Изменения параметров коагуляции при различных условиях подготовки и проведения исследований

Актуальность проблемы. Изучение системы гемостаза все шире входит в клиническую практику. Исследование факторов свертывания необходим) для осуществления правильной диагностики нарушений гемокоагуляции, что способствует улучшению лечения различных, видов кровоточивости, в том числе синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания при терапевтических, хирургических и других заболеваниях, для контроля лечения антикоагулянтамн, тромболитическиш препаратами (Г.Н.Де-тинкина, К. Ы. Дынкина с соавт., 1984, а). В настоящее время предложено большое количество методов исследования, используемых для выявления нарушений в системе гемостаза. В нашей стране первая попытка централизованной унификации методов. исследования системы свертывания крови и фибринолиза была предпринята в 1274 году (Приказ МЗ СССР В 960 от 15.10.74 г. «Об унификации клинических лабораторных методов, исследования»). Однако, предложенные ГО методов исследования гемокоагуляции в настоящее время не удовлетворяют возросшим требованиям к коагулологическим анализам. Совершенствование хирургической техники, углубленное терапевтическое обследование больных, применение новых высокоактивных лекарственных препаратов, кровезаменителей, полимерных соединении и использование лазерной техники требуют более углубленного подхода к систематизации и унификации всех методов исследования. Так, И. П. Бокарев, Е. В. Кабаева (1980) предлагают унифицировать не только отдельные коагулологические методы, но и программы с шшимальным количеством методов, соответственно цели обследования. Однако, в проводимых исследованиях еще недостаточно учитывается влияние внешних факторов при взятии и хранении проб крови.

Как известно, система свертывания крови отличается чрезвычайной лабильностью, реагирует не только на внутренние факторы, способствующие активации свертывания, но и на факторы внешней среды, такие как время и скорость центрифугирования, pH 1фови и реактивов и другие /Д.М.Зубаиров, 1977; Д. М. Зубаиров с соавт., 1983; Л. А. Малолеткина, В. С. Улащик, 1983/. Изменения внешних факторов во многом обусловливают вариабельность коагулологичес-ких показателей, что может существенно исказить истинные показатели гемокоагуляции у больного. В связи с этим разработка стандартных метрологических и методических условий при проведении исследований системы свертывания крови является актуальной задачей.

На важность соблюдения единых условий при выполнении коа-гулологических исследований указывается в ряде работ /Д.М.Зубаиров, Р. И. Литвинов, 1982; В. Т. Морозова с соавт., 1983; Koste-ring, Rasten, 1982/, однако, в этих работах не проводились экспериментальные исследования по изучению влияния внешних факторов на погрешность измерения параметров гемокоагуляции и не учитывалось влияние кадцого фактора в отдельности на результаты коагулологического анализа. Между тем эти исследования имеют большое значение, поскольку дают возможность максимально уменьшить погрешность измерения или, в крайнем случае, учесть ее и выразить количественно, что приведет к повышению точности исследований, позволит сравнивать данные, полученные в различных лабораториях, и дать четкие рекомендации по унификации проведения исследований.

Существенное влияние на результаты коагуляционных исследований оказывают условия хранения исследуемого материала. Сроки максимальной сохранности плазмы для коагуляционных: исследований, по данным различных авторов, варьируют в широких цреде-лах, от 20 минут до 5 часов. Расхождения в допустимых сроках хранения возможно связаны с тем, что выводы о них делались на основании изучения различных показателей коагуляции, без учета стабильности определяемого фактора свертывания крови. В связи с этим не поднимался воцрос и об очередности проведения коагу-лологических исследований.

Следует заметить, что качество диагностики нарушений в системе гемостаза зависит не только от влияния внешних факторов, но и от специфичности методики проведения исследований, ее точности и воспроизводимости. Особое значение это приобретает при диагностике форм врожденных коагулопатий, поскольку нельзя забывать, что за кавдым полученным результатом лабораторного исследования стоит больной человек, и недостаточная точность анализа может привести к ошибочной оценке состояния больного, к неправильной постановке основного диагноза заболевания и связанной с этим тактике лечения.

Все вышесказанное дикутет необходимость унификации условий и методов исследования гемостаза.

Целью настоящей работы явилось повышение точности и достоверности коагулологических исследований, путем установления влияния ряда внешних факторов на погрешность измерения параметров процесса гемокоагуляции и учета этих данных цри отработке режима цроведения исследований для улучшения диагностики цриобретенных и врожденных коагулопатий.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

I. Оценить влияние условии подготовки проб крови на погрешность измерения параметров коагуляции.

Сравнить степень изменения показателей гемокоагуляции при различных сроках хранения плазмы, оставляемой в пробирке после центрифугирования над июрменными элементами и отделенной от них,.

