Экологические аспекты ферментативного гидролиза древесины ивы (Salix caprea) предобработанной паровым взрывом

Практически любая деятельность человека приводит к образованию и накоплению большого количества твердых, жидких и газообразных отходов, приводящих к загрязнению воды, атмосферы и почвы. Значительную долю составляют лигноцеллюлозные отходы, источником которых являются деревоперерабатывающая, лесная промышленность, сельское хозяйство и городские отходы. Растущий уровень загрязнения окружающей среды стимулирует поиск альтернативного и экологически безопасного способа переработки отходов, в первую очередь — лигноцеллюлозных, являющихся важнейшим компонентом сырьевых ежегодно возобновляемых ресурсов биосферы.

Лигноцеллюлозные субстраты могут компенсировать дефицит невосполнимых природных ископаемых, путем их конверсии ферментами микроорганизмов в сахара и последующего или одновременного сбраживания Сахаров в этанол.

Эффективность конверсии лигноцеллюлозного сырья зависит от потребления трех основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина.

Наиболее доступным компонентом, составляющим основную часть растительных материалов, является целлюлоза — ее ежегодный прирост составляет 10¹/тонн. В ферментативном разрушении целлюлозы участвует комплекс целлюлолитических ферментов, таких, как целлобиогидролазы и эндоглюканазы, которые могут быть выделены из различных грибных и бактериальных источников. Эти ферменты могут использоваться не только для получения из целлюлозы глюкозы, которая, в свою очередь, может быть сырьем для микробиологического синтеза различных ценных продуктов, но и для выделения лекарственных веществ (стероидов) из растенийдля улучшения качества растительных маселкак добавка в комбикорма для животных (Лобанок и др., 1988; Тиунова, 1981) — для «каменной отмывки» тканей, а так же для производства стиральных порошков. Последние две точки приложения особенно бурно развиваются в последние годы. Это связано с тем, что были обнаружены новые термостабильные эндоглюканазы, способные работать в более щелочных условиях, чем ферменты из традиционного продуцента Trichodeima reesei. Повышенный интерес к нейтральным эндоглюканазам связан с возможностью их использования для создания pH-совместимых ферментных комплексов для одновременного сбраживания гидролизных Сахаров (Lange, 1993).

Хотя промышленное получение целлюлаз было начато еще в 60-х годах, до сих пор проблема получения глюкозы ферментативным гидролизом целлюлозы не решена. Это связано с тем, что целлюлоза представляет собой водонерастворимый полимер со сложной надмолекулярной структурой, которая трудно поддается действию фермента. Биохимические механизмы действия как отдельных целлюлаз, так и целлюлазного комплекса в целом также недостаточно полно изучены.

Для повышения реакционной способности субстрата обычно предусматривают его предварительную обработку. Наиболее перспективным способом является использование парового взрыва, который представляет собой кратковременную обработку древесных опилок или щепы нагретым водяным паром при повышенном давлении с последующим мгновенным снижением давления до одной атмосферы (Гравитис, 1987). В процессе предварительной обработки происходит дезацетилирование гемицеллюлоз с высвобождением уксусной кислоты, гидролизом гемицеллюлоз до мономеров и частичным разрушением лигноуглеводных связей, выплавление лигнина из срединной пластинки. В результате увеличивается удельная поверхность целлюлозы, доступная для ферментативного воздействия, что повышает степень конверсии субстрата.

Однако, ферментативное разложение лигнина является процессом еще более трудным, чем гидролиз целлюлозы. В разрушении лигнина принимают участие такие ферменты, как лигниназа, Mn-пероксидаза (Kaushik & Bisaria, 1989; Wariishi et al. 1991; Perie & Gold 1991) и лакказа (Shimada et al. 1980; Munoz et al., 1997) которая в последнее время находят множество применений в иммуноанализах, в изготовлении биосенсоров и очистке промышленных сточных вод, хотя низкий рН-оптимум активности промышленных ферментов затрудняет их использование (Crecchio et al. 1995; Zouari et al. 1994; Yaropolov et al. 1994; Cliffe et al. 1994; Gardiol et al. 1996).

