Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме

Открытие наследуемых по материнской линии мутаций митохондриальной ДНК стимулировало развитие новой области медицинымитохондриальных болезней, которые обусловлены этими мутациями (Luft 1994; Di Mauro et.al. 1980). Их круг очень широк — нейродегенеративные болезни, проявляющиеся в пожилом возрасте, кардиомиопатии, проявляющиеся в детском возрасте, некоторые формы диабета и связанной с ним ретинопатии и другие. Повреждение функций митохондрий является первичной причиной этих заболеваний (Скулачев 2000; Крыжановский 2002; Литвицкий 2002; Рере 2000; Banaclocha 2001; Sugrue, Tatton, 2001; Ward, 2005). Дисфункции митохондрий (MX) и гипоксию относят к типовым патологическим процессам (Лукьянова 1997; 2000; Hansford et al., 1999; Sastre et al., 2000; Cohen, Gold, 2001; Ward, 2005). Но развитие и других патологий во многих случаях также связано с повреждением митохондриальных процессов, которое является вторичным в развитии заболевания.

При нарушении энергообмена, которое клинические цитохимики обозначают термином «митохондриальная недостаточность», в первую очередь функционально страдают нервная и мышечные системы, в том числе гладкие мышцы т. к. они требуют высокого энергообеспечения, что делает эти ткани уязвимыми к митохондриальной дисфункции. Эти MX болезни называют митохондриальными энцефаломиопатиями, в случаях преимущественного нарушения функций мозга и кардиопатиями в случае преимущественного нарушения сердца (Сухоруков и др. 1997; 2003).

Для лечения вторичных, и даже для первичных митохондриальных болезней разработан новый класс медицинских препаратов — регуляторов энергетического обмена, направленных на поддержание функций митохондрий, а лекарственные препараты составляют современный раздел здравоохранения — «митохондриальную медицину» .

Широко используются такие метаболиты митохондрий как коэнзим Q, витамины — Bi, В2, Вб, липоевая кислота, кокарбоксилаза, цитохром с и другие.

В отечественных исследованиях, начиная с 60 — годов, развивиается новое направление посвященное изучению регуляции физиологического состояния организма янтарной кислотой, как физиологически активным веществом и лечебным средством. Огромная заслуга в этом принадлежит М. Н. Кондрашовой и ее школе (Кондрашова 1968; 1972; 1973). В России разработаны и уже длительное время используются стимулирующие биологически активные добавки к пище, содержащие ЯНТ, а также некоторые лекарства (Кондрашова и др. 1976; 1997; 2002; 2006; Хазанов и др. 2002 -2006). Эффективность ЯНТ обусловливается и тем, что нормализация энергетических процессов в митохондриях устраняет нарушения в усвояемости кальция (Kondrashova 1982), а также катионов калия (Саакян 1998), что обеспечивает их участие в метаболизме даже более эффективно, чем введение в условиях ослабленной усвояемости.

В клинических исследованиях цитохимическое определение активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению тетразолиевых красителей является информативным показателем уровня метаболизма в организме. (Нарциссов 1969, Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005). Клиническая цитохимия рассматривает клетку как самостоятельный орган со всеми свойствами целого организма, что в полной мере относится к лимфоцитам периферической крови. Лимфоциты рассматриваются не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма и процесс его развития. Биохимические методы определения СДГ не применяются по причине невозможности широкого взятия тканей для выделения митохондрий. Но они имеют и другой очевидный, но привычный и потому не учитываемый недостаток. Он состоит в нарушении важнейшего с точки зрения биофизики свойства живых тканей — их структурной и ультраструктурной организации в частности, и митохондрий в клетке при их выделении. При этом разрушается паракристаллический комплекс ферментов матрикса — метаболой и теряются физические механизмы регуляции ферментов (Shrere 1985; Fahient 1988;

Любарев и Курганов 1987; 1989). Недостаточно оцененным преимуществом цитохимического метода является сохранение структурной организации в мазке. Его можно рассматривать как иммобилизацию ферментов на подложке в клеточной среде, которая стабилизирует даже выделенные ферменты на длительное время (Вудворд 1988). Однако, несмотря на то, что цитохимический метод является информативным и широко используемым более 50 лет Кондрашова М. Н. обратила внимание на наличие весьма существенных недостатков в составе реактивов. Их набор остался в основном неизменным с времен классических работ и не соответствует современным биохимическим условиям работы с митохондриями.