3. Определить значение силикопирования поверхности лабораторной посуды на стабильность коагулологических показателей.

4. Сравнить влияние сроков хранения плазмы на погрешность измерения показателей коагуляции при нормо-, гипо— и гиперкоагуляции.

5. Усовершенствовать ряд методов диагностики нарушении гемо-коагуляции путем повышения же стандартизации и специфичности.

Научная новизна. Впервые количественно измерено и оценено влияние ряда внешних факторов на погрешность измерения параметров гемокоагуляции.

Црозедено изучение влияния сроков хранения плазмы на результаты отдельных показателей гемокоагуляции и установлена очередность проведения коагулологических. анализов, что способст-вз^ет снижению до шнимума искажения истинных значении коагулологических показателей у обследуемого и сравнимости данных, полученных в различных лабораториях.

Впервые установлено, что длительное хранение плазмы больных с гипокоагуляцией приводит к более существенной погрешности измерения показателей гемокоагуляции по сравнению с хранением плазмы больных с гипер ко а^ляциеи к здоровых лиц.

Предложен доступный и надежный способ получения парциалького тромбопластина из коммерческого тромбопластина, не требующий применения дорогостоящих импортных реактивов, исшльзушшй для определения АПТЗ и коагуяяционной активности фактора ЖЕ.

Усовершенствованы методы оценки процесса активации фактора X по «внутреннему» пути, активности факторов УШ и ХШ, сохра-няющке свою специфичность при нарушении в других звенья?: гемостаза. Улучшение этих методов исследования позволит повысить точность диагностики врождённых коагудопатизг и, следовательно, более полное выявление больных этой группы.

Практическая ценность работы.

Данная работа является лабораторно-методическим исследованием, направленным на повышение точности и достоверности коагу-ляционных исследований. Последнее достигается установлением очередности проведения коагуляционных исследований, определением возможных сроков хранения плазмы крови при проведении отдельных исследований.

Выявлены условия хранения материала для коагулологических исследований, снижающие до глннимума искажение истинных значений состояния геьгокоагушдии у обследуемого.

Для увеличения сроков хранения исследуемой плазмы показана необходимость раннего отделения плазмы от форменных элементов и целесообразность хранения ее в силиконированной посуде.

Усовершенствованные методы исследования коагуляшонного звена гемостаза имеют большое практическое значение, так как повышают точность и специфичность исследования в условиях как резкого отклонения от кормы коагуляционного потенциала,' так и скрытых форм нарушений гемокоагулягши, осложняющих заболевания системы 1фови.

На защиту выносятся следующие положения;

I. Одним из основных элементов повышения точности и достоверности методов исследования системы свертывания крови является установление закономерностей влияния на ее параметры внешних факторов: времени и температуры хранения, продолжительности и скорости центрифугирования, свойств контактной поверхности и рН плазмы, что позволяет определить допустимые сроки и оптимальные условия хранения материала для коагулологических исследований.

2. Различная способность факторов свертывания крови к активации в процессе хранения требует установления очередности проведения коагулологических исследований, что особенно важно при выполнении массовых анализов.

3. Стандартизация условий течения реакций свертывания крови in vitro позволяет увеличить диагностическую ценность методов исследования коагуляционного процесса (активированного парциального тромбопластинового времени, активности факторов УШ и Ш).

ВЫВОДЫ.

X. Стандартизация условии проведения исследований является одним из основных элементов повышения точности и достоверности методов для оценки системы свертывания крови. Существенную погрешность цри измерении параметров гемокоагуляции вносят такие факторы, как время и температура хранения цроб крови и плазмы, продолжительность и скорость ее центрифугирования, качество лабораторной посуды.

2. Установлена обязательная очередность проведения отдельных коагулологических исследований, связанная с различным влиянием на них сроков хранения плазмы цри комнатной температуре. Определение активности фактора УШ, толерантности плазмы к гепарину, тромбинового времени и запись процесса свертывания крови на коагулографе необходимо проводить не позднее, чем через I час после взятия крови. Определение времени рекальцифжации плазмы, активированного парциального тромбодластинового времени, каолинового времени, активности факторов протромбинового комплекса и регистрацию процесса свертывания крови на тромбоэластографе можно проводить в срок до двух часов после взятия крови.

3. Для повышения стабильности коагудяционных параметров необходимо сразу после центрифугирования крови проводить отделение плазмы от форменных элементов, в связи с влиянием последних на показатели гемокоагуляции.