Таким образом, все компоненты растительных отходов могут быть утилизированы с применением различного набора ферментов грибного и бактериального происхождения. В настоящее время проблема заключается в повышении эффективности и технологичности процесса до такой степени, чтобы он мог конкурировать с традиционными методами получения энергии из природных ископаемых.

Цели и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось исследование ферментативного гидролиза древесины ивы, предобработанной паровым взрывом и изучение возможных путей повышения эффективности гидролиза.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи: — подбор наиболее эффективных условий проведения ферментативного гидролиза взорванного субстрата с применением наиболее оптимальных соотношений ферментных препаратов целлюлолитического действия из Trichodeima reesei и Aspergillus foetidus;

— обоснование целесообразности проведения гидролиза в нетрадиционных условиях без предварительной отмывки и перемешивания реакционной среды в ходе процесса;

— определение ферментного состава целлюлазного комплекса, обладающего пониженной степенью адсорбции на субстрате по сравнению с исходным комплексом, и при этом сохраняющего высокую осахаривающую способность;

— изучение возможности выращивания микроорганизмов на полученных гидролизатахвыявление перспективных штаммов микроорганизмов, способных продуцировать pH-устойчивые ферменты целлюлазного (эндоглюканазы) и лигниназного (лакказы) комплексов и изучение особенностей действия этих ферментов;

Научная новизна работы

Предложен новый нетрадиционный и экологически безопасный способ осахаривания целлюлозосодержащего материала (древесина ивы (Salix caprea), предобработанная паровым взрывом) ферментами микроорганизмов. Подобраны условия проведения гидролиза, которые отличаются от общепринятых отсутствием перемешивания реакционной среды. Это позволят достичь высокой исходной концентрации субстрата и получить высокую концентрацию продукта реакции.

Впервые показано, что причина быстрого прекращения гидролиза и слабого роста микроорганизмов на гидролизатах обусловлена низким значением pH неотмытого субстрата, а также отмечено незначительное влияние водорастворимых ингибиторов целлюлаз и роста микроорганизмов.

Современные представления о молекулярных механизмах деструкции кристаллической целлюлозы целлюлазным комплексом предусматривают обязательное участие целлобиогидролазы I. Однако, в ходе работы установлено, что эффективный гидролиз взорванного материала может осуществляться целлюлазным комплексом, целлобиогидролазная компонента которого представлена преимущественно целлобиогидролазой II. Одновременно показано, что такой комплекс обладает низкой степенью адсорбции на субстрате и исследована возможность его многократного рецикла в сравнении с известной регенерацией ферментативной активности путем сдвига адсорбционного равновесия добавлением к лигнифицированному остатку новых порций субстрата.

Проведен результативный поиск продуцентов эндоглюканаз и лакказ, имеющих широкий рН-оптимум, среди микроорганизмов, обитающих в таких неблагоприятных условиях среды как засоленные почвы пустыни Гоби и Южно-Вьетнамские почвы, обработанные дефолиантами в годы войны с США. Обнаружен, ранее не описанный у известных ферментов, эффект активации в нейтральной области рН лакказы из штамма РешсШшт ер. 4−6 ионами СГ, что, по-видимому, является результатом качественных изменений в структуре фермента.

Практическая ценность работы

Промышленное использование технологического процесса в изученных условиях может привести к значительному удешевлению гидролизных Сахаров за счет отказа от постоянного перемешивания реакционной среды, гидролиза при высокой плотности субстрата, отсутствия его предварительной отмывки, и рецикла фермента, возможного при использования целлюлазных комплексов, слабо сорбирующихся на субстрате.

Нейтральные и щелочные эндоглзоканазы из отобранных микроорганизмов могут найти применение в текстильной промышленности и в производстве стиральных порошков, а так же для создания новых ферментных композиций.