На основании вышеописанного был разработан новый цитобиохимический метод определения СДГ в лимфоцитах крови, сочетающий преимущества биохимических и цитохимических методов и исключающий их недостатки. Нами проведена значительная часть этих исследований, а также получены результаты исследования состояния условно здоровых добровольцев и пациентов с пищевой аллергией. Эти исследования вошли в патент.

Данное изобретение значительно повышает чувствительность измерения активности СДГ вне организма, в лимфоцитах к изменениям состояния в организме, обусловленным адренэргической регуляцией. Это осуществляется путем приближения состава сред к биохимическим условиям. При этом необходимо использовать весь комплекс разработанных изменений состава сред, поскольку частичная замена мало эффективна. Кроме того, были введены дополнительные определения окисления и действия ЯНТ в митохондриях. На основании этих определений Кондрашовой М. Н. предложен более точный способ расчета активности СДГ лимфоцитов, который коррелирует с адренэргической регуляцией. Предложенные измерения впервые характеризуют действие ЯНТ в митохондриях не по одному показателю, а по специфическому паттерну (узору) характеристик. Установлено, что существуют несколько типов паттернов у здоровых животных или людей. Они служат чувствительной индивидуальной характеристикой. При усилении действия адреналина в организме наблюдается возрастание амплитуды изменений паттернов с прохождением четко выявляемых стадий: активации, гиперактивации, ингибирования. Для реализации разработанного метода создан стандартный набор сухих реактивов высокой чистоты, позволяющий унифицировать измерения в разных лабораториях.

Метод использует традиционную для Института Биофизики современную компьютеризованную видеомикроскопию, что обеспечивает автоматизацию обработки изображений: объективность измерения, необходимый для статистической репрезентативности объем выборки.

Целью работы было — разработка метода определения активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови более чувствительного, чем традиционные цитохимические методы, к уровню адренэргической регуляции в организме, благодаря максимально возможному сохранению структурной организации митохондрий и иммобилизованной СДГ в измеряемом препарате. Использование разработанного метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения. Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные условия состава среды инкубации (величину рН, влияние ЭДТА, ИЗЛ, набор дополнительных показателей восстановления НСТ) для выявления функциональной активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови.

2. Измерить активность СДГ лимфоцитов в разработанных условиях при разной степени выраженности адренергической регуляции у крыс (гиперактивные новорожденные крысята, сравнительно с показателями взрослых животных интактных — в покое и при активации адреналином).

3. Исследовать воздействие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора Curator Professional на взаимодействие ЯНТ с митохондриями в лимфоцитах крыс.

4. Определить для группы здоровых добровольцев цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

5. Определить у пациентов (с пищевой аллергией и гипертонией) цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями и сопоставить с их функциональным состоянием.

6. Участвовать в создании набора реактивов для стандартизации результатов, получаемых в разных лабораториях при определении активности СДГ и других характеристик действия ЯНТ в митохондриях — на лимфоцитах в мазке крови и в патентовании разработанного способа.

Научная новизна работы.

Разработка метода повысила информативность существующих на сегодняшний день и ставших классическими цитохимических методов (Nachlas et. al.1957, Пирс 1962) и различных его модификаций (Quaglino 1960; Нарциссов 1969; Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005) определения активности СДГ в лимфоцитах (СДГЛФ), за счет изменения состава сред, приближенной к внутриклеточной, применения физиологических подходов исследования и проведения дополнительных измерений с нескольких показателей восстановления НСТ, определяющих не только активность СДГЛФ, но и функциональное состояние СДГ по специфическому паттерну — узору характеристик. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

Впервые у новорожденных крысят выявили гиперактивацию СДГЛФ, по сравнению с взрослыми животными в покое и даже при физиологической активации адреналином.

Впервые показано благоприятное действие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора «Curator — professional», на активность СДГЛФ.

Впервые в группе условно здоровых добровольцев выявлены четыре типа цитобиохимических паттернов взаимодействия ЯНТ с митохондриями, связанных с разным функциональным состоянием СДГ.

Впервые у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией выявлены четыре разные типы цитобиохимических паттернов, свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГ, отличающихся от здоровых людей утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ.

Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить более чувствительным показателем, чем измерение АД для выявления, развития и эффективности лечения гипертонии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Работа посвящена разработке метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения, поэтому в обзоре литературы будет рассмотрено два вопроса:

• роль янтарной кислоты в энергообеспечении.