4. Использование силиконированной лабораторной посуды для коагулологических исследований позволяет увеличить сроки хранения плазмы до момента определения факторов свертывания до 3 часов.

5. Установлено, что длительное хранение плазмы больных с гипо-коагуляцией, приводит к более существенной погрешности измерения показателей свертывания крови, по сравнению с плазмой больных с гиперкоагуляцией и здоровых лиц. Это указывает на необходимость первоочередного исследования крови больных с гипокоагуляцией.

6. Усовершенствованные методы определения АПТВ и коагуляцион-ной активности фактора УШ с применением стандартизации условий контактной активации свертывания крови и числа тромбоцитов позволяют улучшить диагностику врожденных. коагулопатий.

7. Предложенный метод определения активности фактора Ж у больных с нарушением активации фактора X по «внутреннему» пути, позволяет избежать неспецифического занижения результатов и повышает диагностическую ценность этого теста.

8. Установлены оптимальные условия цроведения коалиционных исследований в лабораторной практике.

— 129 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Диагностика нарушении в системе гемостаза зависит от целого ряда факторов, в том числе, от условии проведения исследований, точности и воспроизводимости методов. На важность условий исследования при выполнении коагуяограммы указывается в работах Д. М. Зубаирова (1977), Д. М. Зубаирова, Р. ЙЛитвинова (1982), I.A. Малолеткинои, В. С. Улащик (1983) и других.

В настоящее время существенно возросли требования к точности и достоверности результатов лабораторных исследований. Обследования большого числа клинико-диагностических лабораторий показали значительное различие результатов исследования одной и той же пробы, проведенных в различных лабораториях. В связи с этим, выявилась необходимость в анализе причин этих явлений и оцределении способов их устранения. Нельзя забывать, что за каждым полученным результатом лабораторного исследования стоит больной человек, и недостаточная точность анализа может привести к ошибочной оценке состояния больного и к неправильной тактике лечения. Разработка стандартных метрологических и методических, условий цри проведении гемокоагуляционных исследований до сих пор остается актуальной задачей.

Целью настоящей работы явилось повышение точности и достоверности коагулологических исследований путем установления влияния ряда внешних факторов на погрешность измерения параметров процесса гемокоагуляции и учета этих данных цри отработке режима цроведения исследовании для улучшения диагностики приобретенных и врожденных коагулоттии.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи: I. Оценить влияние условий подготовки проб крови на погрешность измерения параметров коагуляции,.

2. Сравнить степень изменений показателей гемокоагуляции цри различных сроках хранения плазмы, оставляемой в пробирке после центрифугирования над форменными элементами и отделенной от них.

3. Определить значение силиконирования поверхности лабораторной посуды на стабильность коагул ологических показателей.

4. Сравнить влияние сроков хранения плазмы на погрешность измерения показателей коагуляции при нормо-, гипо— и гиперкоагуляции.

5. Усовершенствовать ряд методов диагностики нарушений гемо-коагуляции путем повышения их стандартизации и специфичности.

Материалом для исследования служила богатая тромбоцитами плазма, полученная из врови 400 здоровых лиц, 25 больных гемофилией, А и 12 больных тромбооблктер1фзпощими заболеваниями сосудов нкших конечностей. Выбор именно этих двух групп больных обусловлен тем, что они резко противоположны по своим коагуло-логическим характеристикам, С одной стороны — замедление процесса свертывания крови (гемофилия А), с другой стороны — усиление гемокоагулящонного потенциала крови (тромбооблитерирущие заболевания). Исследуемую плазму получали из венозной крови, стабилизируванной 3,8 $ раствором основного цитрата натрия в соотношении 5:1. Всего в работе проведено 7059 различных исследований.

Полученные данные обобщены и обработаны методом вариационной статистики, с применением двух основных критериев значимости — юэитерия достоверности различи! Стъюдекта и погрешности измерения.

На важность соблюдения единых условий при выполнении коагу-лологических исследований указывается в ряде работ (Д.М.Зубаиров,.

Р.И.Литвинов (1982) — В. Т. Морозова с соавт.(1983) — Kosrtering, Rasten (1982)). Однако следует отметить, что до последнего времени: лы не встретили работ, в которых были бы приведены данные экспериментального исследования по подробному изучению влияния различных внешних факторов на погрешность измерения параметров гемокоагуляции. Возможно, это связано с тем, что большинство исследователей работают с зарубежными реактивами (хромогенные субстраты), отсутствие стандартных биологических реагентов приводит к ошибкам цри определении факторов свертывания. Мещгу тем эти исследования имеют большое значение, поскольку дают возможность повысить точность исследований и позволят сравнивать данные, полученные в различных лабораториях.