Наконец, обнаруженный эффект активации лакказы из Penicillium sp. ионами С1 «может значительно повысить эффективность этих ферментов при деструкции лигнина, иммуноанализах, очистке промышленных сточных вод и др.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

The 9th European Bioenergy Conference on Biomass for energy and the environment, Denmark — 1996.

19th symposium on biotechnology for Fuels and Chemicals, Colorado Springs, Colorado, USA — 1997.

Third Biomass Conference of the Americas, Quebec, Canada — 1997.

International Conferens on Sustainable, Agriculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany — 1997.

Конференция молодых ученых, посвященная 850-летию г. Москвы, Москва-1997.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

1. Литературный обзор

1. Билай Т. И. Термофильные грибы и их ферментные свойства. — М.: Наукова думка, 1986, — 172 с.

2. Вуд Т. М. Экспериментальные данные и предположения о механизме ферментативного расщепления целлюлозы.//16 конф. ФЕБО: Материалы. М., 1984, с. 116

3. Гиндилис А. Л., Жажина Е. О., Баранов Ю. А., Карякин A.A., Гаврилова В. П., Ярополов А. И. выделение и свойства лакказы из базидиального гриба Coriolus hirsutus (Fr.) Quel //Биохимия, — 1988, — T.53, вып.5.-С.735−739.

4. Гравитис Я. А. Теоретические и прикладные аспекты метода взрывного автогидролиза растительной биомассы. // Химия древесины, — 1987, — N5, — с. З-21.

5. Грачева И. М. Технология ферментативных препаратов, — М.: Мир, 1987, — 335 с.

6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т. 1. М., Мир, 1982, 389 с.

7. Запрометов М. Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М: Наука, 1993, — 272 с.

8. Запрометов М. Н. Основы биохимии фенольных соединений. М. Высшая школа, — 1974.-212 с.

9. Клесов A.A., Рабинович M.JI. Ферментативный гидролиз целлюлозы. II Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников // Биоорганическая химия, т.6, N 9 М, — 1980.

10. Клесов A.A., Рабинович M.JI., Синицин А. П., Чурилова И. В., Григораш С. Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. 1. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорг. химия, 1980. Т. 3. N8. с. 1225−1242.

11. Клесов А. А, Черноглазов В. М., Рабинович M.JI., Синицин А. П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы//Биоорган. химия. 1982.Т. 8. N 5. С. 643−651.

12. Клесов A.A. Ферментативный катализ. Ферментативная деструкция полимеров (Полимерные субстраты)., М., МГУ, 1984, 216 с.

13. Краева Н. Э., Рабинович М. Л., Клесов A.A., Березин И. В. Промотируемая целлюлозой и ее производными деградация низкомолекулярного хромогенного субстрата под действием эндоглюканазы Trichoderma уШе//Докл.АН СССР. 1986.T.290.N2. С.484−486.

14. Клесов A.A., Черноглазов В. М., Ермолова О. В., Елкин В. В. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллю лозных материалов. //Биотехнология, 1985, N 3, 106−112.

15. Лакин, Г. Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш.шк., 1990, — 352 е.: ил.

16. Левит М. Н., Шкраб A.M. Лигнин и лигниназа.//Биоорганическая химия,-1992.-Т.18- N3. с. 309−344.

17. Леонович A.A., Оболенская A.B. Химия древесины и полимеров, — М.: Лесная промышленность, — 1988, — 146 с.

18. Леонтьевский Л. А., Головлева JI.A. Внеклеточные лигнинразрушающие ферменты гриба Panus Tigrinus // Биохимия, — 1990, — Т. 55, вып. 3, — С.423−430.

19. Лобанок А. Г., Бабицкая В. Г., Богдановская Ж. Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: белок и другие ценные продукты. М.: Наука и техника, 1988, — 261 с.

20. Лобанок А. Г., Астапович Н. И., Михайлова Р. В. Биотехнология микробных ферментов. М.: Наука и техника, 1989, — 205 с.