• анализ традиционных методов исследования митохондриальных функций. Сначала будут рассмотрены вопросы о роли ЯНТ как доминирующего субстрата цикла трикарбоновых кислот при физиологической активацииздесь речь пойдет о взаимодействии между двумя субстратами ЯНТ и КГЛ и катехоламинами адреналином и ацетилхолином (субстратно — гормональные взаимодействия), связывающие метаболизм тканей с симпатической и парасимпатической нервной регуляцией, о сигнальной роли ЯНТ в организме. Будет также рассмотрен вопрос о моделях исследования разных уровней адренергической регуляции (стресс Селье, физиологическая активация малыми дозами адреналина и ЯНТ, гиперактивация у новорожденных, сравнительно со взрослыми. Затем будут рассмотрены методы оценки функциональной активности MX, проанализированы их достоинства и недостатки (гистохимический, биохимический, цитохимический) и важность сохранения структурной организации митохондриальной — ретикулярной сети в исследуемых препаратах. Также будут проанализированы существующие аналоги метода определения СДГЛФ периферической крови по восстановлению тетразолиевых красителей.

Выводы.

1. Исследована возможность повышения чувствительности традиционного цитохимического метода определения активности СДГЛФ по восстановлению НСТ на мазке к ее изменениям в организме за счет: способа расчета, изменения состава сред, приближенных к внутриклеточным, проведения дополнительных измерений нескольких показателей: эндогенными субстратами, ингибитором активности СДГ малонатом, миллимолярной концентрацией ЯНТ с ИЗЛ. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

2. Экспериментально обоснованы следующие модификации: поддержание рН 7,2 ± 0,05, характерной для внутри митохондриальной среды вместо 7,4 и исключение хелатора кальция ЭДТА.

3. Обнаружено двойное регуляторное действие ИЗЛ на активность СДГЛФзначительное снижение гиперактивации и более сильное, чем было известно, устранение ингибирования. Ее добавление позволяет впервые определить не только активность, но и функциональное состояние СДГ.

4. Для новорожденных крысят с естественной гиперактивацией адренэргической регуляции характерна и гиперактивация СДГ по сравнению со взрослыми не только в покое, но и при введении адреналина.

В ходе иммобилизационного стресса крыс, происходит ярко выраженный переход от гиперактивации СДГ к ее ингибированию, особенно отчетливо выявляемый по смене регуляторного действия ИЗЛ от снижения гиперактивности к уменьшению ингибирования.

5. Впервые на группах животных выявлено регуляторное действие прибора лазерной терапии Curator Professional с модулированной частотой 101 Гц на основной процесс энергообеспечения в митохондриях за счет окисления ЯНТ.

6. У здоровых людей обнаружено 4 типа цитобиохимических паттернов свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФглубокого покоя, оперативного покоя, активации, активации с ингибированием, включая неизвестное ранее латентное состояние.

7. У пациентов с пищевой аллергией с гипертонией выявлены 4 типа цитобиохимических паттернов: условный покой, гиперактивация и гиперактивация с ингибированием, ингибирование, которые отличаются от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ. Развитие гиперактивации СДГ коррелирует с нарастанием артериального давления. Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить показателем развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления.

8. Проведенное исследование подтверждает и усиливает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГ как показателя состояния организма.

Научно — практическая значимость.

1. Разработанный метод соответствует запросам новых областей медицины-«Митохондриальных болезней» и «Митохондриальной медицины», учитывающих ведущую роль первичных и вторичных повреждений митохондрий в развитии и лечении заболеваний. Он является прямым показателем активности наиболее мощного процесса энергообеспечения в митохондриях — окисления ЯНТ и может служить для диагностики и контроля лечения.

2. Как другие функциональные показатели, этот метод должен быть стандартизован. Учитывая высокую чувствительность цитохимического определения к качеству реактивов, для получения стандартных результатов с нашим участием разработан и запатентован стандартный набор реактивов биохимической квалификации.