Результаты проведенного наш исследования показали, что несоблюдение условий хранения крови, времени и скорости центрифугирования приводит к существенной погрешности при определении как параметров гемокоагуляции, так и параметров тромбоэластогра-фа и коагулографа. Так, цри увеличении времени хранения крови до I часа существенно возрастает погрешность измерения AIIT3 — 12,3%, толерантности плазмы к гепарину — 21,5%, активности фактора УШ -25,2%, г ТЗГ — 17,3|, Tj КК — 15,7 $. При увеличении времени центрифугирования до 15 минут наибольшая погрешность измерения для времени рекалыщфикации — 14,5 $, АПТВ — 17,4 $, активности фактора. Ж — 27,8 $, ТЭГ — 12,6 $, К ТЭГ — 24,6 $, Т2 КК — 12,8 $, TpA| КК — 14,5/0.

Увеличение скорости центрифугирования до 350? цриводит к увеличению погрешности измерения по сравнению с исходным уровнем АПТВ — 20,4 $, толерантности плазмы к гепарину — 12,1%, активности фактора Ж — 37,3 $ и параметров коагулографа Tj КК — 18,3%, Тр, Т) КК — 41,3 $.

Изменения параметров гемокоагуляции в процессе хранения крови до центрифугирования I час, вероятно, обусловлены выходом активаторов и ингибиторов свертывания крови из форменных элементов, в большей степени из эритроцитов, на что имеются указания в литературе (Е.П.Иванов, 1983). Изменение режима центрифугирования снижает свертываемость испытуемой плазмы за счет оседания тромбоцитов до 22% от уровня исходного режима при увеличении продолжительности. центрифугирования до 15 минут, до 27% - при увеличении скорости центрифугирования до 350 g.

Кроме того, возможно, при изменении условий исходного режима цроисходит разрушение мембран лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов. Высвобождающиеся из них протеазы приводят к ингибиции процесса свертывания крови in vitro и к увеличению, погрешности измерения указанных показателей. Данных литературы по этому вопросу нам не встретилось.

Таким образом, полученные наш данные свидетельствуют о том, что такие внешние факторы как время хранения 1фови, время и скорость центрифугирования должны всегда быть стандартными, что будет способствовать унификации, коагуляционных исследований, повышению их точности и достоверности.

Следующий раздел работы был посвящен изучению влияния сроков хранения плазмы цри комнатной температуре на погрешность измерения параметров коагуляции. Результаты проведенного наш исследования наглядно показали, что хранение плазмы вносит существенную погрешность при измерении ряда параметров процесса гемокоагуляции. Эта погрешность, наибольшая для таких лабильных показателей, как активность фактора УШ — 38,0%, толерантность плазмы к гепарину — 16,6 $, тромбиновое время — 10,?%,'временных параметров кривой коагулографа. (Tj — 24,3%, Т2 — 22,4%) через 2 часа хранения плазмы, и наименьшая: для каолинового времени — 10*7%, АПТВ -10,3 $" активности факторов протромбинового комплекса — 11,2%, параметров ТЭГ (К — 11,6 $, ш — 10,4 $) в этот же срок.

Как следует из вышеизложенного, погрешность измерения, возникающую цри хранении плазмы, необходима учитывать при разработке и стандартизации методик исследования процесса свертывания крови как с помощью ручных биохимических тестов, так и инструментальных.

Как показали полученные нами данные, влияние времени хранения шгазмы на отдельные параметры гемокоагуляции различно. Через один час хранения плазмы наблюдается значимое, по сравнению с исходным, повышение толерантности плазмы к гепарину, удлинение тромбинового времени, уменьшение времени начала и окончания свертывания крови (Тци Т2 КК, р < 0,05). Через два часа хранения плазмы нами отмечено значимое укорочение времени рекальцифи-кации плазмы (р ^ 0,05), повышение толерантности плазмы к гепарину (р ^0,05), увеличение тромбинового времени (р <0,05), повышение активности фактора УШ и факторов протромбинового комплекса (р ^-0,05). Кроме того, отмечалось укорочение г ТЭГ (р < 0,05), Тх КК (р <0,05), Т2 КК Ср <0,001).