21. Логинова Л. Г. Термостабильные целлюлазы и термостабильные микроорганизмы//Итоги науки и техники, серия биотехнология, т. 10, — М.: 1988, — 221 с.

22. Логинова Л. Г., Иванова И. И., Гужова И. П. Целлюлазы термофильных микроорганизмов//Проблемы биоконверсии растительного сырья, — М.: Наука, 1986.-с.165−192.

23. Митькевич О. В., Синицын А. П., Клесов A.A. О механизме действия полиферментных целлюлолитических препаратов на растворимую целлюлозу.//Прикл. Биохим. Микробиол., 1985, 21, вып. 2, 213−218.

24. Рабинович M. JL, Клесов A.A., Григораш С. Ю., Калнина И. А., Черноглазов В. М. Ферментативный гидролиз целлюлозы. VI. Адсорбция целлобиазы целлюлазного комплекса на целлюлозе.//Биоорг. Химия, 1982, 8, N 1, 84−95.

25. Рабинович M. JL, Черноглазов В. М., Клесов A.A. Изоферменты эндоглюканазы в целлюлазных комплексах: различное сродство к целлюлозе и неодинаковая роль в гидролизе нерастворимого субстрата//Биохимия. 1983. Т.48. N 3. С. 369−377

26. Рабинович M. JL, Нгуен Ван Вьет, Клесов А. А. Синергизм при совместном действии эндоглюканаз с высоким и низком сродством к целлюлозе//Прикл. биохимия и микробиология. 1986. Т. 22. N 1. С. 70−79.

27. Рабинович M. JL, Нгуен Ван Вьет, Клесов A.A. Адсорбция целлюлолитических ферментов на целлюлозе и кинетика действия адсорбированных ферментов: Два типа взаимодействия ферментов в нерастворимом субстрате//Биохимия. 1982. Т. 47. N 3, С. 465−477.

28. Рабинович M.JI., Черноглазов В. М., Клесов A.A. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизмы действия целлюлаз // Итоги науки и техники, серия биотехнология, том 11.-М.-1988,-223 с.

29. Рабинович M. JL Полисахаразы: новый материал для белкового дизайна // Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья. Сыктывкар, 1992, — 13 с.

30. Рабинович M. JL, Клесов A.A., Березин И. В. Механизм переноса фермента, адсорбированного на поверхности нерасворимого субстрата.//Доклады АН СССР. 1984. Т. 274. С.758−763

31. Рабинович M. JL Механизм ферментативного разложения целлюлозы: роль адсорбции ферментов/ТМикробиология и биохимия разложениярастительных материалов/ Под ред. Скрябина Г. К., Головлева E. JL, Клесова A.A. M.: Наука, 1988. С. 70−108.

32. Рабинович M. JL, Клесов A.A., Березин И. В. Кинетика действия целлюлолитических ферментов из Geotrichum candidum. Вискозометрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы. -Биоорган, химия. 1977, т. 3. N 3. с. 405−414.

33. Родионова Н. А. Ферментативное расщепление целлюлозы//Целлюлазы микроорганизмов.- М.: Наука, 1981, — 213 с.

34. Синицын А. П., Митькевич О. В., Калюжный C.B., Клесов А. А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса//Биотехнология. 1987, 3, N 1.С. 39−46.

35. Синицин А. П., Ковалев Г. В., Меса-Мапреса С. Р. Сравнительное изучение влияния различных методов предобработки на скорость гидролиза целлюлозосодержащих материалов. // Химия древесины, — 1984, — N5, — с. 60−71.

36. Синицин А. П., Клесов A.A., Рабинович М. Л., Гусаков A.B., Морозов A.M. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы.// Итоги науки и техники, серия биотехнология, том 12.-М.-1988.-153 с.

37. Тиунова H.A. Применение целлюлаз//Целлюлазы микроорганизмов. М.: Наука, 1981.-213.

38. Фогарти В. М. Микробные ферменты и биотехнология.- М.: Агропромиздат, 1986.-213 с.

