ограничения объема не позволяет перечислить здесь всех, кто внес вклад в этот проект, я не могу не воспользоваться случаем поблагодарить непосредственных соавторов, которые своими экспериментами, теоретическими расчетами, ценными советами и критикой принимали самое прямое и непосредственное участие в моей работе. Это Анна Николаевна Баландина, Андрей Александрович Бутылин, Вероника Игоревна Зарницина, Сергей Сергеевич Карамзин, Дмитрий Александрович Киреев, Наталья Геннадиевна Коротина, Яна Николаевна Котова, Елена Николаевна Липец, Екатерина Сергеевна Лобанова, Михаил Владимирович Ованесов, Леонид Александрович Парунов, Александра Валерьевна Похилко, Василий Иванович Сарбаш, Елена Ивановна Синауридзе, Алексей Александрович Токарев, Николай Николаевич Топалов, Алексей Михайлович Шибеко.
Огромную роль в наших исследованиях сыграло сотрудничество с коллегами из других лабораторий и институтов, которым я искренне признателен:
• Американский Красный Крест — Наталья Михайловна Ананьева, Николас Греко, Джеймс Куртц, Гэри Морофф, Евгений Львович Саенко, Андрей Гарунович Сарафанов, Шалини Ситхараман;
• Гемофилический центр ГНЦ РАМН — Елена Геннадиевна Лопатина, Константин Геннадиевич Копылов, Ольга Павловна Плющ;
• Институт Иммунологии — Алексей Васильевич Пичугин, Людмила Ивановна Ульянова.
• Институт математических проблем биологии РАН — Эммануил Эльевич Шноль;
• Институт химической физики РАН — Елена Андреевна Ермакова;
• Институт проблем управления РАН — Ольга Леонардовна Морозова.
На различных этапах моей работы (главным образом, связанных с защитами различных квалификационных работ) она подвергалась рецензированию, и я в неоплатном долгу перед людьми, взявшими на себя колоссальный и неблагодарный труд изучить ее и способствовать ее улучшению своими ценными замечаниями. Это Мария Алексеевна Ажигирова, Владимир Николаевич Буравцев, Сергей Александрович Васильев, Майя Александровна Волкова, Борис Наумович Гольдштейн, Елена Евгеньевна Зыбунова,.
Павел Сергеевич Иванов, Геннадий Иванович Козинец, Ирина Львовна Лисовская, Алексей Иванович Лобанов, Евгений Ильич Маевский, Владимир Александрович Макаров, Борис Ефимович Мовшев, Александр Григорьевич Погорелов, Михаил Абрамович Ройтберг, Валерий Григорьевич Савченко, Всеволод Александрович Твердислов, Михаил Александрович Ханин, Дмитрий Петрович Харакоз.
Наконец, не существует слов, которые могли бы выразить мою благодарность руководителю нашей команды, Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову. На протяжении десяти лет он был для меня учителем и примером в науке и за ее пределамиего интеллектуальный вклад в нашу работу исключителена его титанические усилия, призванные обеспечить научную работу в условиях неблагоприятной внешней среды, превосходят всякое воображение. Спасибо!