На основании полученных данных нами установлена очередность проведения коагудяционшк исследований. Эти исследования проведены совместно с Е. В. Пашкевич и соавт. (1981). Одна группа — наиболее чувствительные к хранению, лабильные показатели, которые необходимо исследовать не позднее чем через I час после взятия крови: активность фактора УШ, толерантность плазмы к гепарину, тромбиновое время и запись процесса свертывания крови на коагу-лографе. Вторая группа — более стабильные показатели, определение которых, можно проводить в срок до 2 часов от момента взятия крови: время рекальцификации плазмы, каолиновое время, активность факторов цротромбинового комплекса и регистрация процесса свертывания крови на тромбоэластографе. Наши, данные согласуются с даннши. Lestin (1977, 1978).

Проведенное нами сравнительное изучение сохранности плазмы для коагуляционных исследований при комнатной температуре и при +4° С показало, что хранение плазмы в течение 3 часов в условиях комнатной температуры и ери +4°С цриводит к изменениям наиболее лабильных показателей АПТВ (р ^ 0,05), толерантность плазмы к гепарину (р? 0,001), активность фактора Ж (р ^ 0,01).

Н&льзя не согласиться с данными, представленными в работах Gjonnes (1972), Palmer" Gralmik (1982) о том, что хранение плазмы для ко абляционных исследований при +4° С особого преимущества не дает. Через 6 часов хранения плазмы при +4°С наблюдается значительная активация свертывания крови помимо контактной активации еще и за счет длительного влияния пониженной температуры. Наш отмечено в этот срок статистически значимое укорочение времени рекальцдоикации плазмы, каолинового времени, повышение толерантности плазмы к гепарину, укорочение временных приборных характеристик — г ТЭГ, Tj и Т2 КК.

Кроме того степень изменений показателей гемокоагуляции зависит и от поверхности, контактируемой с плазмой, а именно стекло, что приводит к повышению гемокоагуляционного потенциала крови: укорочение времени рекальцификации плазмы (р < 0,001), повышение толерантности плазмы к гепарину (р * 0,001), укорочение каолинового времени (р ^0,05). Наблюдалось также в этот срок изменение параметров ТЭГ и Ж, а именно укорочение г ТЭГ (р -?0,05), укорочение Tj и Т2 кривой коагулографа (р <0,05). Полученные нами, данные согласуются с данными литературы о том, что при хранении плазмы в условиях низких, температур (+4°С) возникают процессы, связанные с активацией фактора УП на холоду. Последняя опосредована активацией каллинреин-кининовой системы (Salto, Ratnoff, 1975j Man-Chin Poon et al., 1982; van Deijk et al., 1933).

Мы рекомендуем хранить плазму для коагуляционных исследований, как к большинство исследователей (Б. П. Бал уд, а с соавт., 1980; Е. П. Иванов, IS83), отдельно от эритроцитов. Проведенные нами исследования по изучению влияния сроков хранения плазмы, не отделенной после центржугирования от форменных элементовэритроцитов, на параметры г емокоагуляции показали, что эритроциты оказывают влияние на процесс свертывания крови. Было установлено, что изменения параметров г емокоагуляции в плазме, хранившейся над форменными элементами, происходят на один час раньше, по сравнению с отдельно хранившейся плазмой.

Через I час хранения плазмы над эритроцитами отмечены, по сравнению с исходным уровнем, значимые, но разнонаправленные изменения параметров гемокоагуляции: укорочение каолинового времени (р < 0,001), повышение толерантности плазмы к гепарину (р <0,001), увеличение протромбинового индекса (р < 0,001), а также удлинение времени рекальцификации плазмы (р < 0,05) и АПТВ (р < 0,05). Кроме того, в этот срок наблюдалось укорочение параметров тромбоэластогршжы и кривой коагулографа (г.ТЗГ, р < 0,05, та ТЭГ, р <0,001, Tj КК, р < 0,05). Через 2 и 3 часа хранения плазж отмечались еще более выраженные изменения в сторону гиперкоагуляции, о чем свидетельствовало укорочение времени река ль щпшсации (р <0,001), АПТВ (р <0,001), каолинового времени (р <0,031), тромбинового времени (р < 0,001), повышение толерантности плазмы к гепарину и активности фактора УШ (р < 0,001), укорочение г и та ТЭГ (р ^ С, 001), Тх КК (р * 0,01), Т2 и Трф КК (р < 0,05).