39. Холькин Ю. И. Новые методы гидролиза растительного сырья. Обзорная информация Главмикробиопрома, сер. IV. М., 1985, 39 с.

40. Ander, P., Eriksson, K.-E. Lignin degradation and utilisation by microorganisms.-In: Progress Ind. Microbiol. Amsterdam, 1978, — Vol. 14, — P. 1−58.

41. Atchison, J.E. Nonwood Fiber Could Play Major Role in Future U.S.Papermaking Furnishes// Pulp & Paper, July, 1995. P.35

42. Becker, D.K., Emert, G.H. Developments in Industrial Microbiology. General Meeting of the Society for Industrial Microbiology, St. Paul, Minn., 1982, vol. 24, 123−129.

43. Bhikhabhai, R., Johansson, G. and Pettersson, G. Isolation of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei QM 9414. J. Appl. Biochem., 6, 366, 1984.

44. Bower, В., Larenas, E., Swanson, B. and Ward, M. Trichoderma reesei EG III expression and modification. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Agriculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany. June, 1997.

45. Bungay H.R., Garcia M.A., Foody B.F. Treatment and characterization of exploded wood fraction.//Biotechnol. Bioeng. Symp., 1983, N 13,121−127.

46. Chenzy H., Henrissat В., Vuong R., Schulein The action of 1,4-P-D-glucan cellobiohydrolas on valonia cellulos microcristals: An electron microscopic study//FEBS Letters. 1983. V. 153. P.113−118.

47. Chenzy H., Henrissat B. Electron microscope study of the enzymatic hydrolysis of Valonia cellulos//Carbohyd. Polym. 1983. V. 3. P. 161−173.

48. Chernoglazov, V.M., Ermolova, O.Y. and Klyosov, A.A. The characterization and Purification endoglucanases from Trichoderma reesei./ZBiokhimiya, 1985, 50, 1108−1119.

49. Cliffe, S., M. S. Fawer, G. Maier, K. Takata H G. Ritter. 1994. Enzyme is Valued for Phenolic Contentses of Natural Juice.// J. Agricultur and Food Chem. 42:18 241 828.

50. Coughlan, M.P. The properties of Fungal and Bacterial Cellulases with comment on their Production and Application//Biotechnology and Genetic Engineering. 1985, — Vol.3.

51. Davies, G.J., Tolley, S., Wilson, K., Schulein, M, Waldike, H.F. and Dodson, G. (1992). Crystallisation and Preliminary X-ray analysis of a fungal endoglucanase I. J. Mol. Biol. 228, 970−972.

52. Dekker, R.F.H, Wallis, P. (1983) Enzymic saccharification of sugarcane bagasse pretreated by autohydrolysis steam explosion. Biotechnol. Bioeng. 25:3027−3048.

53. Divne A.T. The tree dimensional structure of CBHI Tree dimensional structure of CBH II from Trichoderma reesei from Trichoderma reesei. 1994, Science 265, 524−528.

54. Enari, T.-M., Niku-Paavola, M.-L., Hargu, L., Lappalainen, A. and Nummi, M. Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger P-glucosidase. J. Appl. Biochem., 3, 157, 1981.

55. Eriksson K.E., Ander P., Petterson B. Regulation of lignin degradation in Phanerochaete chrysosporium // Materiuals of the third Int. Conf. Biotechnol. In the Pulp Ind. Stockholm, 1986.-P.24−27.

56. Eriksson K.E., Pettersson B. Extracellular enzyme system utilized by the fungus Sporotrichum pulverulentum for the breakdown of cellulos./ZEurop. J. Biochem., 1975, V. 51,213−218.

57. Fagerstam L.G., Pettersson L. G. The 1,4-beta-glucancellobiohydrolases of Trichoderma reesei QM 9414: a new type of cellulolytic synergism//FEBS Letters, 1980. V. 119. P.97−101.

58. Feng Xu (1997). Effects of Redox Potential and Hydroxyd Ingibition on the pH Activity Profile of Fungal Laccases. J. Biol. Chem. V. 272., N 2., P. 924−928.