3. На основании определения уровня реактивности организма с помощью описанного метода возможно подбирать индивидуальную дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выраженно нормализующего начальные патологические сдвиги — гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокиеактивировать ингибированную СДГ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В проведенной работе осуществлена разработка принципиально нового метода определения активности СДГЛФ в митохондриях на основании сочетания преимуществ цитохимического и биохимического методов и исключения их недостатков. Поэтому метод назван цито-БИО-химическим. Он использует восстановление НСТ для определения взаимодействия ЯНТ с митохондриями. Подобно цитохимическим аналогам метод сохраняет структурную организацию митохондрий в клетке благодаря иммобилизации исследуемых клеток — лимфоцитов в мазке крови на стекле. Это представляет значительное преимущество перед биохимическими методами, которые традиционно связаны с сильным разрушением структуры воздействием сахарозы, холода и центрифугирования. С другой стороны, состав среды проведения реакции в биохимических исследованиях значительно более физиологичен. Разработка физиологической среды для цитохимического исследования значительно повышает его чувствительность к изменению физиологического состояния в организме. Важным усовершенствованием определения СДГЛФ разработанным методом является возможность определения дополнительных показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями — участие в окислении эндогенной ЯНТ, выявление регуляции СДГЛФ. Кроме того, на базе этих определений нами предложено более корректное определение величины активности СДГЛФ с учетом показателей пробы без добавления ЯНТ. Таким образом, вместо определения общей активности препарата по восстановлению НСТ по предложенному способу более точно определяется вклад СДГ. Поэтому мы обозначили используемый обычно показатель как «общую» активность СДГ, а более точно определенную как «истинную».

Исследовано применение этого метода для выявления различия физиологического состояния крысы и человека. В результате разработанных усовершенствований впервые выявлен набор состояний СДГЛФ при разных уровнях адренэргической регуляции крысы и человека. Он характеризуется не только единственным показателем — активностью СДГЛФ, определенной к тому же не в оптимальных условиях, а набором нескольких показателейпаттерном или узором. Эти паттерны представляют собой закономерное соотношение нескольких показателей и встречаются среди обследованных неоднократно. По этому признаку можно выделить несколько подгрупп, характерных и для крысы, и для человека. Они перечислены ниже в порядке от покоя для нормы к активности или патологии.

1. Глубокий покой. Латентная («Спящая») СДГЛФ.

2. Оперативный покой. Латентная («Спящая») СДГЛФ.

3. Активация. Небольшая активация СДГЛФ.

4.. Гиперактивация. Выраженная активация СДГЛФ. Впервые показано, что ИЗЛ снижает гиперактивность.

5.. Гиперактивация, сдерживаемая ингибированием меньшей или большей степени. Ингибирование выявляется по активации ИЗЛ. Активирующее действие ИЗЛ значительно сильнее, чем наблюдалось ранее.

Состояние полного отсутствия активности СДГЛФ, несмотря на добавление ЯНТ выявлено впервые благодаря тому, что комплексом условий работы с животным и препаратом нам удается сохранить состояние отключения фермента без активации адреналином. Это состояние не является ингибированным, на что показывает отсутствие эффекта активаторов. Оно представляет собой еще не активированное, латентное состояние фермента. Заключения о состоянии СДГЛФ сделано на основании учета дополнительных предложенных нами показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

Новым показателем является выявление двойного регуляторного (гомеостазирующего) действия ИЗЛ — снижение гиперактивации и уменьшение ингибирования.

Таким образом, впервые можно выявить несколько уровней активности СДГЛФ при разных состояниях организма. Эти уровни отражают различное функциональное состояние фермента. Полученный результат впервые позволяет предложить биохимическую основу физиологического феномена, выразительно определенного А. А. Ухтомским как «послойное вовлечение живого субстрата в деятельность». Это явление показывает, что при нарастании степени (дозы) воздействия все большая часть ткани переходит из состояния покоя в возбуждение. При этом величина внешнего ответа может не отличаться, но на поддержание его тратятся разные усилия. Большие внутренние траты и обусловливают развитие напряжения при совершении внешне одной и той же работы. Эта же закономерность лежит в основе явления разных уровней (или этажей) адаптационных реакций, которые обнаружены JI.X. Гаркави. Она привлекает внимание к тому, что если внешне сходный ответ вызывается только повышенной дозой адреналина или других активаторов, это свидетельствует о более глубоком отклонении состояния организма от нормы к патологии. Такие состояния соответствуют нашим показателям при развитии ингибирования СДГЛФ.

На основании определения уровня реактивности можно подбирать дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выражено нормализующего начальные патологические сдвиги — гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокие — активировать ингибированную СДГЛФ.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГЛФ, как показателя состояния организма. Разработанные нами показатели значительно повышают чувствительность этого теста.

На современном этапе участию митохондрий в поддержании физиологического состояния организма и развитии болезней придается ключевое значение. Выделены новые области медицины — митохондриальные болезни и митохондриальная медицина. Как и другие области медицины, они должны иметь свои стандартные показатели. Разработанные нами подходы предлагают создание стандартизованного набора реактивов для определения показателей взаимодействия митохондрий с ЯНТ. При таких условиях можно получать универсальные характеристики физиологического состояния организма, отражающие функциональное состояние наиболее мощного фермента энергообеспечения СДГ.