Повышение гемокоагуляционного потенциала плазмы в процессе хранения над форменные элементами мы объясняем прежде всего контактной активацией свертывания в процессе хранения плазмы, что согласуется с данными литературы (В.П.Балуда с соавт., 1980). При хранении плазмы происходит разрушение тромбоцитов, выделение из них. активных субстанций — ф 3, ф 4, которые ускоряют процесс свертывания крови. Тромбопластические субстанции, выделяющиеся из эритроцитов в процессе хранения, также ускоряют процесс свертывания крови и способствуют повышению геглокоагуляционного потенциала плазмы (Е.П.йванов, 1983). Таким образом, наши данные свидетельствуют о необходимости отделения плазмы от форменных элементов при исследовании параметров гшокоагупяции, для того чтобы избежать влияния форменных элементов на исследуемые показа-тали.

С целью улучшения условий сохранности плазмы, используемой для коагрядаонных исследований, нами проведена серия опытов (20), в которых взятую кровь и плазму хранили до исследования в пробирках, покрытых силиконом ГКЕ-94. Проведенные исследования показали, что хранение плазмы в силиконовых пробирках при комнатной температуре создает лучшие условия для ее сохранности по сравнению со стеклянными цробирками, поскольку большинство показателей гемокоагуляции, за исключением. АПТЗ (р < 0,05), активности фактора УШ (р ^0,02) в течение всего срока наблюдения, составлявшего 3 часа при комнатной температуре, не отличались от исходных значений. Изменение температурного режима хранения (+4°С) ухудшает сохранность плазмы, поскольку в этих условиях дане в пробирках, покрытых силиконом, происходит «холодовая активация» процесса свертывания крови (укорочение АШВ, р 0,001, повышение активности фактора УШ, р < 0,002). В связи с этим мы считаем целесообразным брать кровь и хранить плазму для коагуля-ционннх исследований при комнатной температуре в пробирках, покрытых силиконом. Наши данные согласуются с данными, описанными в литературе (van Deijk et el., 1983). Как известно, степень изменений показателей коагуляции зависит от поверхности, контакти-руемой с плазмой. Применение силикона создает условия низкой контактной активации, по сравнению со стеклянными пробирками. Поэтому хранение плазмы в простой стеклянной посуде при комнатной температуре сопровождается более выраженным изменением показателей коагуляции, а именно повышение, гемокоагуляционного потенциала, по сравнению с плазмой, хранившейся в пробирках покрытых силиконом (Seligsohn et al., 1979; Palmer et al., 1982).

Следящий раздел работы посвящен исследованиям рН плазмы в процессе хранения с целью выявления дополнительных причин изменений параметров гемокоагуляции в процессе хранения плазмы. Измерение рН плазмы проводилось сразу после ее получения, через 60, 120 и 180 минут хранения при комнатной температуре и через 180 минут хранения в условиях комнатного холодильника. Как показали наши данные, при хранении плазмы происходит изменение ее рН с тенденцией в щелочную сторону через 2 часа хранения при штатной температуре (IQ =¦ 7,78, Ij = 7,85), так и при +4° С (Х2 = 7,85). Этот факт мы приняли во внимание при объяснении тех изменений показателей гемокоагуляции, которые отмечены нами при хранении плазмы при комнатной температуре, а именно, повышение гемокоагуляционного потенциала крови. Кроме того, изменение рН плазмы в процессе хранения также подтверждает необходимость более раннего определения показателей гемокоагуляции, в срок до.

2 часов хранения плазмы.

Следует согласиться с мнением ряда авторов (iTeel, Richter et al., 1975; Seegers, I981, a), также показывающих, что длительное стояние плазмы в течение 3 часов и более, встряхивание и перевешивание плазмы пипеткой сопровождается сдаигом pH в щелочную сторону и изменениями показателей коагуляции.

Нами было изучено также влияние времени хранения плазмы на погрешность измерения параметров свертывания крови у больных с выраженной гипери гипокоагуляцией. Наш выбрано две группы больных с разнонацравленннми нарушениями в системе гемокоагуля-ции. Одна группа — больные тромбооблитерирующимн заболеваниями сосудов нижних конечностей («гиперкоагуляция»), вторая — больные гемофилией, А («гипокоагулядая»). Вычисленные наш погрешности измерения, вносимые хранением плазмы, показали, что в группе больных с гиперкоагуяяцией погрешность измерения показателей коагуляции близка к таковой у доноров, а при гипокоагуляции повышается.

Для времени рекальцификации погрешность измерения при двух часах хранения плазмы у доноров составила 15%, цри гиперкоагуля-ши — 22,9%, при гипокоагуляции — 34,2%, тромбиновое время у доноров — IC,?v, цри гиперкоагуляции. — 10,4%, активность факторов протромбинового комплекса у доноров — 11,2%, при гиперкоагуля-цки — II, И, АПТВ у доноров — 10,3%, при гипокоагуляции — 19,7%.