59. Feng Xu (1996) Oxydation of Phenols, Anilines, and Benzenethiols by Fungal Laccases: Corelation between Activity and Redox Potentials as Well as Halide Inhibition. Biochemistry, 35, P. 7608−7614.

60. Food and Agriculture Organization of the U.N., 1990;1995 Survey.

61. Forss, K., Jokinen, K., Williamsson, H. Utilization of enzymes for effluents treatment in the pulp and paper industry//Paperi ja puu.- 1989, — Vol. 71, N 10,-P.1108−1112.

62. Gardiol, A. E., R. J. Hernandez, B. Reinhammar H B. R. Harte. (1996). Development an Oxygen of Gas Phase of Use a Biosensor of Blue Contents Copper Oxidase.// Enzym and Microb. Tech. 18:347−352.

63. Ghose T.K., Bisaria V.S. Studies on the mechanism of enzymatic hydrolysis of cellulosic substance.//Biotechnol. Bioeng., 1979, 21, 131−146.

64. Ghose T.K., Sachdev R.K. Kinetics of immobilized p-glucosidase for hydrolysis of cellobiose to glucose.//! Molec. Catal., 1979,6,99−109.

65. Ghose T.K. Measurement of cellulose activities.//Pure and Appl. Chem., 1987, 5, N 2, 257−268.

66. Gong C.-S., Ladisch M.R., Tsao G.T. Cellobias from Trichoderma viride: ?-glucosidase enzyme from Sclerotium rolfsii.//Arch. Biochem. Biophys., 1977, 19, 959−981.

67. Halliwell G. Solubilisation of native and derived forms of cellulose by cell-free microbial enzymes/ZBiochem. J. 1966. V. 100. P.315−320.

68. Halliwel G., Riaz M. The formation of short fibers from native cellulos by components of Trichoderma koningii cellulase//Biochem. J. 1970. V.116. P. 35−42.

69. Hsu T.A., Gong C.-S., Tsao G.T. Kinetic studies of cellodextrins hydrolysis by exocellulas from Trichoderma reesie.//Biotechnol. Bioeng., 1980, 22, 2305−2320.

70. Irwin, D.C., Spesio, M., Walker, L.P., Wilson, D.B. (1993). Activity studies of eight purified cellulases: specificity, synergism and domain effects. Biotechnol. and Bioeng. 42, pp. 1002−1013.

71. Karhunen E., Kantelinen A., Niku-Paavola M.L. Manganese-dependent Peroxydase from the lignin-degrading white rot fungus Phlebia radiata // Arch. Biochem. Biophys.-1990. Vol.279, N1.-P. 25−31.

72. Kaushik V., Bisaria V.S. Ligninases: biosynthesis and application // J. Sci. Res. -1989.-Vol.48, N 6.-P. 276−290.

73. Kersten, P.J., B. Kalyanaraman, K.E. Hammel, B. Reinhammar (1990). Comparison Lignin Peroxidase, Peroxidase a Horseradish and Laccase in Methoxybenzenes Oxidation// Biochem. J. 268:475−480.

74. Khan A.W., Lamb K.A. Use of pretreated lignocellulose for the production of cellulases.//Biotechnol. Lett., 1984, 6, N 12, 663−666.

75. King K. W. Enzymatic degradation of crystallin hydrocellulose/ZBiochem. and Biophys. Res. Communs. 1966. V. 24. N2. P.295−301.

76. Klyosov A.A./Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation/Eds Aubert J.-P., Beguin P., Millet J.L.: Acad. Press, 1988. P. 87−89

77. Klyosov A.A., Rabinovitch M.L.Enzymatic conversion of cellulose to glucose: Present state of the art and potential//Enzyme Engineering Future Direction. N.Y.: Plenum press, 1980, P. 83−165

78. Knowks, J., Lehtovaara, P. Cellulase families and their genes//Trends in Biotechnology. 1992.-V.5, N 9.

79. Ladisch M.R., Lin K.W., Voloch M., Tsao G.T. Process consideration in the enzymatic hydrolysis of biomass.//Enzym. Microb. Technol., 1983, 5, 82−102.