Кроме того, нами вычислена погрешность измерения параметров ТсГ и КК в процессе хранения плазмы этих групп больных. При состоянии гиперкоагуляции влияние времени хранения плазмы на значения параметров оказалось несущественным, хотя для временных параметров г, к ТЭГ, Тт, Т2, Т^ КК наблюдалась некоторая тенденция к укорочению, что может быть объяснено усилением всех процессов метаболизма при гиперкоагуляции. При исследовании плазм от больных гемофилией влияние времени хранения было более выраженным: через I час хранения существенно возрастает погрешность измере.

Через 2 и 3 часа хранения плазмы погрешность измерения была более существенной., за исключением та ТЭГ (10,4 $).

Большая погрешность измерения параметров коагуляции в группе больных с гипокоагуляцией, по сравнению с таковой с гиперкоагуляцией, вероятно, связана с тем, что у больных с гипокоагуляцией имеются более глубокие нарушения процесса свертывания крови, а именно значительное удлинение как общих, коагуляционных. тестов — времени свертывания венозной крови, времени рекальшзГ-якации плазмы, снижение толерантности плазмы к гепарину, так и тестов, характеризующих активацию фактора X по «внутреннему» пути: удлинение АПТЗ, снижение коагуляционной активности фактора УШ. Из этого следует, что гемокоагуяяционный потенциал у больных гемофилией истощен, в отличие от такового в группе больных с тромбо-облитерирутэщими заболеваниями сосудов нижних конечностей и здоровых лиц. В связи с этим при длительном хранении плазмы таких больных погрешность измерения коагуляционных показателей значительно превосходит допустимый уровень 1С$.

Полученные нами данные по изучению влияния сроков хранения плазмы при состояниях гипои гиперкоагуляции на погрешность измерения параметров гемокоагуляции свидетельствуют о необходимости как можно более раннего исследования образцов плазмы (в первый час после получения плазмы), и особенно, от больных с ги-шкоагуляцией, поскольку при длительном хранении возникают погрешности измерения параметров гемокоагуляции, что может иметь особое значение при диагностике форм врожденных коагулопатий ы.А.Котовщикова, Д. И. Левитина, П. В. Хролова с соавт., 1582).

Проведенные ншж исследозашш показали, что такие внешние факторы, как времл и. температура хранения, продолжительность и скорость центрифугирования, рН плазмы являются везаными факторам, которые в значительной степени оказывают влияние на погрешность измерения параметров коагуляции. В связи с вышеизложенным необходимо уделить особое внимание стандартизации условий проведения исследований. При описании методик проведения исследований необходимо четко регламентировать время и условия хранения, центрифугирования, прочих воздействий на пробы крови, устанавливая допустимые границы значений влияющих факторов.

Соблюдение стандартных условий проведения методики, учет ее особенностей и применимости в условиях коагулологического статуса конкретного больного является необходимым условием кап чественной диагностики. Настоящий раздел работы был посвящен * усовершенствованию методов диагностики врожденных коагулопатий для повшения их специфичности и стандартизованности.

Как известно, для характеристики активации фактора X по «внутреннему» пути в лабораторной практике используются такие тесты, как время свертывания крови и время рекальцификации плазш. Однако, эти тесты малочувствительны к умеренным дефектам свертывания. Значительная вариабельность показателей при воспроизводимости исследований обусловлена отсутствием стандартных условий контактной активации, а также зависит от числа кровяных пластинок. Этих недостатков лишен рекомендуемый наш метод АПТВ, поскольку в этом тесте достигается стандартная контактная активация фактора XII с помощью каолина и стандартизация числа тромбоцитов. При этом в качестве заменителя кровяных пластинок мы применяли парциальный тромбопластин, приготовленнее КЗ коммерческого тромбо пластика — Тромбо пластин из кадавер-ного мозга производства Кировского НИК ГПК (Л.П.Напаян, П.В.Хро-лова, 1980). Парциальный тромбопластин заменяет в решениях in vitro 3 фактор тромбоцитов, в связи с этим, недостаточное количество тромбоцитов у больных не отражается на результатах этого теста.

Вариабельность MTB монет быть существенной и, как показали исследования Barrowcliffe, Gray? IS8I), зависит от источника фос-фолишща, времени активации, используемого контактного продукта. Наш: показано преимущество использования парциального тромбопластина, приготовленного из кадаверного мозга, по сравнению с таковым, приготовленным из ткани мозга кролика. Использование препарата парциального тромбопластина из коммерческого тромбопластина дает меньший разброс данных: около среднего значения (V = 7,2), по сравнению с таковым при использовании препарата из ткани мозга кролика (v = 13,6), что делает метод ШТВ более точным.