80. Leonowicz, A., Edgehill, R.U., Bollag, J.-M. The effect of pH on the transformation of syringic and vanillic acides by the laceases of Rizoctoniapraticola and Trametes versicolor // Arch. Microbiol.- 1984, — Vol.137, N 2. P. 8996.

81. Liwicki, R., Paterson, A., McDonald, M., Broda, P. Phenotypic classes of phenoloxidas negative mutants of the lignindegrading fungis Phanerocheate chrysosporium // J. Bacterid.- 1985, — Vol. 162, N 2, — P. 641−644.

82. Lund, L.R. (1990) Larg-scale fuel ethanol from lignocellulose: potentials, economics and research priorities. Appl. Biochem. Biotechnol., 24/25, 695−719.

83. Mandels M., Weber V. Production of Cellulases. Jn. Cellulases and their allication. Washington D.C., 1969. P.391.

84. Mandels M., Reese E. T. Fungal cellulase and the microbial decomposition of cellulosic fabric//Devel.Ind. Mycol.1964. V.5. N 1. P. 5−16.

85. Meshartreei M., Saddler J. N. The nature of inhibitory materials present in pretreated lignocellulosic substrate which inhibit the enzymatic hydrolysis of cellulose.//Biotechnol. Lett., 1983, 5, N 8, 531−536.

86. Nisizawa K. Mode of action of cellulases//J. Ferment. Technol., 1973, 51, 267 304.

87. Paszczynski A., Huynh V.-B., Crawford R. Comperison of ligninase-I and peroxydase-M2 from white rot fungus P. chrysosporium // Arch. Biochem. Biophys.- 1986, — Vol.244, N 2, — P.750−765.

88. Perie H., Gold M.H. Manganese regulation of Manganese Peroxydase expression and lignin degradation by the white rot fungus Dichomitus squalens // Appl. Environ. Microbiol.- 1991. Vol.57, N8, — P.2240−2245.

89. Presutti, D.G., Stutzenberger, F.J. (1993) Characterization of Thermomonospora curvata endoglucanas, expressed in E. coli. Journal of Biotechnology, v. 29, pp. 307−320.

90. Puri, V., Mamers, H. (1983) Explosive pretreatment of lignocellulosic residues with high pressure carbon dioxide for the production of fermentation substrates. Biotechnol. Bioeng. 25: 3149−3161.

91. Reese E.T., Siu R.G.T., Levinson H.S. The bilogical degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship ti the mechanism of cellulose hydrolysis //J. Bacterid., 1960, V. 59, 485−497.

92. Reese E.T. Degradation of polymeric carbohydrates of microbial enzymes.//The structure, biosinthesis and degradation of wood. / Ed. F. Loewus. N.Y.: Plenum Press, 1977, 311−367. (Recent Adv. Phytochem.- V. 11).

93. Richard, A., Taylor, John D.(1996) Unceasing steam explosion of pulp: viable alternative for pulp nonwood filament//TAPPI Proceedings, Pulping Conference.

94. Rouvinen, J., Bergfors, T., Teeri, T.T., Knowles, J., Jones, T.A.(1990), Tree dimensional structure of CBHII from Trichoderma reesei. Science 249, 380−386.

95. Rouvinen, J.(1990) PhD Thesis University of Joensuu. Joensuu, Finland, 38 pp.

96. Ruy D.D.Y., Mandels M. Cellulases: biosinthesis and application//Enz. Microb. Technol., 1980, 2, 91−102.

97. Saddler, J.N., Brownell, H.H., Clermont, L.P., Levitan, N. (1982) Enzymatic hydrolysis of cellulos and various pretreated wood fraction. Biotechnol. Bioeng. 24:1389−1402.