Определение стабильности препаратов в процессе хранения показало, что ПТ, приготовленный нами из кадаверного мозга (коммерческий тромбопластин) сохраняет свою первоначальную активность более 3 месяцев при температуре хранения -20°С. ПТ из ткани мозга кролика в тех яе условиях, хранения постепенно, в течение 2 месяцев теряет активность, что осложняет работу, так как требует дополнительных определений по его стандартизации.

Метод определения АПТВ чувствителен к скрытым дефектам свертывания, и в отличие от тестов — времени свертывания крови, времени рекальцкфикации плазмы, зависит от присутствия в плазме факторов: ХП, XI, IX, УШ, X, У, I, П, а такие от факторов кэлли-креин-кининозой системы, усиливающих активацию ХП и Л факторов.

Наибольшая чувствительность MTB наблюдается на ранней стадии свертывания, а именно при снижении ХП, XI, IX и УШ факторов. Менее чувствителен этот тест на поздних стадиях процесса свертывания, то есть к протромбину и фибриногену. Поэтому наибольшее к значение тест АПТВ приобретает при диагностике врожденных коагу-лопатий (гемофилия А, болезнь Виллебранда).

На основе теста АПТВ определены условия исследования коагу-ляционной активности фактора УШ (Л.П.Папаян, П. В. Хролова, 1983). Наш проведены сравнительные исследования активности фактора УШ в группе больных гемофилией, А двумя методами: методом Nils son и методом, основанным на АПТВ. При определении активности фактора УШ методом Nils son получаются более завышенные результаты, по сравнению с методом, основанным на АПТВ, что указывает на большую чувствительность последнего.

В настоящее время для исследования коагуляционной активности фактора УШ применяют два метода: одноступенчатый и двухступенчатый. Первый основан на определении АПТВ (Р.А.Рутберг, 1972; Hardisty, Macpherson, 1962; Austen, Rhymes, 1975; Bloom, 1982), второй на определении времени генерации тромбопластина (Л.Н.Тарасова, 1980; Biggs, 1964,1976). По данным Л. Н. Тарасовой, Т. И. Халтуриной (1983), Barrowcliffе, Grav (1978) чувствительность двухступенчатого метода выше, однако, из-за технических, трудностей воспроизведения его, большинство авторов применяют одноступенчатый метод, который основан на изменении скорости образования тромбопластина в плазме больных гемофилией в присутствии фосфо-лкпида, активирующего компонента и фактора Ж. исследуемой плазмы.

В качестве источника фосфолишща использовали ПТ, приготовленный из коммерческого тромбопластина (тромбопластин из када-верного мозга), а для создания стандартных условий контактной активации применяли каолин. Простота воспроизведения, точность и достаточная чувствительность метода определения активности фактора УШ позволяют рекомендовать его для практического применения.

Нами также определены условия исследования активности фактора ХШ в случаях нарушения 1 фазы свертывания крови, фи введении в исследуемую систему тканевого тромбопластина (тромбоплас-тин из кадаверного мозга, выпускаемый отечественной промышленностью для лабораторных целей), исключается влияние нарушения процесса свертывания крови, связанное с дефектом активации фактора X по «внутреннему» пути. Цри определении активности фактора ХШ по данному методу у больных гемофилией выявлялись нормальные его показатели, в то время как при определении фактора ХШ по методу, описанному В. П. Балудой с соавт. (1965), в модификации М.А.Котов-щиковой (1968) отмечались сниженные результаты (П.В.Хролова, Л. П. Папаян, 1975). Мы считаем, что данные Л. Н. Тарасовой, С.А.Сад-кова о нарушении цри гемофилии не только активации фактора X по «внутреннему» пути, но и снижении активности фактора ХШ, связаны с непригодностью оригинальной методики в условиях резкого нарушения тромбопластинообр азования.

Изменения указанных показателей являотся следствием нарушенной активации фактора X по «внутреннему» пути, поэтому мы рекомендуем использовать метод определения активности фактора ХШ с добавлением тромбопластина, чтобы избежать получения «ложных» результатов у этой группы больных.

Таким образом, стандартизация методов, используемых цри проведении исследований системы гемостаза, повышение их специфичности позволит снизить погрешность измерения, сделает сравнимыми результаты, полученные в различных лабораториях, повысит точность диагностики врожденных, и приобретенных коагулопатий и будет способствовать более полному выявлению больных этой группы.

Основные положения представленной работы могут быть сформулированы в 8 выводах.