98. Salohumo, A., Henrissant, B., Hoffren A.-M., Teleman, O. and Penttila, M. (1994). A novel small endoglucanase gene, egl5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast. Molec. Microbiol. 13: 219−228.

99. Schulein, M.(1997) Enzymatic properties of Cellulases from Humicula Insolens. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Airiculture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany. June, 1997. P. 16.

100. Schultz, T.P., Blerman, C.J., McGinnis, G.D. (1983) Steam explosion of mixed hardwood chips as a biomass pretreatment. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Devel. 22:344−348.

101. Shimizu, K., Sudo, S., Nagasawa, S., Ishikara, M. (1983). Enzymatic hydrolysis of wood. YII. Enzymatic susceptibility of autohydrolyzed woods. Mokuzai Gakkaishi 29:428−437.

102. Sinitsyn, A.P., Clesceri, L.S., and Bungay, H.R. (1982), Appl. Biochem. Biotechnol. 7, 455−458.

103. Sinitsyn A.P., Clesceri L.E., Bungay H.R. Inhibition of cellulases by impurities in steam-exploded wood.// Appl. Biochem. Biotechnol, 1984, 7, N 4,458−461.

104. Sinott, M.Z. (1990). Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90, 1171−1202.

105. Szengyel, Zs., Zacchi, G. Cellulas production: effect of acetic acid and furfural. Abstract of International Conferens on Bioconversion of Sustainable, Africulture for Food, Energy and Industry, Braunshveig, Germany. June, 1997. P. 32.

106. Trigo, C. and Ball, A.S. (1994). Production of extracellular enzymes during the solubilization of straw by Thermomonospora fusca BD25. Applied Microbiology and Biothechnology, 41, pp. 366−372.

107. Vallander, L., Eriksson, K.-E. Enzyme recirculation in saccharification of lignocellulosic materials. Enzyme Microb. Technol., 1987, vol. 9, 7/4 720.

108. Wariishi H., Valli K., Gold M.H. In vitro depolymerization of lignin by Manganese peroxydase of P. chrysosporium // Biochem.Biophys. Res. Commun.-1991, — Vol.176, N1.-P.269−275

109. White A.R., Brown R.M. Enzymatic hydrolysis of cellulos: Visual Characterization of the process/ZProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. V. 78. N 2. P. 1047−1051.

110. Wilson, D.B. Cellulases of Thermomonospora fusca (1988). Methods in Enzymology, v. 160, pp. 314−323.

111. Wood T.M., Mc Crae S. I The cellulas of Trichoderma kiningii: purification and properties of some endoglucanase components with special reference to then-action on cellulose and in synergism with cellobiohydrolase.//Biochem.J., 1978, 171,61−72.

112. Wood T.M., Mc Crae S.I., Wilson C.A., Bhat K.M., Goq L.A. Biochemistry and Genetics of Cellulos Degradation/Eds Aubert J.-P., Beguin P., Millet J. L.: Acad. Press, 1988. P.31−52.

113. Woode T.M. Enzymes and mechanism involved into the solubilization of native cellulose.//Cienc.Biol., 1980, 5, 27−33.

114. Woodward J., Arnold S.L. The inhibition of ?-glucosidase activity in Trichoderma reesei C-30 cellulase by derivatives and isomers of glucose.//Biotechnol. Bioeng., 1981, 23, 1553−1562.

115. Yaropolov, A. I., O. V. Skorobogat’ko, S. S. Vartanov H S. D. Varfolomeyev. (1994) Laccase. Properties, Catalytic Mechanism and Aplicability.//Appl. Biochem. Biotech. 49:257−280.

116. Yu, E.K.C., Levitan, N., Saddler, J.N. (1982) Production of 2,3-butanediol by Klebsialla pneumoniae grown on acid hydrolyzed wood hemicellulose. Biotechnol. lett. 4:741−746.

117. Zouari, N., J.-L. Romette and D. Thomas. (1994). Laccase Electrode for the Determination of Unceasing Flow Phenolic Composition.//Tech. Biotech. 8:503 508.